جلد 21، شماره 1 - ( بهار 1403 )
جلد 21 شماره 1 صفحات 20-9 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Samiee M, Chegini A, Shahabi M, Teimourpour A. A survey of association between TMPRSS6 gene polymorphism (rs855791 V736A) and biochemical indicators
of iron in male regular blood donors of Tehran transfusion center. Journal of Iranian Blood Transfusion 2024; 21 (1) :9-20
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1523-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1523-fa.html
سمیعی محمد پویا، چگینی آزیتا، شهابی مجید، تیمورپور امیر. ارتباط بین پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی (rs855791 V736A) ژن TMPRSS6 با میزان شاخص‌های بیوشیمیایی آهن در اهداکنندگان مستمر مرد پایگاه اهدای خون تهران. فصلنامه پژوهشی خون. 1403; 21 (1) :9-20
استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
متن کامل [PDF 771 kb]
(457 دریافت)
| چکیده (HTML) (1152 مشاهده)
مقدمه
اهداکنندگان خون در سازمان انتقال خون بسیار با اهمیت هستند و نگهداری آن‌ها در چرخه اهدا بسیار مهم است. به طور کلی اهداکنندگان خون در سه گروه اهداکنندگان بار اول، با سابقه و مستمر طبقه‌بندی می‌شوند (1). نزدیک به ۷۰ درصد خونهای اهدایی از اهداکنندگان مستمر دریافت می‌شود و مطالعه‌های متعدد نشان دادند که اهداکنندگان مستمر میزان آلودگیهای خونی کمتری نسبت به اهداکنندگان بار اول و با سابقه دارند (2). یک واحد خون (۴۵۰ میلی‌لیتر) حاوی نزدیک به ۲۵۰ میلیگرم آهن است که حدود ۳۰ درصد از میانگین ذخایر آهن بدن را در مردان و نزدیک به ۸۰ درصد را در زنان شامل می‌شود (3).
آهن یک عنصر ضروری برای تولید هموگلوبین است که نقش مهمی در حمل اکسیژن به سراسر بدن ایفا می‌کند. کم‌خونی فقرآهن معمولاً به دلیل کمبود آهن در بدن ایجاد می‌شود. کم‌خونی فقرآهن یکی از رایج‌ترین انواع کم‌خونی است که در جوامع سراسر دنیا رخ می‌دهد. مطالعه‌ها نشان می‌دهد که در برخی از گروه‌های جمعیتی در ایران، شیوع کم‌خونی فقرآهن بالا است. از جمله عواملی که می‌تواند به افزایش شیوع این نوع کم‌خونی در ایران کمک کند، مصرف غذاهای کم آهن، عدم تنوع تغذیه، بارداری‌های پیاپی و شرایط اقتصادی ضعیف می‌باشد (5، 4).
جوادزاده شهشهانی و همکاران در سال 2005 مطالعه‌ای به منظور بررسی شیوع فقرآهن و عوامل مرتبط با آن در اهداکنندگان خون در مرکز انتقال خون یزد انجام دادند. آن‌ها کاهش ذخایر آهن را در 48 درصد اهداکنندگان مستمر مرد مشاهده کردند. شیوع فقر آهن در اهداکنندگان مستمر مرد 28 درصد بود، در حالی که 16 درصد از این اهداکنندگان کم‌خونی فقرآهن داشتند (6).
تفاوت‌های ژنتیکی نیز ممکن است بر کمبود آهن در اهداکنندگان مستمر خون تأثیرگذار باشند. به عبارت دیگر، وجود تنوع ژنتیکی در افراد می‌تواند باعث شود که برخی از افراد در معرض کمبود آهن بیشتری قرار بگیرند. تحقیقات نشان داده است که برخی ژن‌ها و متغیرهای ژنتیکی می‌توانند نقش مهمی در جذب، نگهداری و استفاده
از آهـن تـوسط بدن داشته باشند. برخی از این ژن‌ها شامل
ژن‌هایی هستند که در فعالیت‌های مرتبط با جذب و انتقال آهن در خون نقش دارند (7).
وجود تفاوت‌های ژنتیکی متعدد در ژنهای دخیل در متابولیسم آهن در انسان، سهم ژنتیک در کمبود آهن را محتمل می‌سازد (8). بررسی‌ها در سال 2020 نشان‌دهنده کاهش آهن در اهداکنندگان مستمر خون بود (3). مطالعه‌ای در سال 2021، نشان داد که افزایش دفعات اهدای خون با کاهش هموگلوبین و میزان فریتین مرتبط است (9). هم‌چنین در سال 2013، دانشمندان یافته‌های هماتولوژیک، سطح فریتین سرم و تعداد دفعات اهدا را با وضعیت جهش ژن HIF-1α مقایسه کردند و نشان دادند که پلی‌مورفیسم HIF1-α (Pro-582-Ser) ، اهداکنندگان مستمر خون را از ابتلا به فقرآهن و کم‌خونی محافظت می‌کند (10). پروتئینهای اصلی درگیر در کنترل آهن عبارتند از ترانسفرین (Tf) و گیرنده ترانسفرین (TFR1) برای انتقال و استفاده از آهن، فریتین برای ذخیره‌سازی و هپسیدین (HAMP) برای کنترل و هماهنگی این فرآیندها (11).
چندین واریانت ژنتیکی در ژنهای تنظیم‌کننده آهن با عدم تعادل در هموستاز آهن مرتبط هستند که می‌توانند باعث کمبود آهن شوند. واریانت‌های ژنتیکی منجر به آهن اضافی بدن عمدتاً در ژن هموکروماتوز (HFE) رخ میدهند، اما در ژنهای هپسیدین (HAMP)، گیرنده ترانسفرین ۲ (TFR2)، کدکننده فروپورتین صادرکننده آهن سلولی (SLC40A1) ، هموژوولین (HJV) و TF نیز دیده می‌شوند. این جایگاه‌ها نقش مهمی در مسیرهای هموستاز آهن دارند. به عنوان مثال، هپسیدین جذب و آزادسازی آهن را تنظیم می‌کند. پلی‌مورفیسم‌های ژنتیکی در ژنهای دخیل در مسیر سرکوب‌کننده هپسیدین مانند TMPRSS6، با میزان پایین آهن و وضعیتی که به عنوان کم‌خونی فقرآهن مقاوم به درمان با آهن شناخته می‌شود، مرتبط است. انواع ژنتیکی TMPRSS6 می‌تواند منجر به درجات مختلف کمبود آهن و کم‌خونی شود. علاوه بر این، پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی (SNP) در ژن ترانسفرین (TF)، بر میزان آهن تاثیر می‌گذارند و منجر به کمبود آهن می‌شوند (12).
نظر به اهمیت اهداکنندگان خون درسازمان انتقال خـون
و نگهداری آن‌ها در چرخه اهدای خون بر آن شدیم تا به بررسی تفاوت‌های ژنتیکی ژنهای تنظیم‌کننده آهن در اهداکنندگان خون بپردازیم تا با تشخیص واریانت ژنتیکی در ژنهای تنظیم‌کننده آهن در اهداکنندگان مستمر ایرانی بتوانیم به ارتباط بین تفاوت‌های ژنتیکی ژنهای تنظیم کننده آهن پی ببریم و از آن در الگوریتم‌های اهدای خون استفاده نموده و اهداکنندگان مستمر را در چرخه اهدا حفظ نماییم.
مواد و روش‌ها
این مطالعه مقطعی از بهمن 1401 تا فروردین 1402 در مرکز انتقال خون تهران اجرا شد. ۱۳۰ اهداکننده مرد مستمر خون به صورت تصادفی وارد مطالعه شدند. حجم نمونه با استفاده از نرم‌افزار G*power (http://www.gpower.hhu.de) و تحت آزمون کای‌دو محاسبه گردید. برای محاسبه حجم نمونه با در نظر گرفتن یک جدول 2 در 3 که یکی وضعیت سطح آهن (و سایر شاخص‌های مورد نظر مطالعه) در دو سطح (طبیعی و غیر طبیعی) و متغیر دیگر پلی‌موفیسم با سه سطح TT، TC و CC بود در نظرگرفته شد، در نتیجه درجه آزادی مورد نظر برابر 2 خواهد بود. با در نظر گرفتن سطح معناداری 05/0 و توان 95 درصد و اندازه اثر متوسط (35/0 W=)، حداقل حجم نمونه مورد نیاز برابر 130 محاسبه گردید. تمامی داده‌های جمع‌آوری شده به وسیله نرم‌افزار R (https://www.r-project.org) تحت تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. برای توصیف متغیرهای کمی از شاخص‌های میانگین و انحراف معیار و برای توصیف متغیرهای کیفی از فراوانی و درصد فراوانی استفاده شد. برای مقایسه میانگین بیش از دو گروه از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه استفاده شد. سطح معناداری در این مطالعه 05/0 در نظرگرفته شده است.
معیارهای ورود به مطالعه، اهداکننده مستمـر خـون بـر
اساس تعریف سازمان انتقال خون ایران (حداقل 2 بار اهدای خون در طی یک سال گذشته) و سابقه حداقل 5 اهدای موفق خون طی 3 سال گذشته بودند. با توجه به تفاوت‌های هورمونی و از دست دادن خون در طول قاعدگی و بارداری، زنان در معرض خطر کم خونی فقر آهن هستند، لذا فقط اهداکنندگان مستمر مرد وارد این مطالعه شدند. به دلیل تاثیر کاذب التهاب برروی پارامترهای مورد اندازه‌گیری، معیار خروج از مطالعه نتیجه آزمایش CRP مثبت اهداکنندگان در نظر گرفته شد.
بعد از دریافت رضایت نامه از 130 نفر از اهداکنندگان، 4 میلی‌لیتر خون در لوله‌های CBC حاوی EDTA و 6 میلی‌لیتر خون در لوله‌های لخته ژل‌دار دریافت شد تا پارامترهای مختلف از جمله آزمایش CBC و آزمایش‌های مربوط به بررسی میزان آهن بدن از جمله سطح فریتین، سطح سرمی آهن، TIBC و TSAT اندازه‌گیری شوند.
آزمایش CBC با استفاده از دستگاه شمارش سلول‌های خونی Sysmex K1000 انجام شد. آزمایش‌های شاخص بیوشیمیایی آهن سرم و TIBC به ترتیب با کیت تعیین کمی آهن سرم و کیت تعیین کمی TIBC شرکت دلتا درمان پارت با دستگاه Hitachi Automatic Analyzer 912 و آزمایش فریتین با کیت اندازه‌گیری فریتین شرکت پیشتاز طب به روش الایزا انجام شد. از روش کالریمتری (Ferrozine) برای اندازه‌گیری میزان آهن استفاده شد که این روش بر اساس تشکیل یک کمپلکس رنگی بین آهن (Fe2+) و فروزین (Ferrozine) بود. از روش مستقیم (Direct) برای اندازه‌گیری میزان TIBC استفاده شد. اساس این روش اتصال آهن به رنگ در مرحله اول و در مرحله بعد ترانسفرین با جدا کردن آهن از کمپلکس آهن- رنگ به سرعت به آن متصل می‌شود. میزان کاهش مشاهده شده در جذب کمپلکس آهن- رنگ به طور مستقیم متناسب با میزان TIBC سرم است. اساس کیت فریتین به روش ساندویچ و با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال بود که حساسیت (ng/mL 1) و اختصاصیت (حدود 98 درصد) داشت. هم‌چنین مقادیر TSAT با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:
تشخیـص کـم خـونـی فقـر آهـن معمـولاً از طریــق ندازه‌گیری سطح هموگلوبین، میزان آهن سرم و TIBC انجام می‌شود. اندازه‌گیری سطح فریتین سرم نیز معمولاً بـه
عنوان نشانـه‌ای از ذخیـره آهـن بـدن در نظر گرفته می‌شود.
مقادیر مرجع شاخص های ارزیابی آهن در جدول گزارش شده است (جدول 1). برای شاخص های آهن و فریتین مقادیر کمتر از مرجع به عنوان کمبود آهن و مقادیر بیشتـر از مـرجع به عنوان اضافه بار آهن در نظر گرفته شد.
برای استخراج DNA از نمونه‌های خون از محلول‌های استخراج DNAخون کامل سازمان انتقال خون استفاده شد. این کیت بر اساس روش ستونی (column) می‌باشد که برای استخراج سریع DNA ژنومی از خون کامل، پلاسما و گلبول‌های سفید خون طراحی شده است.
برای اطمینان از کیفیت نمونه‌های استخراج شده، باید غلظت DNA استخراج شده مورد بررسی قرار گیرد. به این منظور، از دستگاه نانودراپ و طول موج 260 و 280 نانومتر استفاده شد. 2 میکرولیتر از نمونه استخراج شده را بر روی دستگاه قرار داده و غلظـت آن در طـول مـوج 2۶0 و 280 نانومتر مورد بررسی قرار گرفت. تعیین غلظت و کیفیت DNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ نشان‌دهنده کیفیت و کمیت مطلوب نمونه‌ها بود.
از نرم‌افزار Primer BLAST سایت NCBI بـرای طراحی آغازگر استفاده شد. پـس از طراحی آغازگرهای مورد نظر، اختصاصی بودن آغازگرها مورد بررسی قرار گرفت تا اطمینان حاصـل شود که آغازگرهای طراحی شده فقط قطعه مورد نظر را تکثیر خواهند کرد. برای این منظور به سایت NCBI مراجعه کرده و به بخش BLASTو سپس به Nucleotide Blast مراجعه شد. بـر ایـن اساس آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر قسمتی از ژن که حاوی پلی‌مورفیسم‌های مورد نظر بود طراحی و بررسی شد. تعدادی نمونه با این آغازگرها و با روش PCR معمولی تکثیر شده و محصول PCR تعیین توالی شد. پس از بررسی تعیین توالی، از این نمونه‌ها به عنوان کنترل استفاده شد.
برای شناسایی پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) در ژن TMP RSS6 (rs855791 V736A) از روش PCR ویژه آلل (Allele Specific PCR) استفاده شد. روش‌های متعددی برای انجام PCR وجود دارد که با اصلاحات کوچک در مراحل ابتدایی آن‌ها، جهت دستیابی به اهداف خاص طراحی و به کار گرفته می‌شوند. یکی از این روش‌ها، روش آلل خاص PCR (ASP) است. در واقع، این روش بر اساس تفاوت‌های نوکلئوتیدی در انتهای 3′ آغازگرها، جهت تمایز آلل‌های مختلف توسعه یافته است و امکان تشخیص تغییر یک نوکلئوتید یا پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی را فراهم می‌کند. در این روش، دو واکنش PCR با استفاده از یک الگو اجرا می‌شوند. در واکنش اول، از آغازگری استفاده می‌شود که تنها توانایی تکثیر یک آلل را دارد، در حالی که در واکنش دوم از آغازگر اختصاصی آلل دیگر استفاده می‌شود.
بعد از اتمام PCR محصول تکثیر شده بر روی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز شد. در جداول زیر مقادیر اجزای مخلوط PCR و برنامه زمانی و دمایی واکنش PCR برای آلل‌های T و C پلی‌مورفیسم rs855792 ذکر شده است (جداول 6-2).
یافته‌ها
میانگین سنی اهداکنندگان مستمر مورد مطالعه 45 سال با انحراف معیار 5/10 بود. نتیجه آزمایش CRP برای تمامی نمونه‌های مورد بررسی منفی بود. بنابراین تعداد 130 نفر از اهداکنندگان مستمر مرد مراجعه‌کننده به پایگاه انتقال خون تهران، وارد مطالعه شدند. از بین اهداکنندگان 28 نفر (54/21 درصد) حامل آلل هموزیگوت T/T، 29 نفر (31/22 درصد) حامل آلل هموزیگوت C/C و 73 نفر (15/56 درصد) حامل آلل هتروزیگوت C/T بودند (نمودار 1). توزیع فراوانی ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) در جدول گزارش شده است (جدول 7):
نتایج تجزیه و تحلیل Allele specific PCR برای تعدادی از نمونه‌ها در شکل آمده است (شکل‌های 1 و 2).
مقایسه میانگین نتایج آزمایش CBC و نتایج آزمایش‌های اندازه‌گیری میزان آهن در سه گروه از ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) به ترتیب در جداول 3 و 4 گزارش شده است. با توجه به نتایج جدول 3 ، ارتباط معناداری
بین پارامترهای خونی و واریانت‌های ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) مشاهده نشد. هم‌چنین با توجه به نتایج جدول 4 رابطه معناداری بین پارامترهای آهن سرم، فریتین، TIBC و TSAT و واریانت‌های ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) مشاهده نشد (جدول 8).
بحث
از بین130 اهداکننده مستمر، 28 نفر (54/21 درصد) حامل آلل هموزیگوت T/T، 29 نفر (31/22 درصد) حامل آلل هموزیگوت C/C و 73 نفر (15/56 درصد) حامل آلل هتروزیگوت C/T بودند. در این مطالعه رابطه معنادار آماری بین ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) و شاخص‌های اندازه‌گیری شده مشاهده نشد.
آهن یک عنصر مهم در بدن انسان است که نقش مهمی در عملکرد سلول‌ها و سیستم‌های بدن دارد. میزان آهن در بدن باید در محدوده مناسبی باشد تا عملکرد صحیح بدن حفظ شود. آهن در بدن انسان نقش حیاتی در فرآیندهای بیولوژیکی از جمله حمل اکسیژن در بدن، تولید انرژی، ساختن و عملکرد آنزیم‌ها دارد. هم‌چنین، آهن در ساخت هموگلوبین، پروتئینی که در گلبول‌های قرمز خون وجود دارد و مسئول حمل اکسیژن به اعضا و بافت‌ها است، نقش کلیدی دارد. میزان آهن مورد نیاز بدن، تحت تأثیر عوامل متعددی مانند سن، جنسیت، وضعیت بارداری و شیردهی، وضعیت سلامت عمومی و عادات غذایی قرار می‌گیرد (14، 13). مطالعه‌ها نشان می‌دهد که در برخی از گروه‌های جمعیتی در ایران، شیوع کم‌خونی فقرآهن بالا است. عواملی همانند مصرف غذاهای کم آهن، عدم تنوع تغذیـه،
بارداری‌های پیاپی و شرایط اقتصادی ضعیف، می‌تواند به افزایش شیوع این نوع کم‌خونی در ایران کمک کند (5، 4). اهدای یک واحد خون (حدود ۵۰۰ میلی‌لیتر) باعث افت ۲۵۰ میلی‌گرمی آهن در بدن می‌شود. این موضوع یک نگرانی مهم در حوزه بهداشت عمومی در کشورهای در حال توسعه است که کمبود آهن و کم‌خونی عارضه‌ای رایج در جمعیت عمومی آن‌ها محسوب می‌شود. شناسایی عوامل قابل پیش بینی کاهش میزان آهن می‌تواند به مراکز جذب اهداکنندگان خون کمک کند تا گروه‌های در معرض خطر را از اهدای خون مستثنی کرده و این افراد را از Sideropenia در دوره پس از اهدای خون محافظت کند (15).
مطالعه‌های زیادی بر روی تاثیر پلی‌مورفیسم‌های ژنتیکی مختلف روی میزان آهن بدن اهداکنندگان خون انجام شده است. جاکو و همکاران ارتباط بین 82 واریانت ژنتیکی با سطح آهن بدن در 48 اهداکننده مستمر خون را بررسی کردند. تنها واریانت rs8177181، به طور آماری ارتباط معنادار با سطح فریتین پلاسما داشت. آلل‌های هتروزیگوت این واریانت ژنتیکی به طور معناداری اثر مثبتی بر سطح فریتین داشت (16).
سورنسن و همکـاران تأثیـر شـــش پلی‌مورفیسم تک
نوکلئوتیدی بر سطح فریتین در ۱۴۱۲۶ نفر از اهداکنندگان خون در چهار ژن را مورد بررسی قرار دادند (17). مست و همکاران در 775 نفر از اهداکنندگان ارتباط چهار واریانت ژنتیکی با متابولیسم آهن را بررسی کردند (18). در مطالعه حاضر ارتباط بین پلی‌مورفیسم ژنتیکی rs855791 که از فراوانی زیادی در جمعیت برخوردار است با میزان شاخص‌های بیوشیمیایی آهن شامل میزان آهن سرم، فریتین، TIBC و میزان اشباع ترانسفرین در 130 اهداکننده مستمر خون مورد بررسی قرار گرفت.
پپتید کبدی هپسیدین نقش حیاتی در تعادل آهن از طریق کنترل جذب آهن رژیمی و آزادسازی آهن ماکروفاژ‌ها در انسان ایفا می‌کند. ماتریپتاز-2 که توسط ژن TMPRSS6 رمزگذاری می‌شود، یک سرین پروتئاز است که نقش مهمی در بیان هپسیدین و در نتیجه حفظ تعادل آهن دارد. مطالعه‌های ژنتیکی در انسان‌ها نشان داده‌اند که جهش‌های TMPRSS6 با آنمی فقرآهن مقاوم به درمان با آهن مرتبط هستند. اخیراً، GWASها چندین واریانت متداول در TMPRSS6 را شناسایی کرده‌اند که با غلظت‌های سرمی آهن و غلظت هموگلوبین در جمعیت‌هایی از نژاد اروپایی و آسیایی هندی مرتبط هستند. rs855791 یک پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی در دومین سرین پروتئاز شبیه تریپسین است که جزو واریانت‌های دارای بیشترین ارتباطات معنادار با غلظت هموگلوبین می‌باشد (19).
چندین مطالعه در مورد ارتباط ژن TMPRSS6 (rs855791) با میزان شاخص‌های آهن خون انجام شده است که نشان می‌دهد SNPهای ژن TMPRSS6 با سطوح آهن ارتباط دارند. گزارش‌های ابتدایی که بر اختلالات در متابولیسم آهن تمرکز داشتند، نشان دادند که جهش‌های نادر در TMPRSS6 باعث کمبود شدید آهن می‌شود (20). نتایج مطالعه‌های جهانی ژن نشان دادند که SNPهای متداول (از جمله rs855791) در TMPRSS6 با کاهش تغییرات شدید در سطح آهن سرم یا هموگلوبین (Hb) مرتبط هستند (22، 21). اخیراً، یک متا-آنالیز شامل داده‌های 14 مطالعه نشان داد که آلل T پلی‌مورفیسم rs855791 با میزان کمتری از فریتین در جمعیت‌های نژادی
مختلف مرتبط است (23).
نقش ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) در اهداکنندگان خون نیز بررسی شده است. در مطالعه سورنسن و همکاران در سال 2012 روی اهداکنندگان خون دانمارکی، هیچ ارتباطی بین ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) و کمبود آهن پیدا نشد و آن‌ها نتایجی مشابه با مطالعه حاضر گزارش کردند(24) ولی از آن جایی که مطالعه اولیه آن‌ها قدرت آماری کافی برای شناسایی اثرات کوچک اما مرتبط با بالین ژنوتیپ‌های مورد مطالعه نداشت، تجزیه و تحلیل را در جمعیت بزرگتری از اهداکنندگان تکرار کردند. سورنسن و همکاران در سال 2016 تاثیر 6 پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی از جمله rs855791 بر میزان فریتین خون در 14126 اهداکننده خون را بررسی کردند. ودر مطالعه دومشان آن‌ها نشان دادند که در مردان، آلل T پلی‌مورفیسم rs855791 در ژن TMPRSS6 با سطوح پلاسمایی کمتری از فریتین مرتبط بود. نتایج مطالعه دوم آن‌ها تأیید کرد که حاملان آلل T پلی‌مورفیسم rs855791 خطر بالاتری از کمبود آهن دارند، آن‌ها مشاهده کردند که این ژنوتیپ تأثیر قابل‌توجهی بر سطح فریتین تنها در میان اهداکنندگان خون مرد دارد. با این حال، این ژنوتیپ خطر کمبود آهن را افزایش نداد (17). یافته‌های مست و همکاران برروی rs855791 در سه گروه اهداکننده خون آمریکایی در مطالعه REDS-III در گروهای مختلف زن ومرد و اهداکننده باراول ومستمر بررسی شد و مشاهده کردند که سطوح فریتین سرمی در ژنوتیپ‌های زنان، اما نه مردان، متغیر است. در مطالعه REDS-III، اهداکنندگان خون هموزیگوت برای آلل C پلی‌مورفیسم rs855791 سطوح میانگین فریتین 76 درصد بالاتر از اهداکنندگان خون هموزیگوت برای آلل T بودند، در حالی که حاملان هتروزیگـوت 53 درصد بیشتـر از سطـوح فریتیـن داشتنـد
(18).
در مطالعه حاضر رابطه معنادار آماری بین ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) و شاخص‌های بیوشیمیایی مشاهده نشد که می‌تواند به دلیل محدودیت در تعداد افراد مورد مطالعه و تفاوت‌های نژادی در جمعیت‌های مورد نظر باشد. به دلیل محدودیت در منابع مالی و بودجه، تعداد اهداکنندگان کمی وارد این مطالعه شدند و تعداد نمونه‌های موجود در این مطالعه ممکن است بر توانایی تعمیم‌پذیری نتایج به جمعیت کلی تأثیر گذاشته باشد. هم‌چنین متغیرهایی مانند عوامل محیطی، عادات و رفتارهای اهداکننده، تغذیه و مسائل بهداشتی که ممکن است بر شاخص‌های آهن تأثیر داشته باشند، در این مطالعه درنظر گرفته نشده‌اند.
نتیجه‌گیری
کمبود آهن و تعادل منفی آهن پس از اهدای خون به عنوان مسأله‌ای مهم و قابل توجه در حوزه بهداشت عمومی در جوامع در حال توسعه باید مورد توجه قرار گیرد. تشخیص و مدیریت دقیق‌تر این وضعیت در اهداکنندگان خون می‌تواند بهبود سلامت و کیفیت زندگی این افراد را تضمین کند و در نهایت، اثر مثبتی بر کمبود آهن و کم‌خونی فقرآهن در جوامع مورد نظر ایجاد کند. در این مطالعه، ارتباط ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) با وضعیت آهن بررسی شد. نتایج این مطالعه نشان داد که پلی‌مورفیسم فوق با سطح آهن و کمیت‌های مرتبط با آن ارتباط ندارد. با توجه به اهمیت اهدای خون و نقش آن در انتقال خون و مراقبت از بیماران، شناسایی افرادی که در معرض خطر کاهش میزان آهن قرار دارند، امری اساسی است. این شناسایی می‌تواند به مراکز جذب اهداکنندگان خون کمک کند تا به‌طور دقیق‌تر گروه‌های در معرض خطر را تشخیص داده و اقدامات مناسبی را برای حفاظت از این افراد در دوره پس از اهدای خون انجام دهند.
پیشنهادات
برای تأیید دقیق‌تر و تعمیم‌پذیری نتایج، می‌توان مطالعه‌هایـی بـا حجـم نمونه‌هـای بزرگتـر و متنوع‌تــر در
جمعیت‌ها انجام داد. این اقدام می‌تواند به تجزیه و تحلیل دقیق‌تر ارتباط‌ها و تأثیرات تعدیل‌کننده در نظر گرفته شده کمک کند. با وجود نتایج متناقض در برخی موارد، این پژوهش مبنایی قوی برای ادامه تحقیقات در زمینه ارتباط بین پلی‌مورفیسم‌های ژنتیکی و تعادل آهن فراهم می‌کند. ادامه تحقیقات با توجه به تأثیرات ترکیبی این پلی‌مورفیسم‌ها و تعاملات مختلف میان عوامل مولکولی، مسیرهای متابولیسم آهن و شاخص‌های بیوشیمیایی ضروری به نظر می‌رسد.
حمایت مالی
این مطالعه بدون هیچ‌گونه حمایت مالی انجام شده است.
ملاحظات اخلاقی
این مقاله حاصل پایان نامه دانشجویی دوره کارشناسی ارشد رشته خون‌شناسی مرکز تحقیقـات مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون با کد اخلاق IR.TMI.REC.1401.021 می‌باشد.
عدم تعارض منافع
هیچ‌گونه تعارض منافعی در مطالعه حاضر وجود نداشته است.
نقش نویسندگان
محمد پویا سمیعی: انجام مراحل عملی، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج و تهیه پیش‌نویس مقاله
دکتر آزیتا چگینی: مدیریت و طراحی مطالعه، تفسیر نتایج و بازبینی و اصلاح پیش نویس مقاله
دکتر مجید شهابی: طراحی مطالعه، انجام مراحل عملی و تهیه پیش‌نویس مقاله
دکتر امیر تیمورپور: طراحی مطالعه، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج و اصلاح پیش‌نویس مقاله
تشکر و قدردانی
برای همکاری صمیمانه پرسنل بخش اهداکنندگان اداره کل انتقال خون استان تهران و مرکز تحقیقات انتقال خون کمال تشکر و قدردانی به عمل می‌آید.
متن کامل: (361 مشاهده)
ارتباط بین پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی (rs855791 V736A) ژن TMPRSS6
با میزان شاخص‌های بیوشیمیایی آهن در اهداکنندگان مستمر مرد پایگاه
اهدای خون تهران
محمد پویا سمیعی1، آزیتا چگینی2، مجید شهابی3، امیر تیمورپور4
چکیده
سابقه و هدف
اهداکنندگان مستمر به دلیل اهدای مکرر خون، ممکن است به کمبود آهن در بدن دچار شوند. تفاوت‌های ژنتیکی ممکن است بر کمبود آهن در اهداکنندگان مستمر خون تأثیرگذار باشند. برخی از این ژن‌ها شامل ژن‌هایی هستند که در فعالیت‌های مرتبط با جذب و انتقال آهن در خون نقش دارند. در مطالعه حاضر ارتباط پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) با میزان آهن در اهداکنندگان مستمر مرد مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
این مطالعه از نوع مقطعی بوده و 130 اهداکننده مستمر مرد در آن شرکت داشتند. آزمایش‌های CBC با استفاده از دستگاه Sysmex K1000 ، آهن سرم با استفاده از روش کالریمتری، فریتین با استفاده از روش الایزا و TIBC با استفاده از روش مستقیم بر روی نمونه خون آن‌ها انجام شد. ژنوتیپ پلی‌مورفیسم‌های مورد نظر با استفاده از روش Allele specific PCR تعیین شد. تمامی داده‌های جمع‌آوری شده به وسیله نرم افزار R تحت تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. سطح معناداری در این مطالعه 05/0 در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
میانگین سنی اهداکنندگان مستمر مورد مطالعه 45 سال با انحراف معیار 5/10 بود. از بین 130 نفر اهداکننده مستمر خون، 28 نفر (54/21 درصد) حامل آلل هموزیگوت T/T، 29 نفر (31/22 درصد) حامل آلل هموزیگوت C/C و 73 نفر (15/56 درصد) حامل آلل هتروزیگوت C/T بودند. ارتباط معنادار بین پلی‌مورفیسم rs855791 و شاخص‌های ارزیابی آهن مشاهده نشد.
نتیجه گیری
پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) با سطح آهن و کمیت‌های مرتبط با آن در اهداکنندگان مستمر خون ارتباط ندارد.
کلمات کلیدی: اهداکنندگان خون، کم خونی فقر آهن، پلی‌مورفیسم (ژنتیک)
تاریخ دریافت: 18/10/1402
تاریخ پذیرش: 04/11/1402
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: متخصص بیهوشی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- PhD فرآورده‌های بیولوژیک ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4- PhD آمار زیستی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
با میزان شاخص‌های بیوشیمیایی آهن در اهداکنندگان مستمر مرد پایگاه
اهدای خون تهران
محمد پویا سمیعی1، آزیتا چگینی2، مجید شهابی3، امیر تیمورپور4
چکیده
سابقه و هدف
اهداکنندگان مستمر به دلیل اهدای مکرر خون، ممکن است به کمبود آهن در بدن دچار شوند. تفاوت‌های ژنتیکی ممکن است بر کمبود آهن در اهداکنندگان مستمر خون تأثیرگذار باشند. برخی از این ژن‌ها شامل ژن‌هایی هستند که در فعالیت‌های مرتبط با جذب و انتقال آهن در خون نقش دارند. در مطالعه حاضر ارتباط پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) با میزان آهن در اهداکنندگان مستمر مرد مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
این مطالعه از نوع مقطعی بوده و 130 اهداکننده مستمر مرد در آن شرکت داشتند. آزمایش‌های CBC با استفاده از دستگاه Sysmex K1000 ، آهن سرم با استفاده از روش کالریمتری، فریتین با استفاده از روش الایزا و TIBC با استفاده از روش مستقیم بر روی نمونه خون آن‌ها انجام شد. ژنوتیپ پلی‌مورفیسم‌های مورد نظر با استفاده از روش Allele specific PCR تعیین شد. تمامی داده‌های جمع‌آوری شده به وسیله نرم افزار R تحت تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. سطح معناداری در این مطالعه 05/0 در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
میانگین سنی اهداکنندگان مستمر مورد مطالعه 45 سال با انحراف معیار 5/10 بود. از بین 130 نفر اهداکننده مستمر خون، 28 نفر (54/21 درصد) حامل آلل هموزیگوت T/T، 29 نفر (31/22 درصد) حامل آلل هموزیگوت C/C و 73 نفر (15/56 درصد) حامل آلل هتروزیگوت C/T بودند. ارتباط معنادار بین پلی‌مورفیسم rs855791 و شاخص‌های ارزیابی آهن مشاهده نشد.
نتیجه گیری
پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) با سطح آهن و کمیت‌های مرتبط با آن در اهداکنندگان مستمر خون ارتباط ندارد.
کلمات کلیدی: اهداکنندگان خون، کم خونی فقر آهن، پلی‌مورفیسم (ژنتیک)
تاریخ دریافت: 18/10/1402
تاریخ پذیرش: 04/11/1402
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: متخصص بیهوشی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- PhD فرآورده‌های بیولوژیک ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4- PhD آمار زیستی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه
اهداکنندگان خون در سازمان انتقال خون بسیار با اهمیت هستند و نگهداری آن‌ها در چرخه اهدا بسیار مهم است. به طور کلی اهداکنندگان خون در سه گروه اهداکنندگان بار اول، با سابقه و مستمر طبقه‌بندی می‌شوند (1). نزدیک به ۷۰ درصد خونهای اهدایی از اهداکنندگان مستمر دریافت می‌شود و مطالعه‌های متعدد نشان دادند که اهداکنندگان مستمر میزان آلودگیهای خونی کمتری نسبت به اهداکنندگان بار اول و با سابقه دارند (2). یک واحد خون (۴۵۰ میلی‌لیتر) حاوی نزدیک به ۲۵۰ میلیگرم آهن است که حدود ۳۰ درصد از میانگین ذخایر آهن بدن را در مردان و نزدیک به ۸۰ درصد را در زنان شامل می‌شود (3).
آهن یک عنصر ضروری برای تولید هموگلوبین است که نقش مهمی در حمل اکسیژن به سراسر بدن ایفا می‌کند. کم‌خونی فقرآهن معمولاً به دلیل کمبود آهن در بدن ایجاد می‌شود. کم‌خونی فقرآهن یکی از رایج‌ترین انواع کم‌خونی است که در جوامع سراسر دنیا رخ می‌دهد. مطالعه‌ها نشان می‌دهد که در برخی از گروه‌های جمعیتی در ایران، شیوع کم‌خونی فقرآهن بالا است. از جمله عواملی که می‌تواند به افزایش شیوع این نوع کم‌خونی در ایران کمک کند، مصرف غذاهای کم آهن، عدم تنوع تغذیه، بارداری‌های پیاپی و شرایط اقتصادی ضعیف می‌باشد (5، 4).
جوادزاده شهشهانی و همکاران در سال 2005 مطالعه‌ای به منظور بررسی شیوع فقرآهن و عوامل مرتبط با آن در اهداکنندگان خون در مرکز انتقال خون یزد انجام دادند. آن‌ها کاهش ذخایر آهن را در 48 درصد اهداکنندگان مستمر مرد مشاهده کردند. شیوع فقر آهن در اهداکنندگان مستمر مرد 28 درصد بود، در حالی که 16 درصد از این اهداکنندگان کم‌خونی فقرآهن داشتند (6).
تفاوت‌های ژنتیکی نیز ممکن است بر کمبود آهن در اهداکنندگان مستمر خون تأثیرگذار باشند. به عبارت دیگر، وجود تنوع ژنتیکی در افراد می‌تواند باعث شود که برخی از افراد در معرض کمبود آهن بیشتری قرار بگیرند. تحقیقات نشان داده است که برخی ژن‌ها و متغیرهای ژنتیکی می‌توانند نقش مهمی در جذب، نگهداری و استفاده
از آهـن تـوسط بدن داشته باشند. برخی از این ژن‌ها شامل
ژن‌هایی هستند که در فعالیت‌های مرتبط با جذب و انتقال آهن در خون نقش دارند (7).
وجود تفاوت‌های ژنتیکی متعدد در ژنهای دخیل در متابولیسم آهن در انسان، سهم ژنتیک در کمبود آهن را محتمل می‌سازد (8). بررسی‌ها در سال 2020 نشان‌دهنده کاهش آهن در اهداکنندگان مستمر خون بود (3). مطالعه‌ای در سال 2021، نشان داد که افزایش دفعات اهدای خون با کاهش هموگلوبین و میزان فریتین مرتبط است (9). هم‌چنین در سال 2013، دانشمندان یافته‌های هماتولوژیک، سطح فریتین سرم و تعداد دفعات اهدا را با وضعیت جهش ژن HIF-1α مقایسه کردند و نشان دادند که پلی‌مورفیسم HIF1-α (Pro-582-Ser) ، اهداکنندگان مستمر خون را از ابتلا به فقرآهن و کم‌خونی محافظت می‌کند (10). پروتئینهای اصلی درگیر در کنترل آهن عبارتند از ترانسفرین (Tf) و گیرنده ترانسفرین (TFR1) برای انتقال و استفاده از آهن، فریتین برای ذخیره‌سازی و هپسیدین (HAMP) برای کنترل و هماهنگی این فرآیندها (11).
چندین واریانت ژنتیکی در ژنهای تنظیم‌کننده آهن با عدم تعادل در هموستاز آهن مرتبط هستند که می‌توانند باعث کمبود آهن شوند. واریانت‌های ژنتیکی منجر به آهن اضافی بدن عمدتاً در ژن هموکروماتوز (HFE) رخ میدهند، اما در ژنهای هپسیدین (HAMP)، گیرنده ترانسفرین ۲ (TFR2)، کدکننده فروپورتین صادرکننده آهن سلولی (SLC40A1) ، هموژوولین (HJV) و TF نیز دیده می‌شوند. این جایگاه‌ها نقش مهمی در مسیرهای هموستاز آهن دارند. به عنوان مثال، هپسیدین جذب و آزادسازی آهن را تنظیم می‌کند. پلی‌مورفیسم‌های ژنتیکی در ژنهای دخیل در مسیر سرکوب‌کننده هپسیدین مانند TMPRSS6، با میزان پایین آهن و وضعیتی که به عنوان کم‌خونی فقرآهن مقاوم به درمان با آهن شناخته می‌شود، مرتبط است. انواع ژنتیکی TMPRSS6 می‌تواند منجر به درجات مختلف کمبود آهن و کم‌خونی شود. علاوه بر این، پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی (SNP) در ژن ترانسفرین (TF)، بر میزان آهن تاثیر می‌گذارند و منجر به کمبود آهن می‌شوند (12).
نظر به اهمیت اهداکنندگان خون درسازمان انتقال خـون
و نگهداری آن‌ها در چرخه اهدای خون بر آن شدیم تا به بررسی تفاوت‌های ژنتیکی ژنهای تنظیم‌کننده آهن در اهداکنندگان خون بپردازیم تا با تشخیص واریانت ژنتیکی در ژنهای تنظیم‌کننده آهن در اهداکنندگان مستمر ایرانی بتوانیم به ارتباط بین تفاوت‌های ژنتیکی ژنهای تنظیم کننده آهن پی ببریم و از آن در الگوریتم‌های اهدای خون استفاده نموده و اهداکنندگان مستمر را در چرخه اهدا حفظ نماییم.
مواد و روش‌ها
این مطالعه مقطعی از بهمن 1401 تا فروردین 1402 در مرکز انتقال خون تهران اجرا شد. ۱۳۰ اهداکننده مرد مستمر خون به صورت تصادفی وارد مطالعه شدند. حجم نمونه با استفاده از نرم‌افزار G*power (http://www.gpower.hhu.de) و تحت آزمون کای‌دو محاسبه گردید. برای محاسبه حجم نمونه با در نظر گرفتن یک جدول 2 در 3 که یکی وضعیت سطح آهن (و سایر شاخص‌های مورد نظر مطالعه) در دو سطح (طبیعی و غیر طبیعی) و متغیر دیگر پلی‌موفیسم با سه سطح TT، TC و CC بود در نظرگرفته شد، در نتیجه درجه آزادی مورد نظر برابر 2 خواهد بود. با در نظر گرفتن سطح معناداری 05/0 و توان 95 درصد و اندازه اثر متوسط (35/0 W=)، حداقل حجم نمونه مورد نیاز برابر 130 محاسبه گردید. تمامی داده‌های جمع‌آوری شده به وسیله نرم‌افزار R (https://www.r-project.org) تحت تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. برای توصیف متغیرهای کمی از شاخص‌های میانگین و انحراف معیار و برای توصیف متغیرهای کیفی از فراوانی و درصد فراوانی استفاده شد. برای مقایسه میانگین بیش از دو گروه از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه استفاده شد. سطح معناداری در این مطالعه 05/0 در نظرگرفته شده است.
معیارهای ورود به مطالعه، اهداکننده مستمـر خـون بـر
اساس تعریف سازمان انتقال خون ایران (حداقل 2 بار اهدای خون در طی یک سال گذشته) و سابقه حداقل 5 اهدای موفق خون طی 3 سال گذشته بودند. با توجه به تفاوت‌های هورمونی و از دست دادن خون در طول قاعدگی و بارداری، زنان در معرض خطر کم خونی فقر آهن هستند، لذا فقط اهداکنندگان مستمر مرد وارد این مطالعه شدند. به دلیل تاثیر کاذب التهاب برروی پارامترهای مورد اندازه‌گیری، معیار خروج از مطالعه نتیجه آزمایش CRP مثبت اهداکنندگان در نظر گرفته شد.
بعد از دریافت رضایت نامه از 130 نفر از اهداکنندگان، 4 میلی‌لیتر خون در لوله‌های CBC حاوی EDTA و 6 میلی‌لیتر خون در لوله‌های لخته ژل‌دار دریافت شد تا پارامترهای مختلف از جمله آزمایش CBC و آزمایش‌های مربوط به بررسی میزان آهن بدن از جمله سطح فریتین، سطح سرمی آهن، TIBC و TSAT اندازه‌گیری شوند.
آزمایش CBC با استفاده از دستگاه شمارش سلول‌های خونی Sysmex K1000 انجام شد. آزمایش‌های شاخص بیوشیمیایی آهن سرم و TIBC به ترتیب با کیت تعیین کمی آهن سرم و کیت تعیین کمی TIBC شرکت دلتا درمان پارت با دستگاه Hitachi Automatic Analyzer 912 و آزمایش فریتین با کیت اندازه‌گیری فریتین شرکت پیشتاز طب به روش الایزا انجام شد. از روش کالریمتری (Ferrozine) برای اندازه‌گیری میزان آهن استفاده شد که این روش بر اساس تشکیل یک کمپلکس رنگی بین آهن (Fe2+) و فروزین (Ferrozine) بود. از روش مستقیم (Direct) برای اندازه‌گیری میزان TIBC استفاده شد. اساس این روش اتصال آهن به رنگ در مرحله اول و در مرحله بعد ترانسفرین با جدا کردن آهن از کمپلکس آهن- رنگ به سرعت به آن متصل می‌شود. میزان کاهش مشاهده شده در جذب کمپلکس آهن- رنگ به طور مستقیم متناسب با میزان TIBC سرم است. اساس کیت فریتین به روش ساندویچ و با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال بود که حساسیت (ng/mL 1) و اختصاصیت (حدود 98 درصد) داشت. هم‌چنین مقادیر TSAT با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:
|
100 × = TSAT (%) |
|
Iron
TIBC |
تشخیـص کـم خـونـی فقـر آهـن معمـولاً از طریــق ندازه‌گیری سطح هموگلوبین، میزان آهن سرم و TIBC انجام می‌شود. اندازه‌گیری سطح فریتین سرم نیز معمولاً بـه
عنوان نشانـه‌ای از ذخیـره آهـن بـدن در نظر گرفته می‌شود.
مقادیر مرجع شاخص های ارزیابی آهن در جدول گزارش شده است (جدول 1). برای شاخص های آهن و فریتین مقادیر کمتر از مرجع به عنوان کمبود آهن و مقادیر بیشتـر از مـرجع به عنوان اضافه بار آهن در نظر گرفته شد.
برای استخراج DNA از نمونه‌های خون از محلول‌های استخراج DNAخون کامل سازمان انتقال خون استفاده شد. این کیت بر اساس روش ستونی (column) می‌باشد که برای استخراج سریع DNA ژنومی از خون کامل، پلاسما و گلبول‌های سفید خون طراحی شده است.
برای اطمینان از کیفیت نمونه‌های استخراج شده، باید غلظت DNA استخراج شده مورد بررسی قرار گیرد. به این منظور، از دستگاه نانودراپ و طول موج 260 و 280 نانومتر استفاده شد. 2 میکرولیتر از نمونه استخراج شده را بر روی دستگاه قرار داده و غلظـت آن در طـول مـوج 2۶0 و 280 نانومتر مورد بررسی قرار گرفت. تعیین غلظت و کیفیت DNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ نشان‌دهنده کیفیت و کمیت مطلوب نمونه‌ها بود.
از نرم‌افزار Primer BLAST سایت NCBI بـرای طراحی آغازگر استفاده شد. پـس از طراحی آغازگرهای مورد نظر، اختصاصی بودن آغازگرها مورد بررسی قرار گرفت تا اطمینان حاصـل شود که آغازگرهای طراحی شده فقط قطعه مورد نظر را تکثیر خواهند کرد. برای این منظور به سایت NCBI مراجعه کرده و به بخش BLASTو سپس به Nucleotide Blast مراجعه شد. بـر ایـن اساس آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر قسمتی از ژن که حاوی پلی‌مورفیسم‌های مورد نظر بود طراحی و بررسی شد. تعدادی نمونه با این آغازگرها و با روش PCR معمولی تکثیر شده و محصول PCR تعیین توالی شد. پس از بررسی تعیین توالی، از این نمونه‌ها به عنوان کنترل استفاده شد.
برای شناسایی پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) در ژن TMP RSS6 (rs855791 V736A) از روش PCR ویژه آلل (Allele Specific PCR) استفاده شد. روش‌های متعددی برای انجام PCR وجود دارد که با اصلاحات کوچک در مراحل ابتدایی آن‌ها، جهت دستیابی به اهداف خاص طراحی و به کار گرفته می‌شوند. یکی از این روش‌ها، روش آلل خاص PCR (ASP) است. در واقع، این روش بر اساس تفاوت‌های نوکلئوتیدی در انتهای 3′ آغازگرها، جهت تمایز آلل‌های مختلف توسعه یافته است و امکان تشخیص تغییر یک نوکلئوتید یا پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی را فراهم می‌کند. در این روش، دو واکنش PCR با استفاده از یک الگو اجرا می‌شوند. در واکنش اول، از آغازگری استفاده می‌شود که تنها توانایی تکثیر یک آلل را دارد، در حالی که در واکنش دوم از آغازگر اختصاصی آلل دیگر استفاده می‌شود.
بعد از اتمام PCR محصول تکثیر شده بر روی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز شد. در جداول زیر مقادیر اجزای مخلوط PCR و برنامه زمانی و دمایی واکنش PCR برای آلل‌های T و C پلی‌مورفیسم rs855792 ذکر شده است (جداول 6-2).
میانگین سنی اهداکنندگان مستمر مورد مطالعه 45 سال با انحراف معیار 5/10 بود. نتیجه آزمایش CRP برای تمامی نمونه‌های مورد بررسی منفی بود. بنابراین تعداد 130 نفر از اهداکنندگان مستمر مرد مراجعه‌کننده به پایگاه انتقال خون تهران، وارد مطالعه شدند. از بین اهداکنندگان 28 نفر (54/21 درصد) حامل آلل هموزیگوت T/T، 29 نفر (31/22 درصد) حامل آلل هموزیگوت C/C و 73 نفر (15/56 درصد) حامل آلل هتروزیگوت C/T بودند (نمودار 1). توزیع فراوانی ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) در جدول گزارش شده است (جدول 7):
نتایج تجزیه و تحلیل Allele specific PCR برای تعدادی از نمونه‌ها در شکل آمده است (شکل‌های 1 و 2).
مقایسه میانگین نتایج آزمایش CBC و نتایج آزمایش‌های اندازه‌گیری میزان آهن در سه گروه از ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) به ترتیب در جداول 3 و 4 گزارش شده است. با توجه به نتایج جدول 3 ، ارتباط معناداری
بین پارامترهای خونی و واریانت‌های ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) مشاهده نشد. هم‌چنین با توجه به نتایج جدول 4 رابطه معناداری بین پارامترهای آهن سرم، فریتین، TIBC و TSAT و واریانت‌های ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) مشاهده نشد (جدول 8).
|
60
50 40 30 20 10 0 |
|
درصد فراوانی
|
|
پلی‌مورفیسم
|
از بین130 اهداکننده مستمر، 28 نفر (54/21 درصد) حامل آلل هموزیگوت T/T، 29 نفر (31/22 درصد) حامل آلل هموزیگوت C/C و 73 نفر (15/56 درصد) حامل آلل هتروزیگوت C/T بودند. در این مطالعه رابطه معنادار آماری بین ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) و شاخص‌های اندازه‌گیری شده مشاهده نشد.
آهن یک عنصر مهم در بدن انسان است که نقش مهمی در عملکرد سلول‌ها و سیستم‌های بدن دارد. میزان آهن در بدن باید در محدوده مناسبی باشد تا عملکرد صحیح بدن حفظ شود. آهن در بدن انسان نقش حیاتی در فرآیندهای بیولوژیکی از جمله حمل اکسیژن در بدن، تولید انرژی، ساختن و عملکرد آنزیم‌ها دارد. هم‌چنین، آهن در ساخت هموگلوبین، پروتئینی که در گلبول‌های قرمز خون وجود دارد و مسئول حمل اکسیژن به اعضا و بافت‌ها است، نقش کلیدی دارد. میزان آهن مورد نیاز بدن، تحت تأثیر عوامل متعددی مانند سن، جنسیت، وضعیت بارداری و شیردهی، وضعیت سلامت عمومی و عادات غذایی قرار می‌گیرد (14، 13). مطالعه‌ها نشان می‌دهد که در برخی از گروه‌های جمعیتی در ایران، شیوع کم‌خونی فقرآهن بالا است. عواملی همانند مصرف غذاهای کم آهن، عدم تنوع تغذیـه،
بارداری‌های پیاپی و شرایط اقتصادی ضعیف، می‌تواند به افزایش شیوع این نوع کم‌خونی در ایران کمک کند (5، 4). اهدای یک واحد خون (حدود ۵۰۰ میلی‌لیتر) باعث افت ۲۵۰ میلی‌گرمی آهن در بدن می‌شود. این موضوع یک نگرانی مهم در حوزه بهداشت عمومی در کشورهای در حال توسعه است که کمبود آهن و کم‌خونی عارضه‌ای رایج در جمعیت عمومی آن‌ها محسوب می‌شود. شناسایی عوامل قابل پیش بینی کاهش میزان آهن می‌تواند به مراکز جذب اهداکنندگان خون کمک کند تا گروه‌های در معرض خطر را از اهدای خون مستثنی کرده و این افراد را از Sideropenia در دوره پس از اهدای خون محافظت کند (15).
مطالعه‌های زیادی بر روی تاثیر پلی‌مورفیسم‌های ژنتیکی مختلف روی میزان آهن بدن اهداکنندگان خون انجام شده است. جاکو و همکاران ارتباط بین 82 واریانت ژنتیکی با سطح آهن بدن در 48 اهداکننده مستمر خون را بررسی کردند. تنها واریانت rs8177181، به طور آماری ارتباط معنادار با سطح فریتین پلاسما داشت. آلل‌های هتروزیگوت این واریانت ژنتیکی به طور معناداری اثر مثبتی بر سطح فریتین داشت (16).
سورنسن و همکـاران تأثیـر شـــش پلی‌مورفیسم تک
نوکلئوتیدی بر سطح فریتین در ۱۴۱۲۶ نفر از اهداکنندگان خون در چهار ژن را مورد بررسی قرار دادند (17). مست و همکاران در 775 نفر از اهداکنندگان ارتباط چهار واریانت ژنتیکی با متابولیسم آهن را بررسی کردند (18). در مطالعه حاضر ارتباط بین پلی‌مورفیسم ژنتیکی rs855791 که از فراوانی زیادی در جمعیت برخوردار است با میزان شاخص‌های بیوشیمیایی آهن شامل میزان آهن سرم، فریتین، TIBC و میزان اشباع ترانسفرین در 130 اهداکننده مستمر خون مورد بررسی قرار گرفت.
پپتید کبدی هپسیدین نقش حیاتی در تعادل آهن از طریق کنترل جذب آهن رژیمی و آزادسازی آهن ماکروفاژ‌ها در انسان ایفا می‌کند. ماتریپتاز-2 که توسط ژن TMPRSS6 رمزگذاری می‌شود، یک سرین پروتئاز است که نقش مهمی در بیان هپسیدین و در نتیجه حفظ تعادل آهن دارد. مطالعه‌های ژنتیکی در انسان‌ها نشان داده‌اند که جهش‌های TMPRSS6 با آنمی فقرآهن مقاوم به درمان با آهن مرتبط هستند. اخیراً، GWASها چندین واریانت متداول در TMPRSS6 را شناسایی کرده‌اند که با غلظت‌های سرمی آهن و غلظت هموگلوبین در جمعیت‌هایی از نژاد اروپایی و آسیایی هندی مرتبط هستند. rs855791 یک پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی در دومین سرین پروتئاز شبیه تریپسین است که جزو واریانت‌های دارای بیشترین ارتباطات معنادار با غلظت هموگلوبین می‌باشد (19).
چندین مطالعه در مورد ارتباط ژن TMPRSS6 (rs855791) با میزان شاخص‌های آهن خون انجام شده است که نشان می‌دهد SNPهای ژن TMPRSS6 با سطوح آهن ارتباط دارند. گزارش‌های ابتدایی که بر اختلالات در متابولیسم آهن تمرکز داشتند، نشان دادند که جهش‌های نادر در TMPRSS6 باعث کمبود شدید آهن می‌شود (20). نتایج مطالعه‌های جهانی ژن نشان دادند که SNPهای متداول (از جمله rs855791) در TMPRSS6 با کاهش تغییرات شدید در سطح آهن سرم یا هموگلوبین (Hb) مرتبط هستند (22، 21). اخیراً، یک متا-آنالیز شامل داده‌های 14 مطالعه نشان داد که آلل T پلی‌مورفیسم rs855791 با میزان کمتری از فریتین در جمعیت‌های نژادی
مختلف مرتبط است (23).
نقش ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) در اهداکنندگان خون نیز بررسی شده است. در مطالعه سورنسن و همکاران در سال 2012 روی اهداکنندگان خون دانمارکی، هیچ ارتباطی بین ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) و کمبود آهن پیدا نشد و آن‌ها نتایجی مشابه با مطالعه حاضر گزارش کردند(24) ولی از آن جایی که مطالعه اولیه آن‌ها قدرت آماری کافی برای شناسایی اثرات کوچک اما مرتبط با بالین ژنوتیپ‌های مورد مطالعه نداشت، تجزیه و تحلیل را در جمعیت بزرگتری از اهداکنندگان تکرار کردند. سورنسن و همکاران در سال 2016 تاثیر 6 پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی از جمله rs855791 بر میزان فریتین خون در 14126 اهداکننده خون را بررسی کردند. ودر مطالعه دومشان آن‌ها نشان دادند که در مردان، آلل T پلی‌مورفیسم rs855791 در ژن TMPRSS6 با سطوح پلاسمایی کمتری از فریتین مرتبط بود. نتایج مطالعه دوم آن‌ها تأیید کرد که حاملان آلل T پلی‌مورفیسم rs855791 خطر بالاتری از کمبود آهن دارند، آن‌ها مشاهده کردند که این ژنوتیپ تأثیر قابل‌توجهی بر سطح فریتین تنها در میان اهداکنندگان خون مرد دارد. با این حال، این ژنوتیپ خطر کمبود آهن را افزایش نداد (17). یافته‌های مست و همکاران برروی rs855791 در سه گروه اهداکننده خون آمریکایی در مطالعه REDS-III در گروهای مختلف زن ومرد و اهداکننده باراول ومستمر بررسی شد و مشاهده کردند که سطوح فریتین سرمی در ژنوتیپ‌های زنان، اما نه مردان، متغیر است. در مطالعه REDS-III، اهداکنندگان خون هموزیگوت برای آلل C پلی‌مورفیسم rs855791 سطوح میانگین فریتین 76 درصد بالاتر از اهداکنندگان خون هموزیگوت برای آلل T بودند، در حالی که حاملان هتروزیگـوت 53 درصد بیشتـر از سطـوح فریتیـن داشتنـد
(18).
در مطالعه حاضر رابطه معنادار آماری بین ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) و شاخص‌های بیوشیمیایی مشاهده نشد که می‌تواند به دلیل محدودیت در تعداد افراد مورد مطالعه و تفاوت‌های نژادی در جمعیت‌های مورد نظر باشد. به دلیل محدودیت در منابع مالی و بودجه، تعداد اهداکنندگان کمی وارد این مطالعه شدند و تعداد نمونه‌های موجود در این مطالعه ممکن است بر توانایی تعمیم‌پذیری نتایج به جمعیت کلی تأثیر گذاشته باشد. هم‌چنین متغیرهایی مانند عوامل محیطی، عادات و رفتارهای اهداکننده، تغذیه و مسائل بهداشتی که ممکن است بر شاخص‌های آهن تأثیر داشته باشند، در این مطالعه درنظر گرفته نشده‌اند.
نتیجه‌گیری
کمبود آهن و تعادل منفی آهن پس از اهدای خون به عنوان مسأله‌ای مهم و قابل توجه در حوزه بهداشت عمومی در جوامع در حال توسعه باید مورد توجه قرار گیرد. تشخیص و مدیریت دقیق‌تر این وضعیت در اهداکنندگان خون می‌تواند بهبود سلامت و کیفیت زندگی این افراد را تضمین کند و در نهایت، اثر مثبتی بر کمبود آهن و کم‌خونی فقرآهن در جوامع مورد نظر ایجاد کند. در این مطالعه، ارتباط ژن TMPRSS6 (rs855791 V736A) با وضعیت آهن بررسی شد. نتایج این مطالعه نشان داد که پلی‌مورفیسم فوق با سطح آهن و کمیت‌های مرتبط با آن ارتباط ندارد. با توجه به اهمیت اهدای خون و نقش آن در انتقال خون و مراقبت از بیماران، شناسایی افرادی که در معرض خطر کاهش میزان آهن قرار دارند، امری اساسی است. این شناسایی می‌تواند به مراکز جذب اهداکنندگان خون کمک کند تا به‌طور دقیق‌تر گروه‌های در معرض خطر را تشخیص داده و اقدامات مناسبی را برای حفاظت از این افراد در دوره پس از اهدای خون انجام دهند.
پیشنهادات
برای تأیید دقیق‌تر و تعمیم‌پذیری نتایج، می‌توان مطالعه‌هایـی بـا حجـم نمونه‌هـای بزرگتـر و متنوع‌تــر در
جمعیت‌ها انجام داد. این اقدام می‌تواند به تجزیه و تحلیل دقیق‌تر ارتباط‌ها و تأثیرات تعدیل‌کننده در نظر گرفته شده کمک کند. با وجود نتایج متناقض در برخی موارد، این پژوهش مبنایی قوی برای ادامه تحقیقات در زمینه ارتباط بین پلی‌مورفیسم‌های ژنتیکی و تعادل آهن فراهم می‌کند. ادامه تحقیقات با توجه به تأثیرات ترکیبی این پلی‌مورفیسم‌ها و تعاملات مختلف میان عوامل مولکولی، مسیرهای متابولیسم آهن و شاخص‌های بیوشیمیایی ضروری به نظر می‌رسد.
حمایت مالی
این مطالعه بدون هیچ‌گونه حمایت مالی انجام شده است.
ملاحظات اخلاقی
این مقاله حاصل پایان نامه دانشجویی دوره کارشناسی ارشد رشته خون‌شناسی مرکز تحقیقـات مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون با کد اخلاق IR.TMI.REC.1401.021 می‌باشد.
عدم تعارض منافع
هیچ‌گونه تعارض منافعی در مطالعه حاضر وجود نداشته است.
نقش نویسندگان
محمد پویا سمیعی: انجام مراحل عملی، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج و تهیه پیش‌نویس مقاله
دکتر آزیتا چگینی: مدیریت و طراحی مطالعه، تفسیر نتایج و بازبینی و اصلاح پیش نویس مقاله
دکتر مجید شهابی: طراحی مطالعه، انجام مراحل عملی و تهیه پیش‌نویس مقاله
دکتر امیر تیمورپور: طراحی مطالعه، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج و اصلاح پیش‌نویس مقاله
تشکر و قدردانی
برای همکاری صمیمانه پرسنل بخش اهداکنندگان اداره کل انتقال خون استان تهران و مرکز تحقیقات انتقال خون کمال تشکر و قدردانی به عمل می‌آید.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
