جلد 21، شماره 3 - ( پاییز 1403 )
جلد 21 شماره 3 صفحات 206-197 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Mohammadali F, Abroun S, Atashi A. The effect of mild hypoxia on Stemness of CD34+ cells isolated from umbilical cord blood cocultured with human bone marrow mesenchymal stem cells. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2024; 21 (3) :197-206
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1535-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1535-fa.html
محمدعلی فاطمه، آبرون سعید، آتشی امیر. تاثیر هیپوکسی خفیف بر بنیادینگی سلول‌های CD34+ جدا شده از خون بند ناف در هم‌کشتی با سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان انسان. فصلنامه پژوهشی خون. 1403; 21 (3) :197-206
استاد دانشگاه تربیت مدرس
متن کامل [PDF 469 kb]
(216 دریافت)
| چکیده (HTML) (624 مشاهده)
مقدمه
سلول های بنیادی خونسازHSC) : Hematopoietic Stem Cell) با قابلیت خودنوسازی و تمایز به تمامی رده‌های خونی بالغ، باعث حفظ سیستم ایمنی و هموستاز در تمام طول عمر موجود زنده می‌شوند (1). به منظور جلوگیری از رد پیوند، سلول‌های بنیادی مشتق از مغز استخوان و خون محیطی باید از نظر آنتی‌ژن‌های لکوسیت انسانی (HLA : Human leukocyte antigen) با گیرنده پیوند سازگار باشند اما تنها 30-25 درصد بیماران قادر به تهیه سلول‌های بنیادی مغز استخوان از دهنده خویشاوند و یا غیرخویشاوند سازگار از نظر HLA می‌باشند (2). خون بند ناف منبعی غنی از HSC می‌باشد و از آن جا که الزام کمتری برای سازگاری HLA نیاز دارد، استفاده از سلول‌های بنیادی خون بند ناف افزایش یافته است (3).
با وجود تمام مزایای استفاده از خون بند ناف به علت حجم کم آن، تعداد سلول‌های بنیادی خون بند ناف تنها حدود 10 درصد سلول‌های بنیادی موجود در نمونه مغز استخوان است که منجر به پیوندپذیری با تأخیر آن می‌شود (4). برنامه ملی خون بند ناف (NCBP : National Cord Blood Program) اعلام کرده است که تنها 20 درصد از واحدهای خون بند ناف حاوی مقادیر سلولی کافی برای یک بیمار 75 کیلوگرمی می‌باشند (با توجه به آستانه مقدار سلول بیشتر از 107× 5/2 سلول‌های هسته‌دار کل یا TNCs : Total nucleated cell count به ازای کیلوگرم)(5). بنابراین پیوند خون بند ناف به طور معمول و موفقیت‌آمیزتری در پیوندهای کودکان استفاده می‌شود. بیماران دریافت‌کننده خون بند ناف با میزان سلول‌های تک هسته‌ای کل کمتر از 107×8/1 و سلول‌های CD34+ کمتر از 105×7/1 به ازای هر کیلوگرم وزن گیرنده، پیوندپذیری و میزان بقای کمتری داشتند. یک راه برای غلبه بر این مشکل، پیوند هم‌زمان دو واحد خون بند ناف از دهنده‌های مناسب غیر خویشاوند است (6). روش دیگر که در سال‌های اخیر به آن توجه بیشتری می‌شود، شناسایی عواملی است که باعث افزایش پیوندپذیری در کنار افزایش تعداد مطلق سلول‌های بنیادی موجود در خون بند ناف می‌شوند.
سلول‌های بنیادی خونساز با پیوندپذیری طولانی مـدت
و مورفولوژی اولیه به طور عمده در ناحیه اندوستئال مغز استخوان قرار دارند که ساختار عروقی ویژه‌ای دارد و فشار اکسیژن در این ناحیه کم است و نشان می‌دهد ریز محیط هیپوکسیک برای حفظ عملکرد صحیح HSC ضروری است (7). مسلماً طراحی سیستم کشتی که تعاملات HSC با سلول‌های استرومایی نیچ را نشان دهد و شرایطی شبیه به فضای نیچ داشته باشد، در شناخت نیچ و حفظ HSC اولیه مفید خواهد بود.
فرضیه این تحقیق این گونه بود که هم کشتی HSC CD34+ خون بند ناف با سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان انسان در شرایط هیپوکسی خفیف (اکسیژن 5 درصد) منجر به تقلید فضای نیچ، حفظ سلول‌های اولیه‌تر، افزایش خودنوسازی و بنیادینگی HSC شود که می‌تواند بر پیوندپذیری با تأخیر HSC خون بند ناف غلبه کند. به منظور بررسی بنیادینگی سلول‌های بنیادی در این تحقیق به بررسی HSC اولیه با بیان CD34+ و بررسی بیان ژن‌های HOXB4 ، c-Myc ، Nanogو SOX2 پرداخته شد.
مواد و روش‌ها
پردازش خون بند ناف و استخراج سلول‌های CD34+ :
نوع مطالعه آزمایشگاهی مداخله‌ای و نوع نمونه‌گیری در دسترس بود. در هر بار انجام آزمایش، 4 واحد کیسه خون از خون بند ناف نوزاد کامل پس از کسب رضایت‌نامه کتبی از والدین از مرکز خون بند ناف سازمان انتقال خون ایران و خون بند ناف رویان جمع‌آوری گردید. این تحقیق توسط کمیته اخلاق دانشگاه تربیت مدرس به شماره 4506 تایید گردید. 3 بار آزمایش‌ها به صورت مستقل تکرار شد. به طور خلاصه پس از جمع‌آوری نمونه خون بند ناف در ضد انعقاد CPD ، نمونه‌ها در دمای 18 تا 24 درجه سانتی‌گراد تا حداکثر 12 ساعت فرآوری شدند. گلبول‌های قرمز با روش هیدروکسی اتیل استارچ 6 درصد (گری‌فولد اسپانیا) رسوب داده شدند. سلول‌های تک هسته‌ای با سانتریفیوژ گرادیان حجم و فایکول هیپاک (لیمفودکس ـ اینوترین آلمان) جداسازی شدند. سلول‌های CD34+ با ستون MACS (میلتنی بایوتک آمریکا) جداسازی شدند .خلوص سلول‌های CD34+ با استفاده از آنتی‌بادی FITC-CD34 (فارمین ژن) با روش فلوسایتومتری سنجیده شد.
کشت و تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی:
سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان انسان از مرکز تحقیقات بن یاخته (دپارتمان سلول‌های بنیادی و مهندسی بافت بن یاخته، تهران، ایران) دریافت گردید. سه نمونه از سه فرد متفاوت در محیط کشت DMEM حاوی 10%FBS (جیبکو آمریکا) همراه با پنی‌سیلین (U/mL 025/0 جیبکو BRL) و استرپتومایسین (U/mL 025/0 جیبکوBRL) در 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO2 انکوبه شدند. وقتی سلول‌ها به همشاری 80%-70% رسیدند، تریپسینه شدند و در تعداد 2Cell/cm 104×1 کشت داده شدند. سلول‌ها تا 2-4 پاساژ کشت داده شدند. خصوصیات مورفولوژیک و قابلیت تمایز استئوبلاستی و آدیپوسیتی مورد سنجش قرار گرفت. تمایز به استخوان با رنگ‌آمیزی آلیزارین رد و تمایز به چربی با رنگ‌آمیزی Oil red Oانجام شد. سلول‌ها در تراکم 2Cell/cm 104×1 در پلیت 24 خانه کشت داده شدند و به عنوان لایه فیدر استفاده شدند.
هم‌کشتی HSC با سلول‌های بنیادی مزانشیمی:
سلول‌های +CD34 جدا شده از خون بند ناف در پلیت 24 خانه به تعداد 104×1 عدد چاهک/سلول به لایه فیدری که قبلاً کشت داده شده بود و به همشاری 80-70 درصد رسیده بود اضافه گردید. همراه با خارج نمودن محیط کشت DMEM از محیط کشت Stemline II (سیگما، آلمان) به همراه ترکیب سیتوکاینی FLT3-L (ng/mL 50 ORF ژنتیک ایسلند)، SCF (ng/mL 50 ORF ژنتیک ایسلند) وTPO (ng/mL 50 راکی‌هیل آمریکا) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO2در شرایط مختلف اکسیژن 5 و 20 درصد برای 7 روز کشت داده شدند. شرایط کشت مختلف به شرح ذیل بود:
در اولین شرایط کشت، سلول‌های CD34+ خون بند ناف همراه با محیط کشت پایه بدون سرم Stemline II در حضور غلظت 50 نانوگرم در میلی‌لیتر از سیتوکاین‌های FLT3L ، SCF و TPO کشت داده شد. در شرایط کشت دوم، سلول‌های CD34+ خون بند ناف همراه با محیط کشت پایه بدون سرم Stemline II و بدون حضور سیتوکاین‌های فوق، به صورت مستقیم بر روی لایه فیدر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان کشت داده شد و در نهایت، در گروه سوم، سلول‌های CD34+ خون بند ناف همراه با محیط کشت پایه بدون سرم Stemline II در حضور مخلوطی از سیتوکاین‌های فوق و برروی لایه فیدر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان کشت داده شد. علاوه بر شرایط کشت فوق در گروهی نیز سلول‌های CD34+ خون بند ناف بدون سیتوکاین و لایه فیدر سلول‌های بنیادی مزانشیمی به عنوان گروه کنترل کشت داده شد.
استخراج RNA و سنتز cDNA :
RNA سلول‌های بنیادی هماتوپوئیتیک CD34+ جدا شده با روش فنل ـ کلروفرم (Phenol-chloroform) از خون بند ناف (روز 0) و سلول‌های جدا شده از شرایط کشت مختلف در روز 7 با روش دستی استخراج گردید، سپس از روی آن cDNA (Primescript RT reagent Kit,Takara) ساخته شد. توالی آغازگرهای مورد استفاده در Real time PCR در جدول آورده شده است (جدول 1).
انجام Real time PCR :
بیان کمی mRNA ژن‌های حاصل از نمونه‌های RNA استخراج شده از سلول‌های CD34+ خون بند ناف (روز 0)، و سلول‌های کشت داده شده در شرایط مختلف (روز 7) با استفاده از کیت آمپلیکون دانمارک انجام شد. به این ترتیب که 1 میکرولیتر cDNA استخراج شده به همراه 3/0 میکرومول از آغازگرها و 5 میکرولیتر از مستر میکس Real time PCR به حجم 10 میکرولیتر رسانده شد. برنامه دمایی شامل یک چرخه 15 دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد، 40 چرخه 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 ثانیه بود. دمای آنیلینگ 61 درجه سانتی‌گراد بود.
تجزیه و تحلیل آماری:
چرخه آستانه Ct. (threshold cycle) مربوط به واکنش‌ها
توسط نرم‌افزار دستگاه Real-time PCR استخراج و ثبت گردید. در نهایت اختلاف بیان نسبت به نمونه کنترل با فرمول Pfaffl محاسبه گردید و توسط نرم‌افزار GraphPad Parism 5 مورد آنالیز قرار گرفت (8). نتایج به صورت بیان نسبی ژن (Relative Gene Expression) گزارش شدند. مقایسه بین دو گروه اکسیژن 5% و 21% و مقایسه بین سه گروه مختلف با روش آماری ANOVA انجام شد. مقادیر 05/0 p< معنادار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
تایید هویت سلول‌های بنیادی مزانشیمی جدا شده از مغز استخوان:
سلول‌های بنیادی مزانشیمی با آنتی‌بادی بر علیه مارکرهای CD90,CD105,CD73,CD45 تعیین هویت شدند که از نظر CD90 ، CD105 و CD73مثبت و از نظر CD45 منفی بودند (9).
نتایج quantitative Real-time PCR ژن‌های c-Myc ، SOX2 ، Nanog ، HOXB4 :
میزان تغییرات بیان mRNA ژن‌های c-Myc ، SOX2 ، Nanog و HOXB4 در شرایط کشت مختلف در روز 7 در نمودار آورده شده است (نمودار 1). نتایج بررسی بیان ژن‌های بنیادینگی c-Myc ، SOX2 ، Nanog و HOXB4 نشان داد که بیشترین میزان بیان در شرایط کشت هم‌زمان سلول‌های مزانشیمی در حضور سیتوکاین در هر دو گروه اکسیژن 20% و 5% بود. بیان این ژن‌ها در شرایط کشت سیتوکاین به تنهایی کمتر از بیان آن در شرایط کشت سلول مزانشیمی به تنهایی بود. در کلیه موارد اکسیژن 5% در مقایسه با اکسیژن 20% بیان ژن بالاتری مشاهده شد و این تفاوت از نظر آماری معنادار بود (05/0 p<). در شرایط اکسیژن 5 درصد نسبت به 20 درصد افزایش معنادار بیان ژن‌های بنیادینگی شامل HOXB4 (8/1-3/1 برابر)، SOX2 (6/1-4/1 برابر)، Nanog (3/1-2/1 برابر) و c-Myc (9/1-4/1 برابر) در روز 7 مشاهده شد.
بحث
خون بند ناف منبعی فراوان و در دستـرس از سلول‌های
بنیادی است که در زمینه تحقیقات و سلول درمانی کاربرد دارد. نتایج مطالعه ما نشان داد که سلول‌های بنیادی هماتوپوئیتیک خون بند ناف که مارکر CD34+ را بیان می‌کنند، در خون بند ناف حضور دارند. علت انتخاب جمعیت CD34+ این است که این جمعیت بسیار هتروژن بوده و قابلیت تمایز و تعهد به همه رده‌ها را دارد. مطالعه‌های in vitro نشان می‌دهد که تقریباً تمام سلول‌های CD34+ خاصیت مولتی‌پوتنتی و یا الیگوپوتنتی را دارند. حدود 90 درصد سلول‌هـای CD34+ مارکـر CD38 را بیان
می‌کنند که توانایی تبدیل به کلنی چند رده‌ای لنفوئیدی- میلوئیدی را دارد (11-10).
تعادل بین خودنوسازی و تمایز سلول‌های پروژنیتور خونساز توسط تعاملات خاصی در فضای مغز استخوان تنظیم می‌شود. انواع سلول‌های مختلف فاکتورهای محلول و اجزای ماتریکس خارج سلولی در نیچ حضور دارند (13، 12)، با این حال نقش اصلی را سلول‌های بنیادی مزانشیمی به علت خاصیت تمایز چند رده‌ای و تنظیم عملکرد HSC دارند (14، 13). نتایج مطالعه‌های مختلف نشان داده است که در مقایسه بین سلول‌های بنیادی مزانشیمی جدا شده از بافت خون بند ناف، مغز استخوان و چربی، چسبندگی HSC جدا شده از خون بند ناف به سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان بیش از همه بوده است (90 درصد) (15). به همین دلیل در این مطالعه جهت ارزیابی اثر هم‌کشتی بر میزان تکثیر و بنیادینگی سلول‌های CD34+ خون بند ناف، این سلول‌ها را با سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان کشت داده و به بررسی اثرات آن پرداختیم.
در این مطالعه سلول‌های CD34+ خون بند ناف به مدت 7 روز در شرایط کشت مختلف کشت داده شدند، علت انتخاب مدت زمان 7 روز برای هم‌کشتی این بود که نگهداری طولانی در محیط بدون سرم با فاکتور منجر به تغییرات مورفولوژیکی و از دست دادن خاصیت فنوتیپی سلول‌ها می‌شود (16).
در این تحقیق از محیط کشت بدون سرم استفاده شد، زیرا در کاربرد بالینی، محیط کشت بدون سرم برخی نگرانی‌های سرم مانند خطر ابتلا به ویروس‌ها یا پریون‌ها (Proins)، اختلاف بین بسته‌های (Batch) مختلف و حضور مهارکننده‌ها یا عوامل تحریک‌کننده را ندارد و در نهایت استفاده از محیط بدون سرم امکان استفاده از شرایط کشت تعریف شده از نظر بیوشیمیایی را فراهم می‌آورد (18، 17).
مطالعه‌های مختلف به بررسی ترکیبات مختلف سیتوکاینی که باعث حفظ خودنوسازی و محدود کردن آپوپتوز می‌شوند پرداختهاند و ترکیب سیتوکاینی شامل SCF، TPO و FLT3L را به عنوان یکی از بهترین ترکیبات سیتوکاینی پیشنهاد کرده‌اند (21-19). بنابراین در این مطالعه از ترکیب سیتوکاینی فوق استفاده شد. TPOبه تنهایی و یا همراه با سایر سیتوکاین‌ها که سریع اثر هستند مثل SCF و FLT3L ، باعث افزایش پرولیفراسیون سلول‌های هماتوپوئیتیک اولیه در in vitro می‌شود (22). TPO را می‌توان جایگزین IL-3 ، IL-6 و G-CSF بدون تغییر در تعداد SRC (SCID Cell repopulating) نمود و از آپوپتوز جلوگیری کرد و با ممانعت از تخریب تلومر (Telomere)، از خودنوسازی سلول‌های بنیادی اولیه حمایت نمود (25-23).
در خصـوص سیستـم هماتوپوئیتیـک تعادل بالانس بین
تکثیر سلولی و خاموشی برای HSC با غلظت اکسیژن حدود 5 درصد گزارش شده است (26). بنابراین در این مطالعه به منظور حفظ تکثیر سلول‌های CD34+ خون بند ناف در کنار حفظ بنیادینگی آن از غلظت اکسیژن 5 درصد جهت بررسی استفاده شد.
از آن جا که در نتیجه مطالعه‌ای گزارش شده بود که میزان اکسیژن 5 درصد از حدود 4 ساعت پس از قرار دادن در انکوباتور تا 192 ساعت ( 7 روز) ثابت می‌ماند، ما از هیپوکسی مزمن استفاده نمودیم و سلول‌های گروه اکسیژن 5% به مدت هفت روز در انکوباتور نگهداری شدند (27).
به منظور بررسی بنیادینگی سلول‌های بنیادی در این تحقیق به بررسی بیان ژن‌های، HOXB4 ، c-Myc Nanog و SOX2 پرداختیم.
نتایج مطالعه ما نشان داد بیشترین بیان ژن‌های بنیادینگی (HOXB4, c-Myc, Nanog, SOX2) در شرایط هم کشتی همراه با سیتوکاین‌ها در غلظت اکسیژن 5 درصد بود که می‌تواند نقش مهمی در افزایش خودنوسازی HSC داشته باشد. در گروه سلول‌های مزانشیمی و سیتوکاین با غلظت اکسیژن 21 درصد بیان ژن‌ها بالاتر از بیان آن در شرایط کشت سیتوکاین به تنهایی و سلول مزانشیمی به تنهایی بود.
نتایج ما نشان داد که با وجود تکثیر بیشتر HSC در گروه سیتوکاین به تنهایی، بیان ژن‌های بنیادینگی در این گروه نسبت به سایر گروه‌ها پایین‌تر بود. از آن‌جا که سیتوکاین‌ها باعث پیشروی تمایز به سلول‌های بالغ‌تر می‌شوند، بنابراین در شرایط کشت سیتوکاین به تنهایی بیان مارکرهای مرتبط با خودنوسازی کاهش می‌یابد. مطالعه‌های متعددی گزارش کرده‌اند که سیتوکاین‌ها مانند GM-CSF، IL-3، SCF و TPO موجب افزایش تکثیر HSC موشی و انسانی می‌شود اما با افزایش سریع ROS در سلول‌ها نیز همراه هستند (28). به نظر می‌رسد که هم کشتی با MSC از عوارض جانبی ROS کاسته و باعث حفظ بهتر خودنوسازی HSC می‌شود. علت انتخاب ژن HOXB4 به عنوان مارکر بنیادینگی HSC این بود که HOXB4 یکی از مهم‌ترین تنظیمکنندههای خودنوسازی HSC می‌باشد (29). در سلول‌های بنیادی بیان می‌شود و سپس در طی تمایز در انسان و موش کاهش بیان می‌یابد (31، 30). مطالعه‌های متعددی نشـان داده‌اند که HOXB4 باعث تکثیر ex vivo و in vivo HSCs می‌شود (34-32).
در غیاب c-Myc تمایز HSC به سمت پروژنیتورهای تعهد یافته مهار می‌شـود، بـرعکـس افزایش بیان اجباری c-Myc درHSC منجر به افزایش خودنوسازی در شروع تمایز می‌گردد (35). این‌ها پیشنهاد می‌کند که c-Myc باعث کنترل تمایز اولیه LT-HSC در in vivoمی‌شود و حذف ژنی c-Myc منجر به پان‌سیتوپنی و مرگ HSC و آپوپتوز به علت تجمع مولکول گرانزیم B (Granzyme B) می‌شود (36). بنابراین c-Myc باعث کنترل فعالیت عملکردی HSC مثل پرولیفراسیون و بقا و تمایز آن می‌شود. نتایج مطالعه‌های مختلف نشان داده است c-Myc با HIF-1α در تعامل است (37). c-Myc باعث حفظ خودنوسازی HSC در پایین دست سیگنالینگ Notch و HOXB4 می‌شود.
مطالعه‌ای تاکنون به بررسی بیان ژن‌های بنیادینگی در سلول‌های CD34+ خون بند ناف در شرایط غلظت اکسیژن 5 درصـد نپـرداختـه است امـا بیـان ایـن ژن‌هـا در سایــر
سلول‌های بنیادی مورد ارزیابی قرار گرفته است:
در سلول‌های بنیادی رویانی تیمار شده با اکسیژن 2 درصد، ژن‌های Nanog ، SOX2 افزایش بیان داشتند. مجموعه Nanog ، SOX2 ، OCT4 باعث مهار ژن‌های درگیر در تمایز می‌شوند. حذف ژنی HIF2α که OCT4 را هدف قرار می‌دهد، باعث مهار تکثیر سلول‌های بنیادی رویانی می‌شود. با افزایش غلظت O2 میزان بیان مارکرهای SOX2 ، Nanog ، OCT4 در سلول‌های ESC کاهش می‌یابد (38).
در مطالعه‌ای در کشت سلول‌های شبه فیبروبلاست بافت چربی (ASC : Adipose-derived stromal/stem cells) در غلظت اکسیژن 2 درصد، میزان بیان ژن‌های Sox2 و Nanog به ترتیب 25/1 و 39/1 برابر بالاتر از نرموکسی بود و غلظت اکسیژن 2 درصد پرولیفراسیون ASC را تا 10 روز افزایش داد (39).
در مطالعه‌ای دیگر سلول‌های بنیادی رویانی مشتق از امبریوی (Embryo) 8 سلوله در اکسیژن 5 درصد پلوری پوتنسی بهتری را حفظ کردند (40). اکسیژن 5 درصد، باعث ورود مجدد سلول‌های متعهد به سمت پلوری پوتنسی می‌شود (در اکسیژن 2 درصد).
آن چه که مشخص است این است که نیچ هیپوکسیـک
HSC از طریق القای ژن‌های مهاری چرخه سلول باعث خاموشی می‌شود. اکسیژن 5% هم‌چنین با کاهش فعالیت متابولیکی و محافظت HSC ها از آسیب ناشی از ROS باعث حفظ HSC ها در طول زندگی می‌گردد، بنابراین قرار گرفتن در شرایط اکسیژن 5% می‌تواند بر حفظ بنیادینگی این سلول‌ها تأثیر مثبت داشته باشد.
نتیجه‌گیری
مکانیسم درگیر در سرنوشت HSC ، خاموشی و تمایز آن در انسان هنوز به طور کامل شناخته نشده است. مسلماً طراحی سیستم کشت in vitro ای که به طور دقیق تعاملات HSC را نشان دهد، ارزش بالایی دارد و می‌تواند جایگاهی مناسب برای بررسی اثرات داروهای مختلف بر HSC قبل
از آزمایش‌ها در مدل حیوانی باشد. تاکنون روش‌های مختلفی برای کشت HSC انجام شده است هدف همه این روش‌ها تکثیر HSC اولیه و نابالغ و تقلید نیچ است.
اکسیژن 5 درصد یک روش کارآمد برای تکثیر در شرایط آزمایشگاهی HSC می‌باشد. نقش حمایتی رشد HSC خون بند ناف در هم‌کشتی با سلول‌های مزانشیمی در شرایط اکسیژن 5 درصد به طور قابل توجهی افزایش یافت. ژن‌های مؤثر در بنیادینگی و خودنوسازی در شرایط اکسیژن 5 درصد افزایش بیان داشت. روی هم‌رفته، نتایج حاصل از سیستم هم‌کشتی و اکسیژن 5 درصد می‌تواند به ما در درک نقش واقعی هیپوکسی به عنوان فاکتور مهم نیچ و پتانسیل حمایت سلول‌های استرومایی برای پروژنیتورهای خونساز و فعالیت سلول‌های بنیادی کمک کند.
حمایت مالی
این تحقیق برگرفته از رساله مقطع دکترای دانشگاه تربیت مدرس می‌باشد.
ملاحظات اخلاقی
این تحقیق توسط کمیته اخلاق دانشگاه تربیت مدرس با شماره 4506 مجوز گرفته است.
عدم تعارض منافع
نویسندگان اظهار می‌کنند هیچ‌گونه تعارض منافعی در این مطالعه وجود نداشته است.
نقش نویسندگان
دکتر فاطمه محمد علی: طراحی تحقیق، انجام آزمایش‌ها و نگارش پیش‌نویس مقاله
دکتر سعید آبرون: راهنمایی درخصوص انجام آزمایش‌ها و ویرایش مقاله
دکتر امیر آتشی:
متن کامل: (240 مشاهده)
|
دوره 21 شماره 3 پاییز 1403 (206-197) |
|
مقاله پژوهشی |
تاثیر هیپوکسی خفیف بر بنیادینگی سلول‌های CD34+ جدا شده از خون
بند ناف در هم‌کشتی با سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان انسان
فاطمه محمدعلی1، سعید آبرون2، امیر آتشی3
چکیده
سابقه و هدف
خون بند ناف منبعی غنی از سلول‌های بنیادی خونساز است که علاوه بر مزایای فراوان، معایب آن شامل تعداد محدود سلول‌های بنیادی و پیوندپذیری با تأخیر می‌باشد. مسلماً شناسایی استراتژی‌هایی که در کنار افزایش تکثیر سلول‌های بنیادی خونساز یا HSC ، باعث حفظ بنیادینگی آن شوند، می‌تواند اثربخشی پیوند را افزایش دهد. هدف از این مطالعه، بررسی شرایط کشت مختلف در شرایط هیپوکسی (غلظت اکسیژن 5%) بر بیان ژن‌های HOXB4،c-Myc ، Nanog وSOX2 در سلول‌های CD34+ خون بند ناف بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه مداخله‌ای، سلول‌های CD34+ خون بند ناف انسان جداسازی گردید و در محیط کشت بدون سرم در حضور ترکیب سیتوکاینی (TPO، FLT3L ، SCF) با یا بدون حضور سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان (MSC) در غلظت اکسیژن 21% و 5% به مدت 7 روز کشت داده شد (در 5 گروه مختلف). در روز 7 بیان ژن‌های HOXB4 ، c-Myc ، Nanog ، SOX2 با PCR Real timeمورد بررسی قرار گرفت. آزمایش‌ها در 3 بار مستقل انجام شد. تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها با استفاده از آزمون ANOVA انجام و 05/0 p< معنادار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
بیشترین بیان ژن‌های HOXB4 ،c-Myc ، Nanog و SOX2 در شرایط کشت HSC با MSC مغز استخوان در غلظت اکسیژن 5% بود. نتایج مطالعه افزایش معنادار از نظر آماری در میزان تکثیر و بیان ژن‌های بنیادینگی را در غلظت اکسیژن 5% در مقایسه با 21% نشان داد.
نتیجه گیری
ترکیب سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان و غلظت اکسیژن 5% باعث افزایش ظرفیت بنیادینگی HSC می‌شود و شرایطی شبیه به فضای نیچ را فراهم می‌آورد.
کلمات کلیدی: خون بند ناف، سلول‌های بنیادی خونساز، سلول‌های بنیادی مزانشیمی، هم‌کشتی، هیپوکسی
تاریخ دریافت: 19/03/1403
تاریخ پذیرش: 06/06/1403
1- PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استاد دانشگاه تربیت مدرس ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 331-14155
3- PhDهماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات سلول‌های بنیادی و مهندسی بافت دانشگاه علوم پزشکی شاهرود ـ شاهرود ـ ایران
بند ناف در هم‌کشتی با سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان انسان
فاطمه محمدعلی1، سعید آبرون2، امیر آتشی3
چکیده
سابقه و هدف
خون بند ناف منبعی غنی از سلول‌های بنیادی خونساز است که علاوه بر مزایای فراوان، معایب آن شامل تعداد محدود سلول‌های بنیادی و پیوندپذیری با تأخیر می‌باشد. مسلماً شناسایی استراتژی‌هایی که در کنار افزایش تکثیر سلول‌های بنیادی خونساز یا HSC ، باعث حفظ بنیادینگی آن شوند، می‌تواند اثربخشی پیوند را افزایش دهد. هدف از این مطالعه، بررسی شرایط کشت مختلف در شرایط هیپوکسی (غلظت اکسیژن 5%) بر بیان ژن‌های HOXB4،c-Myc ، Nanog وSOX2 در سلول‌های CD34+ خون بند ناف بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه مداخله‌ای، سلول‌های CD34+ خون بند ناف انسان جداسازی گردید و در محیط کشت بدون سرم در حضور ترکیب سیتوکاینی (TPO، FLT3L ، SCF) با یا بدون حضور سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان (MSC) در غلظت اکسیژن 21% و 5% به مدت 7 روز کشت داده شد (در 5 گروه مختلف). در روز 7 بیان ژن‌های HOXB4 ، c-Myc ، Nanog ، SOX2 با PCR Real timeمورد بررسی قرار گرفت. آزمایش‌ها در 3 بار مستقل انجام شد. تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها با استفاده از آزمون ANOVA انجام و 05/0 p< معنادار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
بیشترین بیان ژن‌های HOXB4 ،c-Myc ، Nanog و SOX2 در شرایط کشت HSC با MSC مغز استخوان در غلظت اکسیژن 5% بود. نتایج مطالعه افزایش معنادار از نظر آماری در میزان تکثیر و بیان ژن‌های بنیادینگی را در غلظت اکسیژن 5% در مقایسه با 21% نشان داد.
نتیجه گیری
ترکیب سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان و غلظت اکسیژن 5% باعث افزایش ظرفیت بنیادینگی HSC می‌شود و شرایطی شبیه به فضای نیچ را فراهم می‌آورد.
کلمات کلیدی: خون بند ناف، سلول‌های بنیادی خونساز، سلول‌های بنیادی مزانشیمی، هم‌کشتی، هیپوکسی
تاریخ دریافت: 19/03/1403
تاریخ پذیرش: 06/06/1403
1- PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استاد دانشگاه تربیت مدرس ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 331-14155
3- PhDهماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات سلول‌های بنیادی و مهندسی بافت دانشگاه علوم پزشکی شاهرود ـ شاهرود ـ ایران
مقدمه
سلول های بنیادی خونسازHSC) : Hematopoietic Stem Cell) با قابلیت خودنوسازی و تمایز به تمامی رده‌های خونی بالغ، باعث حفظ سیستم ایمنی و هموستاز در تمام طول عمر موجود زنده می‌شوند (1). به منظور جلوگیری از رد پیوند، سلول‌های بنیادی مشتق از مغز استخوان و خون محیطی باید از نظر آنتی‌ژن‌های لکوسیت انسانی (HLA : Human leukocyte antigen) با گیرنده پیوند سازگار باشند اما تنها 30-25 درصد بیماران قادر به تهیه سلول‌های بنیادی مغز استخوان از دهنده خویشاوند و یا غیرخویشاوند سازگار از نظر HLA می‌باشند (2). خون بند ناف منبعی غنی از HSC می‌باشد و از آن جا که الزام کمتری برای سازگاری HLA نیاز دارد، استفاده از سلول‌های بنیادی خون بند ناف افزایش یافته است (3).
با وجود تمام مزایای استفاده از خون بند ناف به علت حجم کم آن، تعداد سلول‌های بنیادی خون بند ناف تنها حدود 10 درصد سلول‌های بنیادی موجود در نمونه مغز استخوان است که منجر به پیوندپذیری با تأخیر آن می‌شود (4). برنامه ملی خون بند ناف (NCBP : National Cord Blood Program) اعلام کرده است که تنها 20 درصد از واحدهای خون بند ناف حاوی مقادیر سلولی کافی برای یک بیمار 75 کیلوگرمی می‌باشند (با توجه به آستانه مقدار سلول بیشتر از 107× 5/2 سلول‌های هسته‌دار کل یا TNCs : Total nucleated cell count به ازای کیلوگرم)(5). بنابراین پیوند خون بند ناف به طور معمول و موفقیت‌آمیزتری در پیوندهای کودکان استفاده می‌شود. بیماران دریافت‌کننده خون بند ناف با میزان سلول‌های تک هسته‌ای کل کمتر از 107×8/1 و سلول‌های CD34+ کمتر از 105×7/1 به ازای هر کیلوگرم وزن گیرنده، پیوندپذیری و میزان بقای کمتری داشتند. یک راه برای غلبه بر این مشکل، پیوند هم‌زمان دو واحد خون بند ناف از دهنده‌های مناسب غیر خویشاوند است (6). روش دیگر که در سال‌های اخیر به آن توجه بیشتری می‌شود، شناسایی عواملی است که باعث افزایش پیوندپذیری در کنار افزایش تعداد مطلق سلول‌های بنیادی موجود در خون بند ناف می‌شوند.
سلول‌های بنیادی خونساز با پیوندپذیری طولانی مـدت
و مورفولوژی اولیه به طور عمده در ناحیه اندوستئال مغز استخوان قرار دارند که ساختار عروقی ویژه‌ای دارد و فشار اکسیژن در این ناحیه کم است و نشان می‌دهد ریز محیط هیپوکسیک برای حفظ عملکرد صحیح HSC ضروری است (7). مسلماً طراحی سیستم کشتی که تعاملات HSC با سلول‌های استرومایی نیچ را نشان دهد و شرایطی شبیه به فضای نیچ داشته باشد، در شناخت نیچ و حفظ HSC اولیه مفید خواهد بود.
فرضیه این تحقیق این گونه بود که هم کشتی HSC CD34+ خون بند ناف با سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان انسان در شرایط هیپوکسی خفیف (اکسیژن 5 درصد) منجر به تقلید فضای نیچ، حفظ سلول‌های اولیه‌تر، افزایش خودنوسازی و بنیادینگی HSC شود که می‌تواند بر پیوندپذیری با تأخیر HSC خون بند ناف غلبه کند. به منظور بررسی بنیادینگی سلول‌های بنیادی در این تحقیق به بررسی HSC اولیه با بیان CD34+ و بررسی بیان ژن‌های HOXB4 ، c-Myc ، Nanogو SOX2 پرداخته شد.
مواد و روش‌ها
پردازش خون بند ناف و استخراج سلول‌های CD34+ :
نوع مطالعه آزمایشگاهی مداخله‌ای و نوع نمونه‌گیری در دسترس بود. در هر بار انجام آزمایش، 4 واحد کیسه خون از خون بند ناف نوزاد کامل پس از کسب رضایت‌نامه کتبی از والدین از مرکز خون بند ناف سازمان انتقال خون ایران و خون بند ناف رویان جمع‌آوری گردید. این تحقیق توسط کمیته اخلاق دانشگاه تربیت مدرس به شماره 4506 تایید گردید. 3 بار آزمایش‌ها به صورت مستقل تکرار شد. به طور خلاصه پس از جمع‌آوری نمونه خون بند ناف در ضد انعقاد CPD ، نمونه‌ها در دمای 18 تا 24 درجه سانتی‌گراد تا حداکثر 12 ساعت فرآوری شدند. گلبول‌های قرمز با روش هیدروکسی اتیل استارچ 6 درصد (گری‌فولد اسپانیا) رسوب داده شدند. سلول‌های تک هسته‌ای با سانتریفیوژ گرادیان حجم و فایکول هیپاک (لیمفودکس ـ اینوترین آلمان) جداسازی شدند. سلول‌های CD34+ با ستون MACS (میلتنی بایوتک آمریکا) جداسازی شدند .خلوص سلول‌های CD34+ با استفاده از آنتی‌بادی FITC-CD34 (فارمین ژن) با روش فلوسایتومتری سنجیده شد.
کشت و تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی:
سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان انسان از مرکز تحقیقات بن یاخته (دپارتمان سلول‌های بنیادی و مهندسی بافت بن یاخته، تهران، ایران) دریافت گردید. سه نمونه از سه فرد متفاوت در محیط کشت DMEM حاوی 10%FBS (جیبکو آمریکا) همراه با پنی‌سیلین (U/mL 025/0 جیبکو BRL) و استرپتومایسین (U/mL 025/0 جیبکوBRL) در 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO2 انکوبه شدند. وقتی سلول‌ها به همشاری 80%-70% رسیدند، تریپسینه شدند و در تعداد 2Cell/cm 104×1 کشت داده شدند. سلول‌ها تا 2-4 پاساژ کشت داده شدند. خصوصیات مورفولوژیک و قابلیت تمایز استئوبلاستی و آدیپوسیتی مورد سنجش قرار گرفت. تمایز به استخوان با رنگ‌آمیزی آلیزارین رد و تمایز به چربی با رنگ‌آمیزی Oil red Oانجام شد. سلول‌ها در تراکم 2Cell/cm 104×1 در پلیت 24 خانه کشت داده شدند و به عنوان لایه فیدر استفاده شدند.
هم‌کشتی HSC با سلول‌های بنیادی مزانشیمی:
سلول‌های +CD34 جدا شده از خون بند ناف در پلیت 24 خانه به تعداد 104×1 عدد چاهک/سلول به لایه فیدری که قبلاً کشت داده شده بود و به همشاری 80-70 درصد رسیده بود اضافه گردید. همراه با خارج نمودن محیط کشت DMEM از محیط کشت Stemline II (سیگما، آلمان) به همراه ترکیب سیتوکاینی FLT3-L (ng/mL 50 ORF ژنتیک ایسلند)، SCF (ng/mL 50 ORF ژنتیک ایسلند) وTPO (ng/mL 50 راکی‌هیل آمریکا) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO2در شرایط مختلف اکسیژن 5 و 20 درصد برای 7 روز کشت داده شدند. شرایط کشت مختلف به شرح ذیل بود:
در اولین شرایط کشت، سلول‌های CD34+ خون بند ناف همراه با محیط کشت پایه بدون سرم Stemline II در حضور غلظت 50 نانوگرم در میلی‌لیتر از سیتوکاین‌های FLT3L ، SCF و TPO کشت داده شد. در شرایط کشت دوم، سلول‌های CD34+ خون بند ناف همراه با محیط کشت پایه بدون سرم Stemline II و بدون حضور سیتوکاین‌های فوق، به صورت مستقیم بر روی لایه فیدر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان کشت داده شد و در نهایت، در گروه سوم، سلول‌های CD34+ خون بند ناف همراه با محیط کشت پایه بدون سرم Stemline II در حضور مخلوطی از سیتوکاین‌های فوق و برروی لایه فیدر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان کشت داده شد. علاوه بر شرایط کشت فوق در گروهی نیز سلول‌های CD34+ خون بند ناف بدون سیتوکاین و لایه فیدر سلول‌های بنیادی مزانشیمی به عنوان گروه کنترل کشت داده شد.
استخراج RNA و سنتز cDNA :
RNA سلول‌های بنیادی هماتوپوئیتیک CD34+ جدا شده با روش فنل ـ کلروفرم (Phenol-chloroform) از خون بند ناف (روز 0) و سلول‌های جدا شده از شرایط کشت مختلف در روز 7 با روش دستی استخراج گردید، سپس از روی آن cDNA (Primescript RT reagent Kit,Takara) ساخته شد. توالی آغازگرهای مورد استفاده در Real time PCR در جدول آورده شده است (جدول 1).
انجام Real time PCR :
بیان کمی mRNA ژن‌های حاصل از نمونه‌های RNA استخراج شده از سلول‌های CD34+ خون بند ناف (روز 0)، و سلول‌های کشت داده شده در شرایط مختلف (روز 7) با استفاده از کیت آمپلیکون دانمارک انجام شد. به این ترتیب که 1 میکرولیتر cDNA استخراج شده به همراه 3/0 میکرومول از آغازگرها و 5 میکرولیتر از مستر میکس Real time PCR به حجم 10 میکرولیتر رسانده شد. برنامه دمایی شامل یک چرخه 15 دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد، 40 چرخه 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 ثانیه بود. دمای آنیلینگ 61 درجه سانتی‌گراد بود.
تجزیه و تحلیل آماری:
چرخه آستانه Ct. (threshold cycle) مربوط به واکنش‌ها
توسط نرم‌افزار دستگاه Real-time PCR استخراج و ثبت گردید. در نهایت اختلاف بیان نسبت به نمونه کنترل با فرمول Pfaffl محاسبه گردید و توسط نرم‌افزار GraphPad Parism 5 مورد آنالیز قرار گرفت (8). نتایج به صورت بیان نسبی ژن (Relative Gene Expression) گزارش شدند. مقایسه بین دو گروه اکسیژن 5% و 21% و مقایسه بین سه گروه مختلف با روش آماری ANOVA انجام شد. مقادیر 05/0 p< معنادار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
تایید هویت سلول‌های بنیادی مزانشیمی جدا شده از مغز استخوان:
سلول‌های بنیادی مزانشیمی با آنتی‌بادی بر علیه مارکرهای CD90,CD105,CD73,CD45 تعیین هویت شدند که از نظر CD90 ، CD105 و CD73مثبت و از نظر CD45 منفی بودند (9).
نتایج quantitative Real-time PCR ژن‌های c-Myc ، SOX2 ، Nanog ، HOXB4 :
میزان تغییرات بیان mRNA ژن‌های c-Myc ، SOX2 ، Nanog و HOXB4 در شرایط کشت مختلف در روز 7 در نمودار آورده شده است (نمودار 1). نتایج بررسی بیان ژن‌های بنیادینگی c-Myc ، SOX2 ، Nanog و HOXB4 نشان داد که بیشترین میزان بیان در شرایط کشت هم‌زمان سلول‌های مزانشیمی در حضور سیتوکاین در هر دو گروه اکسیژن 20% و 5% بود. بیان این ژن‌ها در شرایط کشت سیتوکاین به تنهایی کمتر از بیان آن در شرایط کشت سلول مزانشیمی به تنهایی بود. در کلیه موارد اکسیژن 5% در مقایسه با اکسیژن 20% بیان ژن بالاتری مشاهده شد و این تفاوت از نظر آماری معنادار بود (05/0 p<). در شرایط اکسیژن 5 درصد نسبت به 20 درصد افزایش معنادار بیان ژن‌های بنیادینگی شامل HOXB4 (8/1-3/1 برابر)، SOX2 (6/1-4/1 برابر)، Nanog (3/1-2/1 برابر) و c-Myc (9/1-4/1 برابر) در روز 7 مشاهده شد.
بحث
خون بند ناف منبعی فراوان و در دستـرس از سلول‌های
بنیادی است که در زمینه تحقیقات و سلول درمانی کاربرد دارد. نتایج مطالعه ما نشان داد که سلول‌های بنیادی هماتوپوئیتیک خون بند ناف که مارکر CD34+ را بیان می‌کنند، در خون بند ناف حضور دارند. علت انتخاب جمعیت CD34+ این است که این جمعیت بسیار هتروژن بوده و قابلیت تمایز و تعهد به همه رده‌ها را دارد. مطالعه‌های in vitro نشان می‌دهد که تقریباً تمام سلول‌های CD34+ خاصیت مولتی‌پوتنتی و یا الیگوپوتنتی را دارند. حدود 90 درصد سلول‌هـای CD34+ مارکـر CD38 را بیان
می‌کنند که توانایی تبدیل به کلنی چند رده‌ای لنفوئیدی- میلوئیدی را دارد (11-10).
تعادل بین خودنوسازی و تمایز سلول‌های پروژنیتور خونساز توسط تعاملات خاصی در فضای مغز استخوان تنظیم می‌شود. انواع سلول‌های مختلف فاکتورهای محلول و اجزای ماتریکس خارج سلولی در نیچ حضور دارند (13، 12)، با این حال نقش اصلی را سلول‌های بنیادی مزانشیمی به علت خاصیت تمایز چند رده‌ای و تنظیم عملکرد HSC دارند (14، 13). نتایج مطالعه‌های مختلف نشان داده است که در مقایسه بین سلول‌های بنیادی مزانشیمی جدا شده از بافت خون بند ناف، مغز استخوان و چربی، چسبندگی HSC جدا شده از خون بند ناف به سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان بیش از همه بوده است (90 درصد) (15). به همین دلیل در این مطالعه جهت ارزیابی اثر هم‌کشتی بر میزان تکثیر و بنیادینگی سلول‌های CD34+ خون بند ناف، این سلول‌ها را با سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان کشت داده و به بررسی اثرات آن پرداختیم.
در این مطالعه سلول‌های CD34+ خون بند ناف به مدت 7 روز در شرایط کشت مختلف کشت داده شدند، علت انتخاب مدت زمان 7 روز برای هم‌کشتی این بود که نگهداری طولانی در محیط بدون سرم با فاکتور منجر به تغییرات مورفولوژیکی و از دست دادن خاصیت فنوتیپی سلول‌ها می‌شود (16).
در این تحقیق از محیط کشت بدون سرم استفاده شد، زیرا در کاربرد بالینی، محیط کشت بدون سرم برخی نگرانی‌های سرم مانند خطر ابتلا به ویروس‌ها یا پریون‌ها (Proins)، اختلاف بین بسته‌های (Batch) مختلف و حضور مهارکننده‌ها یا عوامل تحریک‌کننده را ندارد و در نهایت استفاده از محیط بدون سرم امکان استفاده از شرایط کشت تعریف شده از نظر بیوشیمیایی را فراهم می‌آورد (18، 17).
مطالعه‌های مختلف به بررسی ترکیبات مختلف سیتوکاینی که باعث حفظ خودنوسازی و محدود کردن آپوپتوز می‌شوند پرداختهاند و ترکیب سیتوکاینی شامل SCF، TPO و FLT3L را به عنوان یکی از بهترین ترکیبات سیتوکاینی پیشنهاد کرده‌اند (21-19). بنابراین در این مطالعه از ترکیب سیتوکاینی فوق استفاده شد. TPOبه تنهایی و یا همراه با سایر سیتوکاین‌ها که سریع اثر هستند مثل SCF و FLT3L ، باعث افزایش پرولیفراسیون سلول‌های هماتوپوئیتیک اولیه در in vitro می‌شود (22). TPO را می‌توان جایگزین IL-3 ، IL-6 و G-CSF بدون تغییر در تعداد SRC (SCID Cell repopulating) نمود و از آپوپتوز جلوگیری کرد و با ممانعت از تخریب تلومر (Telomere)، از خودنوسازی سلول‌های بنیادی اولیه حمایت نمود (25-23).
در خصـوص سیستـم هماتوپوئیتیـک تعادل بالانس بین
تکثیر سلولی و خاموشی برای HSC با غلظت اکسیژن حدود 5 درصد گزارش شده است (26). بنابراین در این مطالعه به منظور حفظ تکثیر سلول‌های CD34+ خون بند ناف در کنار حفظ بنیادینگی آن از غلظت اکسیژن 5 درصد جهت بررسی استفاده شد.
از آن جا که در نتیجه مطالعه‌ای گزارش شده بود که میزان اکسیژن 5 درصد از حدود 4 ساعت پس از قرار دادن در انکوباتور تا 192 ساعت ( 7 روز) ثابت می‌ماند، ما از هیپوکسی مزمن استفاده نمودیم و سلول‌های گروه اکسیژن 5% به مدت هفت روز در انکوباتور نگهداری شدند (27).
به منظور بررسی بنیادینگی سلول‌های بنیادی در این تحقیق به بررسی بیان ژن‌های، HOXB4 ، c-Myc Nanog و SOX2 پرداختیم.
نتایج مطالعه ما نشان داد بیشترین بیان ژن‌های بنیادینگی (HOXB4, c-Myc, Nanog, SOX2) در شرایط هم کشتی همراه با سیتوکاین‌ها در غلظت اکسیژن 5 درصد بود که می‌تواند نقش مهمی در افزایش خودنوسازی HSC داشته باشد. در گروه سلول‌های مزانشیمی و سیتوکاین با غلظت اکسیژن 21 درصد بیان ژن‌ها بالاتر از بیان آن در شرایط کشت سیتوکاین به تنهایی و سلول مزانشیمی به تنهایی بود.
نتایج ما نشان داد که با وجود تکثیر بیشتر HSC در گروه سیتوکاین به تنهایی، بیان ژن‌های بنیادینگی در این گروه نسبت به سایر گروه‌ها پایین‌تر بود. از آن‌جا که سیتوکاین‌ها باعث پیشروی تمایز به سلول‌های بالغ‌تر می‌شوند، بنابراین در شرایط کشت سیتوکاین به تنهایی بیان مارکرهای مرتبط با خودنوسازی کاهش می‌یابد. مطالعه‌های متعددی گزارش کرده‌اند که سیتوکاین‌ها مانند GM-CSF، IL-3، SCF و TPO موجب افزایش تکثیر HSC موشی و انسانی می‌شود اما با افزایش سریع ROS در سلول‌ها نیز همراه هستند (28). به نظر می‌رسد که هم کشتی با MSC از عوارض جانبی ROS کاسته و باعث حفظ بهتر خودنوسازی HSC می‌شود. علت انتخاب ژن HOXB4 به عنوان مارکر بنیادینگی HSC این بود که HOXB4 یکی از مهم‌ترین تنظیمکنندههای خودنوسازی HSC می‌باشد (29). در سلول‌های بنیادی بیان می‌شود و سپس در طی تمایز در انسان و موش کاهش بیان می‌یابد (31، 30). مطالعه‌های متعددی نشـان داده‌اند که HOXB4 باعث تکثیر ex vivo و in vivo HSCs می‌شود (34-32).
در غیاب c-Myc تمایز HSC به سمت پروژنیتورهای تعهد یافته مهار می‌شـود، بـرعکـس افزایش بیان اجباری c-Myc درHSC منجر به افزایش خودنوسازی در شروع تمایز می‌گردد (35). این‌ها پیشنهاد می‌کند که c-Myc باعث کنترل تمایز اولیه LT-HSC در in vivoمی‌شود و حذف ژنی c-Myc منجر به پان‌سیتوپنی و مرگ HSC و آپوپتوز به علت تجمع مولکول گرانزیم B (Granzyme B) می‌شود (36). بنابراین c-Myc باعث کنترل فعالیت عملکردی HSC مثل پرولیفراسیون و بقا و تمایز آن می‌شود. نتایج مطالعه‌های مختلف نشان داده است c-Myc با HIF-1α در تعامل است (37). c-Myc باعث حفظ خودنوسازی HSC در پایین دست سیگنالینگ Notch و HOXB4 می‌شود.
مطالعه‌ای تاکنون به بررسی بیان ژن‌های بنیادینگی در سلول‌های CD34+ خون بند ناف در شرایط غلظت اکسیژن 5 درصـد نپـرداختـه است امـا بیـان ایـن ژن‌هـا در سایــر
سلول‌های بنیادی مورد ارزیابی قرار گرفته است:
در سلول‌های بنیادی رویانی تیمار شده با اکسیژن 2 درصد، ژن‌های Nanog ، SOX2 افزایش بیان داشتند. مجموعه Nanog ، SOX2 ، OCT4 باعث مهار ژن‌های درگیر در تمایز می‌شوند. حذف ژنی HIF2α که OCT4 را هدف قرار می‌دهد، باعث مهار تکثیر سلول‌های بنیادی رویانی می‌شود. با افزایش غلظت O2 میزان بیان مارکرهای SOX2 ، Nanog ، OCT4 در سلول‌های ESC کاهش می‌یابد (38).
در مطالعه‌ای در کشت سلول‌های شبه فیبروبلاست بافت چربی (ASC : Adipose-derived stromal/stem cells) در غلظت اکسیژن 2 درصد، میزان بیان ژن‌های Sox2 و Nanog به ترتیب 25/1 و 39/1 برابر بالاتر از نرموکسی بود و غلظت اکسیژن 2 درصد پرولیفراسیون ASC را تا 10 روز افزایش داد (39).
در مطالعه‌ای دیگر سلول‌های بنیادی رویانی مشتق از امبریوی (Embryo) 8 سلوله در اکسیژن 5 درصد پلوری پوتنسی بهتری را حفظ کردند (40). اکسیژن 5 درصد، باعث ورود مجدد سلول‌های متعهد به سمت پلوری پوتنسی می‌شود (در اکسیژن 2 درصد).
آن چه که مشخص است این است که نیچ هیپوکسیـک
HSC از طریق القای ژن‌های مهاری چرخه سلول باعث خاموشی می‌شود. اکسیژن 5% هم‌چنین با کاهش فعالیت متابولیکی و محافظت HSC ها از آسیب ناشی از ROS باعث حفظ HSC ها در طول زندگی می‌گردد، بنابراین قرار گرفتن در شرایط اکسیژن 5% می‌تواند بر حفظ بنیادینگی این سلول‌ها تأثیر مثبت داشته باشد.
نتیجه‌گیری
مکانیسم درگیر در سرنوشت HSC ، خاموشی و تمایز آن در انسان هنوز به طور کامل شناخته نشده است. مسلماً طراحی سیستم کشت in vitro ای که به طور دقیق تعاملات HSC را نشان دهد، ارزش بالایی دارد و می‌تواند جایگاهی مناسب برای بررسی اثرات داروهای مختلف بر HSC قبل
از آزمایش‌ها در مدل حیوانی باشد. تاکنون روش‌های مختلفی برای کشت HSC انجام شده است هدف همه این روش‌ها تکثیر HSC اولیه و نابالغ و تقلید نیچ است.
اکسیژن 5 درصد یک روش کارآمد برای تکثیر در شرایط آزمایشگاهی HSC می‌باشد. نقش حمایتی رشد HSC خون بند ناف در هم‌کشتی با سلول‌های مزانشیمی در شرایط اکسیژن 5 درصد به طور قابل توجهی افزایش یافت. ژن‌های مؤثر در بنیادینگی و خودنوسازی در شرایط اکسیژن 5 درصد افزایش بیان داشت. روی هم‌رفته، نتایج حاصل از سیستم هم‌کشتی و اکسیژن 5 درصد می‌تواند به ما در درک نقش واقعی هیپوکسی به عنوان فاکتور مهم نیچ و پتانسیل حمایت سلول‌های استرومایی برای پروژنیتورهای خونساز و فعالیت سلول‌های بنیادی کمک کند.
حمایت مالی
این تحقیق برگرفته از رساله مقطع دکترای دانشگاه تربیت مدرس می‌باشد.
ملاحظات اخلاقی
این تحقیق توسط کمیته اخلاق دانشگاه تربیت مدرس با شماره 4506 مجوز گرفته است.
عدم تعارض منافع
نویسندگان اظهار می‌کنند هیچ‌گونه تعارض منافعی در این مطالعه وجود نداشته است.
نقش نویسندگان
دکتر فاطمه محمد علی: طراحی تحقیق، انجام آزمایش‌ها و نگارش پیش‌نویس مقاله
دکتر سعید آبرون: راهنمایی درخصوص انجام آزمایش‌ها و ویرایش مقاله
دکتر امیر آتشی:
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
