نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله: ژنتيك انتشار: 1402/1/15
متن کامل: (380 مشاهده)
بررسی ارتباط اندازه شاخصهای گلبولهای قرمز خون با نوع جهشهای ژن بتاگلوبین در ناقلین بتا تالاسمی استان خوزستان عاطفه فرجادی1، سیده زهرا معصومیزاده2، بهناز اندشتی3 چکیده سابقه و هدف بتاتالاسـمی شایعترین بیماری ارثی تک ژنی در سراسر دنیاست کـه با الگوی اتوزومی مغلـوب به ارث میرسد و در اثر جهش در ژن بتاگلوبین ایجاد میشود. از علایـم ناقلین بتا تالاسـمی، کاهـش شاخـصهای خونی گلبـولهای قرمز و تغییراتی در میزان همـوگلـوبین از جمله پایین بودن هموگلوبین A1 و بالا بودن هموگلوبین A2 را میتوان نام برد.هدف این تحقیق، یافتن رابطهای بین مقادیر این شاخصها و نوع جهشهای ژنی منجر به بیماری میباشد که میتواند به عنوان روش تشخیص سریع نوع جهش در غربالگری اولیه ناقلین و تشخیصهای پیش از تولد به کار رود. مواد و روشها در این مطالعه توصیفی ـ تحلیلی پس از تکثیر و تعیین توالی ژن بتاگلوبین به روش سانجر از جمعیت 200 نفری ناقلین بتا تالاسمی استان خوزستان، ارتباط جهشهای ژن با اندازه شاخصهای گلبولهای قرمز افراد به روش آماری تجزیه و تحلیل واریانس(Anova) و به کمک نرمافزار 26SPSS مورد بررسی آماری قرار گرفت. یافتهها نتایج نشان داد که جهش IVSII-1(G>A)با 5/22% فراوانی شایعترین جهش در این جمعیت بوده و همچنین از نظر آماری ارتباط معناداری بین تغییرات میانگین شاخص MCV افراد نسبت به نوع جهشآنها وجود دارد. به طوری که بیشترین میانگین این شاخص با مقدار 7/3 ± 4/65 در جهش IVSI-110(G>A) مشاهده شد. نتیجه گیری یافتههای تحقیق حاضر در راستای بسیاری از مطالعههای انجام گرفته در این زمینه بوده و میتواند به عنوان یک راهنما جهت امکان تشخیص سریع نوع جهش در مراکز تشخیصی و درمانی به کار رود. کلمات کلیدی:بتا تالاسمی، شاخصهای اریتروسیتی، گلبولهای قرمز تاریخ دریافت: 19/07/1401 تاریخ پذیرش: 27/10/1401
1- کارشناس ارشد ژنتیک ـ دانشکده علوم پایه دانشگاه آزاد اسلامی واحد اهواز ـ اهواز ـ ایران 2- PhD زیست دریا ـ استادیار دانشکده علوم پایه دانشگاه آزاد اسلامی واحد اهواز ـ اهواز ـ ایران 3- PhD بیوشیمی ـ دانشکده علوم دانشگاه شهید چمران ـ اهواز ـ ایران ـ صندوق پستی: 44337-61357
مقدمه تالاسـمی شایعترین بیماری ارثی در دنیاست کـه وراثــت آن از نوع اتوزومی مغلـوب میباشد. این اختلال در حوزه دریای مدیترانه، استوا و نزدیک آن در آسیا و آفریقا بسیار شایع است(1). همچنین این بیمـاری دارای شیــوع زیـادی در کشور ماسـت ولی عمـدتاً در نـواحی ســواحل دریـای خزر و خلیج فارس دارای گسـتردگـی بیـشتـری میباشد(2). به طور متوسط 5/4 درصد از جمعیت ایران ناقل بتاتالاسمی هستند و طیف بیماری از ۱ تا ۱۰ درصد در استانهای مختلف متفاوت است. فرد مبتلا در طول زندگی وابسته به تزریق مـداوم و ماهانه خون و تزریق روزانه دسفرال می باشد. علاوه بر این، عوارض مختلف جسمانی، غددی، کبدی، قلبی، اسـتخوانی وغیره نیز در طول درمان بـروز مـیکنـد. این بیمـاری دراثـر ازدواج دو فـرد ناقل بتا تالاسمی و با احتمال 25 درصد در هـر حـاملگی بـه وجود میآید(5-3). یکی از علایـم اصلی ناقلان بتاتالاسـمی کاهـش شاخـصهای خونی گلبـولهای قرمز و بعضـاً الگوی همـوگلوبین آنهاست. شاخـصهای خـونی گلبولهای قرمز ناقـلان نسـبت به افـراد سـالم به صـورت زیـر مـیباشد: میکروسیتوز یا کوچک شدن حجم گلبولهای قرمز و پایین بودن MCV و هیپوکرومیا یا کم رنگ شدن گلبولهای قـرمز و پایین بودن MCH همچنین پایین بودن نامحسوس تا کم غلظت هموگلوبین یا MCHC ، پایین بودن غلظت هموگلوبین(Hb) و افزایش تعداد سلولهای قرمز خونی(RBC) و تغییراتی در میزان الگوی همـوگلـوبین از جملـه پایین بودن هموگلوبینA(HbA) و بالا بودن هموگلوبین A2 (HbA2) و هموگلوبین جنینی F (HbF) (1). در افراد بالغ سالم حدود 95% هموگلوبین خون از نوع A(a2b2) میباشد به همراه مقادیر کمی(5/3%<) هموگلوبین A2(a2d2) و هموگلوبین F(a2γ2) که هموگلوبین جنینی است(6). تنظیم این که در هر مرحله از تکامل کدام ژن از خانوادههای آلفا و بتا بیان شود به عهده عوامل تنظیمکننده ژنـی در ناحیـهLCR (Locus Control Region) مـیبــاشد. LCR خانواده بتا در فاصله 20 کیلوبازی سمت ¢5 آخرین ژن قرار دارد(7)(شکل 1).
اساس مولکولی این بیماری، جهش و نقص در ساختمان ژن بتاگلوبین است و بیش از 400 نوع جهش در دنیا گزارش شده است. البته هر جمعیت طیف خاصی از جهشهای ژن بتاگلوبین را نشان میدهد(8). مطالعههای جمعیتی نشان داده که حدود 40 جهش بیش از 90% از جهشهای بتا تالاسمی را در دنیا تشکیل میدهند و در مناطقی که بتا تالاسمی شایع است، فقط انواع کمی از جهشها(8-4 جهش) شایع هستند و تعداد متنوعی از جهشهای نادر نیز وجود دارد که البته شیوع کمتری دارند(9). با توجه به شیوع بالای این بیماری در کشور، یافتن روشهای تشخیصی سریع و کم هزینه میتواند برای جامعه و به ویژه مراکز غربالگری حائز اهمیت باشد. هدف از این مطالعه یافتن رابطهای بین شاخصهای گلبولهای قرمز خون و نوع جهشهای ژنی منجر به بیماری در ناقلین بتا تالاسمی بود. نتایج این تحقیق میتواند به ویژه در تشخیصهای پیش از تولد به کار گرفته شود. بدین صورت که با اندازهگیری شاخصهای گلبول قرمز فرد ناقل و جنین او که با یک آزمایش CBC ساده و ارزان قابل انجام است، و با بررسی این مقادیر احتمالاً میتوان نوع جهش را چنانچه جزء جهشهای شایع منطقه باشد با استفاده از روشهایی نظیر ARMS-PCR ، سریعتر تشخیص داد و دیگر نیازی به انجام آزمایشهای پرهزینه توالییابی برای فرد نباشد. بررسیهای تکمیلی در تشخیص نهایی توصیه میشود. مواد و روشها در یک مطالعه توصیفی ـ تحلیلی، جمعآوری نمونهها با دسترسی به پرونده پزشکی بیماران مبتلا به بتا تالاسمی ماژور مراجعهکننده به مرکز تحقیقات تالاسمی واقع در بیمارستان شفای اهواز انجام گرفت. بیماران تالاسمی ماژور احتمالاْ دارای والدین ناقل بودهاند، اما با این حال تنها نمونه والدینی که از نظر علایم بالینی، آزمایشهای خونشناسی و الکتروفورز هموگلوبین مینور بودن آنها تایید شده بود، به عنوان جمعیت مورد مطالعه انتخاب شدند. پس 200 نمونه به صورت غیرتصادفی آسان و در بازه زمانی سال 1395 تا 1400 که همگی والدین بیماران تالاسمی ماژور در استان خوزستان بودند، انتخاب شدند. نکته مهم در انتخاب نمونه این بود که بیماران حتماً در ژن بتاگلوبین خود جهش نشان داده باشند. این بررسی از نوع مطالعه توصیفی-تحلیلی بوده و به بررسی ارتباط انواع جهشها با اندازه شاخصهای گلبولهای قرمز خون ناقلان بتا تالاسمی پرداخته است. به منظور رعایت کلیه موازین اخلاقی در این تحقیق، صرفاً از نتایج آزمایشهای خونی مندرج در فرمهای افراد استفاده شده و محرمانه بودن نام آنها در تمام مراحل تحقیق رعایت گردید. ضمناْ شناسه پژوهشی اخلاق نیز برای این تحقیق با شماره IR.IAU.AHVAZ.REC.1401.110 به ثبت رسید. اطلاعاتی که از آزمایشهای خونی(CBC) ناقلان استخراج شد شامل شمارش گلبولهای قرمز، میزان هموگلوبین، MCV و MCH بود. همچنین به دلیلMCV و MCH پایین در ناقلان طبق برنامه کشوری پیشگیری از تالاسمـی، الکتروفـورز همـوگلوبین نیز برای این افراد انجام
شده بود پس مقادیر هموگلوبین A ، A2 و F نمونهها نیز از فرمها استخراج و نوشته شد. به منظور تعیین جهش نیز از نمونه خون هر یک از افراد که در آرشیو مرکز نگهداری میشدند، به میزان 5/0 میلیلیتر برداشته و استخراج DNA به روش نمکی(Salting out) بر روی آنها انجام شد(10). سپس با طراحی آغازگرهای ویژه ژن، توالی ژن بتاگلوبین(Hbβ) در یک قطعه به طول حدود 1800 جفت باز به کمک روش PCR تحت شرایط دمایی ۳ دقیقه در 94 درجه سانتیگراد (1 چرخه)، 30 ثانیه 94 درجه سانتیگراد،30 ثانیه 61 درجه سانتیگراد و 35 ثانیه 72 درجه سانتیگراد(35 چرخه) و در نهایت 5 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد(1 چرخه) در دستگاه ترموسایکلر بیوراد تکثیر شد. پس از تکثیر ژن به روش سانجر و در دستگاه ABI-PRISM 3700 تعیین توالی شد. نتایج تعیین توالی ابتدا در برنامه کروماس بررسی شده و سپس در برنامه نوکلئوتید بلاست با توالی مرجع مقایسه و جهشها شناسایی شدند. جهت طراحی آغازگرها از نرمافزار اولیگو 7 استفاده شد و توالی الگوی ژن بتاگلوبین(ID: 3043) به عنوان توالی مرجع از بانک ژن NCBI گرفته شد. لازم به ذکر است که به منظور تعیین توالی کل ژن بتاگلوبین از سه آغازگر کمکی دیگر نیز استفاده شد(جدول 1). در مجموع دادههای 200 نمونه با 26 نوع جهش متفاوت وارد نرمافزار SPSS ( نسخه 26) شد و روش آماری آنالیز واریانس(Anova) به منظور بررسی ارتباط جهشهای ژن بتاگلوبین با هر یک از شاخصهای خونی مورد استفاده قرار گرفت. سطح معناداری در این مطالعه 05/0 p<در نظر گرفته شد.
یافتهها در این تحقیق به طور کلی 200 نمونه مورد بررسی قرار گرفت که از این تعداد 110 زن و 90 مرد بودند. پس از دستهبندی آماری مقادیر عددی هریک از شاخصهای گلبول قرمز مورد بررسی و نتایج زیر به دست آمد(جدول2). همانطور که در جدول 2 مشاهده میشود مقدار RBC کمتر از 5 میلیون در مترمکعب در 20 نفر(10%) دیده شده و RBC بالاتر از 7 میلیون در مترمکعب در 12 نفر(6%) بودند. در مورد شاخص MCV هم مقادیر fL 60 > MCVبا 40% و مقادیر70 ≥MCV≥60 با 53% بیشترین فراوانی را در بین افراد مورد مطالعه نشان دادند. در مورد فاکتور MCH نیز مقادیرPg