تنوع ژنتیکی گروه‌های آللی HLA-B*35 و HLA-B*51 در قومیت‌های ایران فاطمه یاری1، امیر تیمورپور2، مریم زمان وزیری3، فاطمه صباغی4، نادیا باقری5، فرزانه مرتضی‌پور برفی6 چکیده سابقه و هدف مقایسه تنوع ژنتیکی مولکول‌های HLA در اقوام مختلف ایران، می‌تواند در ارائه راه‌کار مناسب برای تأمین اهداکنندگان سلول‌های بنیادی خونساز جهت بیماران ایرانی کمک‌کننده باشد. هدف، مطالعه مقایسه دو گروه آللی شایع در ایران شامل HLA-B*35 و HLA-B*51، دراقوام ایرانی بود. مواد و روش‌ها در این مطالعه توصیفی، تعیین آلل‌هایHLA-B در وضوح پایین باروشPCR-SSP صورت پذیرفت. اطلاعات قومیتی و HLA از قومیت‌های عرب (370 n=)، گیلک (510 n=)، لر (465 n=) و کرد (719 n=) جمع‌آوری و تجزیه و تحلیل گردیده و ارتباط آلل و نژاد، بررسی و با آزمون آماری کای‌دو، رابطه معنادار بین فراوانی آلل‌ها ارزیابی شد. یافته‌ها فراوانی HLA-B*35 در اقوام لر، گیلک، عرب و کرد به ترتیب عبارت بود از: 22/20، 75/22، 35/11 و 61/19 و به همین ترتیب برای HLA-B*51 ، فراوانی عبارت بود از 28/18، 31/9، 32/9 و 52/17. فراوانی‌های به دست آمده در جمعیت کلی ایران در این مطالعه عبارت بود از 19% برای HLA-B*35 و 2/14% برای HLA-B*51 . داده‌ها بـرای دو گـروه آللی ذکـر شـده در اقوام مورد مطالعه، تفاوت معنادار نشان دادند (05/0 p<). نتیجه گیری هر چند HLA-B*35 و HLA-B*51 ، در جمعیت کلی و هم در قومیت‌های بررسی شده، بیشترین فراوانی را در جایگاه ژنی HLA-B به خود اختصاص دادند ولی اختلاف آن‌ها در قومیت‌ها معنادار بود. این مطالعه، نشان‌دهنده تنوع ژنتیکی بالای HLA-B در اقوام مورد مطالعه بوده و می‌تواند در ارائه راه‌کار برای جستجوی اهداکننده مناسب جهت بیماران از اقوام مختلف کمک‌کننده باشد. کلمات کلیدی: قومیت، ایران،HLA-B51 ،HLA-B35 تاریخ دریافت: 18/06/1403 تاریخ پذیرش: 08/07/1403
1- نویسنده مسئول: PhD ایمونولوژی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665 2- PhD آمار زیستی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 3- کارشناس ارشد ایمونولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 4- کارشناس ارشد هماتولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 5- دانشجوی دکترای هماتولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون‌ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون‌ـ تهران‌ـ ایران 6- کارشناس ارشد میکروبیولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه آنتیژنهای HLA (Human Leukocyte Antigens) کلاس I و II ، آنتیژنهای سازگاری بافتی و گلیکوپروتئین‌های سطح سلولی هستند که بیشترین تنوع ژنتیکی را در انسان دارا می‌باشند. ژن‌های HLA-A ، HLA-B و HLA-C به ترتیب آنتیژنهای کلاس I مربوطه A ، B و C را رمزدهی می‌کنند. ژن‌های HLA-DRB ، HLA-DQA1 ، HLA-DQB1 و HLA-DPA1 ، HLA-DPB1 به ترتیب آنتیژنهای کلاس II مربوطه را رمزدهی می‌کنند (1). آلل‌های جدید HLA همواره در حال کشف و شناسایی هستند، به طوری که تاکنون تعداد 39627آلل HLA شناسایی شده‌اند(2). عدم مشابهت در سیستم HLA ، سد مهمی برای انجام موفقیت‌‌آمیز پیوند سلول‌های بنیادی خونساز (HSCT) محسوب می‌شود. به رغم آماده‌‌سازی بیماران (پیش از پیوند) با داروهای سرکوب سیستم ایمنی، درجاتی از رد پیوند یا GVHD، مشکل معمول گیرندگان سلول‌های بنیادی آلوژن محسوب می‌شود. در حالی که مشابهت و سازگاری HLA بین دهنده و گیرنده برای پذیرش پیوند و کاهش خطر GVHD ضروری است. HSCT به طور فزاینده‌ای به عنوان درمان رایج اختلالات خونی شدید استفاده می‌شود (1). در دهه گذشته تقاضا برای این نوع پیوند به عنوان یک گزینه درمانی مؤثر برای بسیاری از بدخیمی‌ها، افزایش یافته است. در حالی که خواهر و برادر سازگار از لحاظ HLA ، ارجح‌ترین دهنده جهت پیوند می‌باشند، با توجه به شانس تشابه ژنتیکی فرزندان در یک خانواده و با توجه به کوچک شدن خانواده‌ها در بسیاری جوامع، بیش از 70 درصد بیماران نیازمند پیوند HSCT نمی‌توانند اهداکننده‌ای با HLA سازگار را در بین افراد خانواده خود یافته و نیازمند دریافت پیوند از اهداکننده داوطلب غیرخویشاوند و سازگار ثبت نام شده در مراکز پذیره‌نویسی سلول‌های بنیادی می‌باشند (4، 3). هدف این مراکز فراهم‌آوری داوطلب غیر خویشاوند با HLA سازگار برای بیماران هماتولوژیک در انتظار پیوند فاقد اهداکننده خویشاوند مناسـب جهـت فـراهم آوردن احتمـال بـالای پیونـد موفق می‌باشد. سایز و ترکیب ژنتیکی یک مرکز پذیره‌نویسی، تعیین‌کننده نسبت بیمارانی است که در آن قادر به یافتن اهداکننده مناسب سازگار باشند (5). این در حالی است که پذیرش اهداکنندگان بیشتر و گسترش یک رجیستری، به علت نیاز به گروه‌بندی HLA عمدتاً منجر به افزایش چشمگیر هزینه‌ها و صرف منابع بیشتر می‌گردد. فرآیند تعیین پلی‌مورفیسم ژن‌های HLA کلاس I و کلاس II برای ارزیابی سازگاری دهنده و گیرنده پیوند و تحقیقات مرتبط با بیماری‌ها مورد نیاز است. به علاوه، پیش‌بینی هاپلوتیپ‌های HLA از اطلاعات ژنوتیپ HLA میسر می‌شود. زمانی که اهداکنندگان سلول بنیادی سازگار در دسترس نباشند، در مورد بیماران با خطر بالای سرطان‌های خونی، پیوند سلول بنیادی نیمه همسان (haploidentical) در نظر گرفته می‌شود (1). تعیین آلل‌های HLA علاوه بر پیوند، کاربردهای مختلفی مانند بررسی ارتباط ژنتیکی جمعیت‌ها، بررسی ارتباط با بیماری‌ها مانند بیماری‌های خود ایمن و عفونی دارد (7، 6، 1). بـر اسـاس مطالعـه‌های انجام شده، در جایگاه ژنی HLA-B ، دو گروه آللی HLA-B*35 وHLA-B*51، آلل‌های شایع در جمعیت‌های مختلف ایران محسوب شده و بیشترین فراوانی را به خود اختصاص می‌دهند (11-8). تنوع ژنتیکی مولکول‌های HLA با عرضه آنتی‌ژنی توسط این مولکول‌ها و نحوه رویارویی بدن با عوامل عفونی، مولکول‌های واکسن و یا بافت پیوندی در ارتباط می‌باشد (1). این مطالعه برروی داوطلبان اهدای سلول‌های بنیادی خونساز از قومیت‌های گیلک، لر، کرد و عرب ثبت نام شدهدر مرکز ملی پذیره‌نویسی سلول‌های بنیادی خونساز ایران صورت گرفت تا برای شناسایی تنوع ژنتیکی HLA به کار رود. اطلاعات مربوط به فراوانی دو گروه آللی HLA-B*35 وHLA-B*51 مربوط به لکوس ژنی HLA-B در قومیت‌های مختلف به عنوان آلل‌های با فراوانی بالا مورد استفاده قرار گرفتند تا بتوان از آن در بررسی تنوع ژنتیکی آلل‌های HLA در جمعیت‌های مختلف ایران استفاده نمود. مواد و روش‌ها در این مطالعه توصیفی، از 2064 نمونه خون مربوط به داوطلبان اهدای سلول‌های بنیادی خونساز از قومیت‌های گیلک (510 n=)، لر (465 n=)، کرد (719 n=) و عرب (370 n=) که در مرکز ملی پذیره‌نویسی سلول‌های بنیادی خونساز ایران ثبت نام کرده بودند، نمونه خون در ماده ضد انعقاد EDTA جمع‌آوری شده و بافی‌کوت آن‌ها جهت جداسازی DNA مورد استفاده قرار گرفت. جمع‌آوری نمونه‌ها از استان‌های سراسر کشور انجام شد. انتقال نمونه‌ها در دمای 10-2 درجه سانتی‌گراد انجام شد. از نمونه‌های خون تهیه شده، DNA به دست آمده و سپس آزمایش‌های HLA-typing با وضوح پایین بر روی آن‌ها انجام شد. استخراج DNA به روش بید مغناطیسی با استفاده از کیت استخراج DNA (MagCore Automated Nucleic Acid Extractor ، سوئیس) با استفاده از ابزار اتوماتیک استخراج انجام شد. کیفیت و غلظت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ تعیین شد. در ادامه DNA بارکدگذاری شده و در فریزر 70- درجه سانتی‌گراد تا زمان انجام PCR ذخیره شد. روش SSP-PCR نیاز به انجام چندین واکنش PCR دارد که در آن یک یا چند واکنش برای یک آلل خاص انجام می‌شود. برای هر نمونه یک کیت استفاده شد و هر کیت تعیین HLA-ABDR واجد 96 واکنش PCR بود که در هر یک، آغازگرهای ویژه توالی مربوط به HLA و هم‌چنین آغازگرهای یک ژن کنترل داخلی (هورمون رشد) استفاده شد. در این مطالعه، کیت‌های HLA-typing از شرکت‌های Olerup (کشور سوئد) و Innotrain (کشور آلمان) تهیه و استفاده شد. هر کیت حاوی 24 واکنش جهت تعیین HLA-A ، 48 واکنش جهت تعیین HLA-B و 24 واکنش جهت تعیین HLA-DRB1 بود. برنامه PCR که توسط کمپانی Olerup برای کار با کیت تعیین شده و استفاده شد، عبارت بود از: 1 چرخه 94 درجه سانتی گراد برای 2 دقیقه، 10 چرخه شامل 94 درجه سانتی‌گراد برای 10 ثانیه و 65 درجه برای 1 دقیقه،20 چرخه شامل 94 درجه سانتی‌گراد برای 10 ثانیه، 61 درجه سانتی‌گراد برای 50 ثانیه و 72 درجه سانتی‌گراد برای 30 ثانیه و بالاخره مرحله طویل سازی: 72 درجه سانتی‌گراد برای 10 دقیقه. پس از انجام الکتروفورز بر روی ژل آگارز، آلل‌های تکثیر شده با به کارگیری ژل رد (شرکت Olerup کشور سوئد)، مستقیماً قابل مشاهده شدند تصویر الکتروفورز، توسط 2 کارشناس مستقل مشاهده و در صورت برخورداری از کیفیت مناسب، باندها مورد شمارش و تفسیر (به صورت دستی و نرم‌افزاری) قرار گرفت. نرم‌افزار توسط کمپانی تأمین‌کننده کیت، ارائه شده و در دسترس بود. برای تحلیل آماری و بررسی ارتباط بین قومیت و فراوانی آلل در جمعیت مورد مطالعه، از آزمون مجذور کای و در صورت نیاز از آزمون دقیق فیشر استفاده شد. باقی‌مانده‌های استاندارد شده به منظور تشخیص افزایش یا کاهش معنادار در فراوانی مشاهده شده آلل در مقایسه با فراوانی مورد انتظار تحت فرض استقلال گزارش شد (فرضیه صفر). مقادیر باقی‌مانده‌های استاندارد شده مشخص می‌کنند که فراوانی مشاهده شده در کدام خانه از جدول فراوانی به صورت معناداری بالاتر یا پایین می‌باشد، به بیان دقیق‌تر در سطح معناداری 05/0 اگر قدر مطلق مقادیر باقی‌مانده استاندارد شده از مقدار 96/1 بیشتر باشد، آن گاه در خانه متناظر با آن مقدار باقی‌مانده استاندارد شده به صورت معناداری بالاتر (علامت مثبت) و یا پایین‌تر (علامت منفی) است. در این مطالعه کلیه تجزیه و تحلیل آماری با نرم‌افزار R-4.2.0 انجام شد. یافته‌ها فراوانی آللی در قوم عرب، برای HLA-B*35 ، 35/11 درصد و HLA-B*51 ، 32/9 درصد به دست آمد. فراوانی‌های به دست آمده برای جمعیت کلی ایران که در مطالعه حاضر به دست آمد، 19% برای HLA-B*35 و 2/14% برای HLA-B*51 ، بود. به علاوه، رابطه معناداری بین آلل HLA-B*35 در میان اقوام ایرانی مشاهده شد (جدول 1) (001/0 p<). به طوری که فراوانی این آلل در گیلانی‌ها به صورت معناداری بالاتر بوده در حالی که در میان عرب‌ها به صورت معنادار پایین‌تر بوده است ولی در میان کردها و لرها رابطه‌ای مشاهده نشد. همین طور، در ارتباط با آلل HLA-B*51 نیز رابطه معناداری مشاهده شد.
به طوری که فراوانی این آلل در میان لرها و کردها به صورت معناداری بالاتر ولی در میان گیلانی‌ها و عرب‌ها به صورت معنادار پایین‌تر بوده است (جدول 1) (001/0 p<). به منظور تفسیر نتایج تجزیه و تحلیل داده‌ها، ابتدا باید به مقدار احتمال گزارش شده در جداول اشاره کرد، در این مورد 05/0 p< نشان‌دهنده وجود رابطه معنادار و 05/0 p> نشان‌دهنده عدم وجود رابطه معنادار بین دو متغیر است (13، 12). اطلاعات دموگرافیک مربوط به اهداکنندگان این مطالعه قبلاً ارائه شده است (12). بحث سیستم HLA مجموعه‌ای از ژن‌هایی پیچیده و دارای تنوع ژنتیکی بالایی است که در تمامی جنبه‌های پاسخ ایمنی نقش دارند. در این مطالعه در 4 قومیت لر، گیلک، کرد و عرب ایران اقدام به بررسی و تعیین تنوع ژنتیکی در آلل‌هایی از لکوس ژنی HLA-B شد که در ایران فراوانی بالایی (HLA-B*35 و HLA-B*51) دارند. نتایج نشان داد که توزیع دو آلل HLA-B*35 و HLA-B*51 که در مقایسه با سایر گروه‌های آللی، فراوانی بالاتری در ایران دارند، در اقوام مورد مطالعه متفاوت است به نحوی که اختلاف آماری معناداری با یکدیگر نشان می‌دهند (05/0 p<). در سال‌های گذشته، فراوانی HLA-B*35 و HLA-B*51 در جمعیت ایران بررسی شده و نتایج مشابه با جمعیت کلی این مطالعه نشان داده شده است (14). عابدینی و همکاران در یک مطالعه مرور سیستماتیک و متاآنالیز، فراوانی 18% را برای HLA-B*35 و 2/14% را برای HLA-B*51 اعلام نمودند که با نتیجه این مطالعه (19% برای HLA-B*35 و 2/14% برای HLA-B*51)، کاملاً هم‌خوانی دارد (11). نتایج جدول 1 نشان‌دهنده بیان پایین‌تر هر دو گروه آللی مورد مطالعه در قوم عرب می‌باشد. به نحوی که کاهش معنادار در فراوانی این دو آلل در قوم عرب در
مقایسه با سایر اقوام مورد مطالعه ایران نشان داده شد. به علاوه، کاهش معنادار بیان HLA-B*51 در جمعیت گیلک و افزایش معنادار آن در جمعیت‌های کرد و لر مطابق جدول 1 مشهود است. مقایسه نتایج به دست آمده در این مطالعه برای قوم عرب، با مطالعه حاجج و همکاران مربوط به اقوام عرب از کشورهای دیگر، بیانگر شباهت نتایج فراوانی هر دو آلل مورد مطالعه، در قومیت عرب ایران با نتایج گزارش شده برای اعراب لیبی با فراوانی 1/10% برای HLA-B*35 و 1/11% برای HLA-B*51 می‌باشد (15). شباهت در گروه‌های آللی HLA ، می‌تواند بیانگر ارتباط ژنتیکی جمعیت‌ها در نقاط مختلف باشد. آنتیژنهای HLA به عنوان نشانگرهای رابطه ژنتیکی در میان جمعیت‌ها و ابزار مولکولی مفید برای انسان‌شناسان در نظر گرفته می‌شوند (9، 6، 5). می‌توان با تجزیه و تحلیل مولکولی پلی‌مورفیسم و تنوع ژنتیکی جایگاه‌های ژنی HLA در اقوام ایرانی، رابطه ژنتیکی را در میان زیر جمعیت‌های ایرانی و همین طور رابطه ژنتیکی ایرانیان با اقوام آسیایی و اروپایی بررسی و ارتباط نزیک آنان را نشان داد. از نقطه نظر بررسی آللی روی قوم گیلک، عرب و همکاران در سال 2019، در مطالعه‌ای روی 88 اهداکننده از قومیت گیلک و بررسی آللی آن‌ها، به این نتیجه رسیدند که علی‌رغم برخی اختلافات، از نظر تنوع آللی ارتباط قوی بین قوم گیلک و سایر اقوام ایرانی و همین طور جمعیت قفقازی وجود دارد (16). در مطالعه آن‌ها، ارتباط آللی قومیت‌ها از نظر آلل‌های با فراوانی بالا و آلل‌های با فراوانی پایین، هر دو مشاهده شد. آن‌ها فراوانی 7/26% را برای HLA-B*35 در قوم گیلک بیان نمودند که با فراوانی ارائه شده برای قوم گیلک در این مطالعه (75/22)، هم‌خوانی دارد. مطابق جدول 1، افزایش معنادار فراوانی HLA-B*35 در قوم گیلک در مقایسه با 3 قومیت دیگر این مطالعه ملاحظه می‌گردد. دکتر شایگان و همکاران نیز اختلاف در فراوانی برخی از گروه‌های آللی را در بین اقوام ایرانی دیگر بیان نمودند از جمله، تفاوت معنادار در فراوانی HLA-B*51 بین اقوام فارس و کرد ایران (10). همین طور دکتر فرجادیان با تجزیه و تحلیل مولکولی پلی‌مورفیسم ژن HLA کلاس II در 816 نمونه DNA از 11 قوم ایرانی، علاوه بر بررسی رابطه ژنتیکی ایرانیان و اقوام آسیایی و اروپایی، این رابطه ژنتیکی را در میان زیر جمعیت‌های ایرانی نیز بررسی و ارتباط نزدیک آنان را نشان داد (6). از نتایـج مطالعـه حاضـر و مقایسه آن با سایر مطالعه‌ها می‌توان به خوبی به تنوع ژنتیکی گروه‌های آللی HLA در جمعیت‌های مختلف ایران پی برد به گونه‌ای که حتی تنوع ژنتیکی در آلل‌هایی که توزیع بالایی در جمعیت‌های مختلف کشور دارند، وجود دارد. نتیجه‌گیری شناسایی فراوانی آلل‌های HLA در قومیت‌های مختلف، می‌تواند شباهت‌ها و تفاوت‌ها در گروه‌های آللی را در آن‌ها مشخص نماید. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که در رابطه با آلل‌های با وفور بالای HLA نیز در بین قومیت‌های مورد مطالعه تفاوت‌های معنادار وجود دارد. شناخت شباهت‌ها و تفاوت‌ها در رابطه با آلل‌های HLA در قومیت‌های مختلف ایران، می‌تواند بیانگر میزان قرابت ژنتیکی آن‌ها بوده و می‌توان از آن در برنامه‌ریزی‌های آتی در مقوله‌هایی مانند پیوند، واکسیناسیون و بیماری‌ها استفاده نمود. حمایت مالی این مطالعه با حمایت مالی سازمان انتقال خون ایران و معاونت تحقیقات و فناوری وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی انجام شده است. ملاحظات اخلاقی این مطالعه، با کد اخلاق IR.TMI.REC.1397.026 اخذ شده در مؤسسه عالی آموزشـی و پژوهشی طب انتقال خون می‌باشد. عدم تعارض منافع نویسندگان اظهار می‌کنند هیچ‌گونه تعارض منافعی در این مطالعه وجود نداشته است. نقش نویسندگان دکتر فاطمه یاری: طراحی مطالعه، نگارش و ویرایش مقاله دکتر امیر تیمورپور: تجزیه و تحلیل آماری نادیا باقری: جمع‌آوری داده‌ها و تفسیر آزمایش‌ها مریم زمان وزیری، فاطمه صباغی و فرزانه مرتضی‌پور برفی: انجام و تفسیر آزمایش‌ها تشکر و قدردانی ایـن مقالـه، نتیجـه یـک طـرح پــژوهشی مصـــوب معاونت تحقیقات و فناوری وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی با شماره قرارداد 1755/700 و کد اخلاق IR.TMI.REC.1397.026 اخذ شده در مؤسسه عالی طب انتقال خون می‌باشد. بدین‌وسیله نویسندگان از مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال تشکر و قدردانی می‌نمایند.
Yari F, Teimourpour A, Zaman Vaziri M, Sabaghi F, Bagheri N, Mortezapour F. The genetic diversity of the HLA-B*35 and HLA-B*51 allele groups among ethnicities in Iran. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2024; 21 (3) :207-213 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1556-fa.html
یاری فاطمه، تیمورپور امیر، زمان وزیری مریم، صباغی فاطمه، باقری نادیا، مرتضی‌پور برفی فرزانه. تنوع ژنتیکی گروه‌های آللی HLA-B*35 و HLA-B*51 در قومیت‌های ایران. فصلنامه پژوهشی خون. 1403; 21 (3) :207-213
