عوامل مؤثر در بهینگی ایمونیزاسیون جهت دستیابی به آنتی بادی علیه آنتیژن RhD در محیط کشت مهران امروانی1، فاطمه یاری2، سعیده میلانی3، بهناز عموحسین4 چکیده سابقه و هدف آنتیبادی علیه آنتیژن RhD در طب انتقال خون و بالین از اهمیت ویژهای برخوردار میباشد. لذا در این مطالعه به بررسی عوامل مؤثر در بهینگی ایمونیزاسیون جهت دستیابی به لنفوسیت ایمونیزه شده تولیدکننده آنتیبادی پرداخته شده تا در محیط آزمایشگاهی به آنتیبادی علیه آنتیژن RhD دست یافته شود. مواد و روشها در یک مطالعه تجربی، لنفوسیتهای خون محیطی به روش فایکول از کیسههای خون کامل O منفی جداسازی شدند. سپس این لنفوسیتها با اللوسین متیل استر تیمار شده و در پلیت کشت سلولی با آنتیژن محلول و ذرهای RhD ، اینترفرون گاما، اینترلوکین4 و CpGODN به مدت یک هفته در دمای 37 درجه سانتیگراد مواجه شدند. پس از این مدت انکوباسیون به منظور ارزیابی تولید آنتیبادی از لنفوسیتها بر روی سوپرناتانت حاصل از محیط کشت مواجه سلولی با روش الایزا انجام شد. یافتهها استفاده از اینترفرون گاما، ترکیب آن با اینترلوکین-4 و CpGODN به عنوان عوامل بهینهکننده جهت تولید آنتیبادی از لنفوسیتهای جدا شده به روش فایکول در ایمونیزاسیون آزمایشگاهی شناخته شدند(به ترتیب با تولید آنتیبادی با غلظتهای ۸۳۱/۳۶ ± ۸۵۱/۷۵ ، ۲۹۳/۳۱ ± ۱۹۵/۸۲ و۸۱۴/۲۴ ± ۱۳۴/۶۶ نانوگرم در میلیلیتر در ۱۰ مواجه صورت گرفته). نتیجه گیری استفاده از عوامل بهینه کننده ایمونیزاسیون نقش مؤثری بر تولید آنتیبادی علیه آنتیژن RhD در محیط آزمایشگاهی دارند. کلمات کلیدی: ایمنیزایی، تکنیک درون آزمایشگاهی، آنتیبادیها تاریخ دریافت: 15/05/1401 تاریخ پذیرش: 15/06/1401
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- مؤلف مسئول: PhD ایمونولوژی ـ استـاد مرکـز تحقیقـات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خونـ تهرانـ ایرانـ صندوق پستی: 1157-14665 3- PhD زیست فناوری پزشکی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 4- کارشناس علوم آزمایشگاهی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه سیستم گروه خونی Rh یکی از پلیمورفیکترین و ایمونوژنترین سیستمهای شناخته شده خونی در انسان است که بعد از سیستم گروه خونی ABO ، یک سیستم خونی حائز اهمیت بالینی در طب انتقال خون به شمار میرود. عوارض بالینی میتواند به دلیل تخریب گلبولهای قرمز خون پس از تعامل یک آلوآنتیبادی با گلبول قرمز که حاوی آنتیژن مربوطه است، به وجود آید و سبب ایجاد یک واکنش همولیتیک پس از تزریق خون (HTR) شود و به همین دلیل شناسایی آنتیژن RhD از اهمیت ویژهای در سرولوژی گروههای خونی برخوردار است(3-1). آنتیبادی علیه آنتیژن D سیستم Rh هم در طب انتقال خون در جهت بررسی نوع Rh سلولهای خونی(تایپینگ سیستم Rh) و هم در بالین به عنوان یک عامل پروفیلاکتیک در جلوگیری از حساسسازی مادر Rh منفی که در معرض خون Rh مثبت جنینی قرار گرفته است به منظور جلوگیری از ایجاد بیماری همولیتیک جنین و نوزاد(HDFN) مورد استفاده قرار میگیرد(5، 4). جهت تولید آنتیبادی مونوکلونال علیه آنتیژن D سیستم Rh ، یکی از مراحل اساسی آن ایمونیزاسیون لنفوسیتهای B به منظور تولید آنتیبادی میباشد(6). ایمونیزاسیون به روشهای مختلفی انجام میشود. یکی از این روشها، ایمونیزاسیون در حیوانات آزمایشگاهی است که نیاز به تزریق آنتیژن D به حیوان آزمایشگاهی دارد لذا نیازمند طراحی یک حیوان خانه مجهز میباشد. علاوه بر تهیه یک حیوان خانه مجهز، یکی از مشکلات و دشواریهای این روش رعایت اصول و ضوابط اخلاقی کار با حیوانات است که استفاده از این روش جهت ایمونیزاسیون را دشوار میسازد(8، 7). از طرف دیگر در ایمونیزاسیون حیوانات آزمایشگاهی خصوصاً موش، به خوبی نسبت به آنتیژن D پاسـخ ایمنـی ایجاد نمیشود و در صورت تولید آنتیبادی از این نوع ایمونیزاسیون، آنتیبـادی مـونوکلونـال مـوشی ایجاد میشود که در هنگام استفاده از آن در بالین(به منظور تولید آمپول روگام جهت جلوگیری از حساس شدن مادر Rh منفی و ایجاد HDFN) از بازده درمانی آن میکاهد و منجر به بروز پاسخ ایمنـی در بـدن فـرد و ایجـاد آنتیبـــادی بـر علیـه آنتیبادی مونوکلونال موشی میشود(10، 9). آنتیD را میتوان از افراد هایپرایمیون، کسانی که در طول بارداری ایمونیزه شدهاند، افرادی که تزریق خون ناسازگار داشتهاند و یا ایمونیزاسیون افراد داوطلب تهیه نمود. اما این روشها برای به دست آوردن غلظت مناسب آنتیD نیاز به تزریق دوزهای تقویتکننده به اهداکنندگان دارد که همراه با ایجاد خطراتی برای اهداکنندگان از جمله آلوایمونیزه شدن نسبت به سایر گروههای خونی میباشد. به علاوه جداسازی آگلوتینین آنتیD از کلاسIgM که در ارزیابی های سیستم Rh ( خصوصا Rh تایپینگ ) اهمیت دارد نیز به ندرت از افراد ایمیون با تیتر بالای آنتیD به دست میآید(11، 4). لذا یکی از مناسبترین شیوهها جهت ایمونیزاسیون لنفوسیتهای B برای تولید آنتیبادی علیه آنتیژنRhD ، روش ایمونیزاسیون آزمایشگاهی(In Vitro Immunization = IVI) میباشد(12). یکی از عوامل مؤثر در بهینهسازی ایمونیزاسیون آزمایشگاهی در جهت تولید آنتیبادی مونوکلونال، استفاده از الـ لوسیل ال ـ لوسین متیل استر(LLME) میباشد که سبب از بین بردن و حذف جمعیت سلولی غنی از لیزوزوم میشود. این سلولها عبارتند از: مونوسیت، لنفوسیتهای گرانولار بزرگ، سلولهای TCD8+ (سلولهای T سیتوتوکسیک) و سلولهای NK . با حذف این سلولها که عمدتاً سبب مهار پاسخهای ایمنی میشود، تنها لنفوسیتهای B و T باقی میمانند که میانکنش آنها در محیط آزمایشگاهی منجر به افزایش در تکثیر لنفوسیتB و تولید آنتیبادی میشود. IL2 و یا IFN-γ نیز نقش مؤثری در تحریک تکثیر لنفوسیتهای B و القای تولید آنتیبادی به عنوان سیگنال دوم فعالسازی لنفوسیتهای B دارند و از اینرو میتوان از محصولات نوترکیب موارد فوقالذکر، در بهبود ایمونیزاسیون آزمایشگاهی بهره جست(14، 13). بنابراین با توجه به اهمیت آنتیبادی علیه آنتیژن D سیستم Rh در طب انتقال خون و بالین، در این مطالعه شناخت فاکتورهای مختلف و عوامل دخیل در فرآیند ایمونیزاسیون سلولهای B جهت دستیابی به آنتیبادی علیه آنتیژنRhD در محیط آزمایشگاهی بود. مواد و روشها مطالعه از نوع تجربی بود. در این مطالعه از پنج کیسه خون کامل فاقد آنتیژن D جهت جداسازی سلولهای تک هستهای خون محیطی و پنج کیسه گلبول قرمز فشرده حاوی آنتیژن D جهت جداسازی آنتیژن D به منظور تهیه آنتیژن محلول و ذرهای استفاده شد. تمام کیسههای خون از پایگاه انتقال خون استان تهران(مرکز وصال) و به پیوست رضایتنامهای که از اهداکنندگان جهت انجام مطالعههای پژوهشی اخذ شده است، تهیه شدند. فقدان یا حضور آنتیژن D در این کیسهها به وسیله آزمایشهای سرولوژی با کمک Anti-D در آزمایشگاه سرولوژی اختصاصی پایگاه انتقال خون تهران تایید شدند. تهیه آنتیژن ذرهایRhD و تایید آن: ابتدا۲میلیلیترازخونموجوددرکیسهگلبولقرمزمتراکمشده O مثبت را ازطریقکوردآنواردلولهفالکون ۱۵میلیلیتریکردهوسپسبا فسفات بافر سالین(PBS)(سیگما، آمریکا) حجمآنبه۱۲میلیلیتررساندهشد.جهتحذفآنتیبادیهایضدگروهخونی A و B (Anti-A و Anti-B) که میتوانند در الایزا مداخلهکنند،چهار مرحله محلولفوقموردشستوشوقرارگرفت.جهت شستوشوبا PBS ازدورسانتریفوژ g ۵۰۰بهمدت۵ دقیقهدرمرحلهاولودرمراحلبعدیازدورسانتریفوژ g ۴۰۰بهمدت۵دقیقهاستفادهشد.درهرمرحله ازشستوشوپسازخارجکردنسوپرناتانتروییمحلول،مجدداًرسوب سلولی موجوددرلولهفالکون رابا PBS بهحجم۱۲میلیلیتررساندهوسانتریفوژانجامشد. پسازپایانمراحلشستو شوگلبولقرمز O مثبت با PBS در غلظت مناسب تهیه شد تا آنتیژن ذرهای جهت مواجه سلولی تهیه شود. جداسازی و تخلیص آنتیژن RhD از سطح RBC ها و تایید آن جهت تهیه آنتیژن محلول: از روش شبح سلولی به منظور محلولسازی آنتیژنهای RhD متصل به غشای گلبول قرمز استفاده شد. در این روش، پس از سانتریفوژ گلبولهای قرمزD مثبت در دور g 600 به مدت ۲۰ دقیقه و دور ریختن پلاسما، هم حجم خون باقیمانده، بافر PBS افزوده و مجدداً سانتریفوژ انجام شد. بعد از حذف بافرPBS و افزودن مجدد بافر، طی چند روز سلولها چند مرتبه فریز و ذوب شدند که منجر به آزادسازی هموگلوبین از گلبولهای قرمز و ایجاد شبح سلولی شد. در نهایت پس از حذف هموگلوبین، ۲۰۰ میکرولیتر بافر لیز حاوی ۱۵۰ میلی مولار NaCl ، ۲۵ میلیمولار تریس، ۱۰ میلیمولار ضد انعقاد EDTA ، ۲ میلیمولارPMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluride) و ۱ درصدNonidet P-40 به هر لوله فالکون اضافه شد و ۲ تا ۳ ساعت روی روتاتور قرار گرفت و پس از آن در دور RPM ۴۴۰۰ سانتریفوژ شد. سپس به منظور تغییر محیط، سوپ رویی به غشای دیالیز منتقل شد و غشا در بشر حاوی بافر PBS یک شب گذاشته شد. روز بعد محلول داخل غشای دیالیز جمعآوری و ذخیره شد. به منظور تهیه ستون کروماتوگرافی ژل سفارز B۴ دارای گروه فعال سیانوژن بروماید آمادهسازی شد. در ادامه آنتیبادی Anti-D به گروههای فعال ژل متصل و به ستون اضافه شد. بعد از جداسازی اتصالات سست به وسیله گلایسین ۲/۰ مولار، با افزودن دیاتانول آمین ۰۵/۰ مولار جایگاههای خالی اشغال شد. نمونه حاوی آنتیژنD رقیق شده با PBS هم حجم از ستون عبور داده شد. با چندین مرتبه شست و شوی ستون با PBS ، اجزای متصل نشده یا اتصالات سست و غیر اختصاصی خارج شدند. سپس جداسازی آنتیژن با افزودن گلایسین صورت گرفت. قبل از شروع جداسازی، به هر لوله ۵۰ میکرولیتر بافر تریس با غلظت ۲ مولار و pH برابر ۸ ، به منظور خنثیسازی pH اسیدی گلایسین، اضافه گردید. جذب نوری در طول موج ۲۸۰ نانومتر خوانده شد. در انتها، آنتیژن تخلیص شده توسط ستون تغلیظ با منفذهایی کوچکتر از ۵۰۰۰ دالتون تغلیظ گردید. ویژگی آنتیژن خالص شده با روش الایزا و به کارگیری آنتیبادی ضد آنتیژن D (ایمونو- دیاگنوستیکا، آلمان) تائید شد. جداسازی لنفوسیت به روش فایکول از کیسه خون و تهیه سوسپانسیون سلولی: جهت جداسازی لنفوسیتها به روش فایکول در سه لوله فالکون ۵۰ میلیلیتری به ترتیب ۲۵ ، ۲۵ و۱۰ میلیلیتر خون کامل O منفی با ۲۵ ، ۲۵ و ۱۰ میلیلیتر محلول PBS مخلوط شدند. سپس در ۴ لوله فالکون ۵۰ میلیلیتری ، ۱۵ میلیلیتر فایکول(بهار افشان، ایران) ریخته و به هر لوله ۳۰ میلیلیتر از مخلوط خون کامل O منفی و PBS اضافه گردید. نهایتاً لولههای فالکون ۵۰ میلیلیتری حاوی فایکول و مخلوط PBS و خون کامل به مدت ۲۰ دقیقه در دور g ۶۰۰ سانتریفوژ شد. پس از پایان سانتریفوژ، هاله ابری شکل بین گلبولهای قرمز(RBC) و پلاسما که حاوی سلولهای تک هستهای خون محیطی (PBMCs) است و بافیکوت نامیده میشود جداسازی شده و به ۴ لوله فالکون ۵۰ میلیلیتری انتقال یافت. به دلیل سمیت فایکول برای سلولها، لولههای حاوی سلول سه بار با محلول PBS شست و شو شدند. به منظور شست و شو سلولها با PBS در مرتبه اول از دور سانتریفوژ g ۵۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه و در مرتبه دوم و سوم از دور سانتریفوژ g ۴۰۰ به مدت ۵ دقیقه استفاده شد. پس از پایان مراحل شست و شو و دور ریختن سوپرناتانت رویی، اقدام به هموژنسازی سلولها نموده و سپس رسوب سلولی (Pellet) تشکیل شده در انتهای لولههای فالکون را با یکدیگر در یک لوله فالکون ۱۵ میلیلیتری ادغام کرده و حجم لوله با محیط RPMI (بیوآیدیا، آمریکا) حاوی 10% سرم جنین گاوی(10% FBS) (مدیتال، ایران) به ۴ میلیلیتر رسانده میشود. سپس ۴۰ میکرو لیتر ال لوسیل ال لوسین متیل استر(LLME) (مرک، آلمان) ۵/۲ میلیمولار به سوسپانسیون سلولی اضافه شده و به مدت ۴۰ دقیقه این ماده با سلولها انکوبه شد. پس از پایان مدت زمان انکوباسیون جهت حذف LIME ، سوسپانسیون سلولی سه بار با محلولPBS به مدت ۵ دقیقه در دور g ۴۰۰ شست و شو داده شد. پس از پایان مراحل شست و شو، رسوب سلولی(Pellet) هموژن شده و مجدداً با محیط RPMI حاوی 10% FBS به حجم ۴ میلیلیتر رسانده شد. شمارش سلولی سوسپانسیون جهت توزیع سلولها در پلیت کشت سلولی: جهت شمارش سلولی به منظور تعیین تعداد سلولهای موجود در هر چاهک پلیت کشت سلولی از لام نئوبار استفاده شد. بدین منظور ۱۰ میکرولیتر از محلول RPMI حاوی 10% FBS و بافیکوت (سوسپانسیون سلولی) با ۱۰ میکرولیتر اسید استیک 2% (آلمان، مرک) به منظور حذف RBC موجود در نمونه ترکیب شد. در نهایت نیز از یک رنگ حیاتی به نام تریپان بلو(سیگما، آمریکا) جهت شمارش گلبولهای سفید (WBC)استفاده گشت. این رنگ جذب سلولهای مرده شده و سلولهای زنده شفاف باقی میمانند. مواجه سلولی: پس از شمارش سلولهای موجود در سوسپانسیون، با توجه به سلولهای شمارش شده و متناسب با ورود ۱۵۰۰۰۰ سلول در هر چاهک از پلیت کشت سلولی، سلولهای موجود در سوسپانسیون در پلیت کشت سلولی توزیع شده و آنها با ۱۰ تا ۴۰ میکرولیتر آنتیژن ذرهای RhD با غلظت اولیه ۵۰۰۰۰۰۰CellmL،۱۵ تا ۴۰ میکرولیتر آنتیژن محلول RhD با غلظت اولیه µgrmL ۷۰ ، ۱۰ میکرولیتر اینترلوکین۴ (IL-4)(ابکم، انگلستان) با غلظت اولیه pgrmL ۱۹، ۱۰ میکرولیتر اینترفرون گاما(IFN-γ ) (ابکم، انگلستان) ۱۰۰۰pgrmL، ۱تا ۳ میکرولیترCpGODN (نوواس، آمریکا) با غلظت اولیه µgrmL ۲۰۰ مواجه شدند. پس از پایان مواجه سلولی، پلیت کشت سلولی به درون انکوباتورCO2 دار منتقل گردید. سنجش الایزا : پس از مواجه لنفوسیتهای موجود در سـوسپانسیون سلولی با آنتیژن ذرهای و محلول RhD، IL-4 ، IFN-γ و CpGODN، سپس انکوباسیون به منظور بررسی تولید آنتیبادی، آزمایش الایزا انجام شد. آزمایش الایزا بر روی پلیت کوت شده با آنتیهیومن گلوبولین(AHG) انجام گردید. از این پلیت جهت غربالگری تولید آنتیبادی توسط لنفوسیتهـای تحریک شده با عوامل بهینهکننده استفاده شد. کوتکردن پلیت الایزا با AHG : AHG (ابکم، انگلستان) با غلظت ۱۰۰۰ میکروگرم بر میلیلیتر به مقدار ۲۰۰х رقیق شده تا به AHG با غلظت ۵ میکروگرم بر میلیلیتر دست یافته شود. سپس به چاهکهای پلیت ۹۶ خانهای الایزا به استثناء چاهکهای انتهایی هر ردیف(Strip) میزان ۵۰ میکرولیتر از AHG به مقدار ۵ میکروگرم بر میلیلیتر اضافه شد. در هرStrip از پلیت الایزا چاهک انتهایی به عنوان چاهک کوت نشده non-coated) ) خالی گذاشته شده و با ۵۰ میکرولیتر محلولPBS پر گردید . این چاهکهای non-coated در انتهای هرStrip به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته میشود. پلیـت کـوت شـده از AHG پوشانیـده شـده و در ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ ساعت انکوبه شد. بلوکهکردن پلیت الایزا کوت شده باAHG : پس از ۲۴ ساعت از انکوبه کردن پلیت الایزا جهت کوت شدن آنتیهیومن گلوبولین، به منظور بلوکه کردن مناطق خالی انتهای هر چاهک و برای جلوگیری از نتایج کاذب از سرم آلبومین گاوی 2% (2% BSA) (مدیتال، ایران) به عنوان بلاکر استفاده شد. شیوه اجرای الایزا : ۵۰ میکرولیتر از سوپ رویی پلیت کشت سلولی پس از مواجه، به چاهکهای پلیت ۹۶ خانهای الایزا افزوده شده و سپس به مدت۴۰ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه گردید. در این مرحله علاوه بر افزودن ۵۰ میکرولیتر سوپ رویی پلیت کشت سلولی، ۵۰ میکرولیتر سرم حاوی IgG با غلظت ۱۰۰ نانوگرم بر میلیلیتر به عنوان کنترلهای مثبت نیز به چاهکها اضافه شد. همچنین در هنگام اجرای آزمایش الایزای کمی نیز به چاهکها۵۰ میکرولیتر نمونههای استاندارد حاوی آنتیبادیIgG با غلظت ۲/۰ ، ۲ ، ۱۰ و ۱۰۰ نانوگرم بر میلیلیتر اضافه شد. لازم به ذکر است که چاهکهای non-coated در پلیت الایزا به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شده و سوپ رویی پلیت کشت قرار گرفته در این چاهکها به صورت دوتایی (duplicate) مورد آزمایش قرار گرفتند. پس از انکوباسیون، خروج محتویات پلیت الایزا، سه بار شست و شو با محلول شست و شو دهنده (Washing Buffer 20X)(آدالتیس، ایتالیا) انجام پذیرفت. پس از سه مرحله شست و شو ، ۵۰ میکرولیتر از محلول کونژوگه رقیق شده به چاهکهای الایزا افزوده شده و به مدت۴۰ دقیقه پلیت حاوی محلول کونژوگه(ابنسینا، ایران) در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه گردید. پس از پایان انکوباسیون پلیت الایزا با محلول کونژوگه، مجدداً سه بار چاهکها با محلول شستشو دهنده شست و شو داده شد. سپس ، ۵۰ میکرولیتر محلول سوبسترای حاوی TMB (سیمنس، آلمان) به چاهکها اضافه شده و انکوباسیون به مدت ۱۰ دقیقه در محیط تاریک انجام شد. ۲۵ میکرولیتر محلول متوقفکننده(Stop Solution)(اینویتروژن، آمریکا) به چاهکها افزوده شده و سپس قرائت OD چاهکها توسط دستگاه الایزا ریدر تکان TECAN در طول موج ۴۵۰ نانومتر انجام پذیرفت. نرمافزار آماری و آزمونهای آماری: جهت تعیین غلظت آنتیبادی از الایزای کمی استفاده شد و با استفاده از نرمافزار Microsoft Office Excel میانگین و انحراف معیار آنتیبادی تولیدی حاصل از دفعات مختلف کاری بررسی شد. جهت بررسی بهینگی عوامل بهبود دهنده ایمونیزاسیون نیز از نرمافزارSPSS نسخه ۲۶ استفاده شده و از آنالیز آماری ANOVA جهت دستیابی به بهینه کنندهترین عامل استفاده گشت. یافتهها اثر غلظتهای مختلف آنتیژنی در ایمونیزاسیون آزمایشگاهی: برای بررسی غلظتهای مختلف آنتیژنی در القای ایمونیزاسیون آزمایشگاهی از ۱۰ ، ۲۰ و ۴۰ میکرولیتر آنتیژن ذرهای RhD با غلظت اولیه ۵۰۰۰۰۰۰CellmL و ۱۵ ، ۳۰ و ۴۰ میکرولیتـر از آنتـیژن محلول RhD با غلظت اولیه µgrmL ۷۰ استفاده شد. بدین منظور در پلیت کشت سلولی، لنفوسیتهای جدا شده به روش فایکول با غلظتهای ذکر شده مواجه گشته و یک هفته پس از انکوباسیون جهت ارزیابی ایمونیزاسیون و تولید آنتیبادی آزمایـش الایزا انجام شد. نتایج الایزا به صورت OD در جدول گزارش گردید(جدول 1). لازم به ذکر است که این آزمایشها در دو ران کاری انجام شده و هر ران تنها یک بار انجام شده است. بدین صورت که یک ران کاری مرتبط با آنتیژن محلول و ران بعدی مربوط به آنتیژن ذرهای میباشد. اثر اینترلوکین ۴ (IL-4)، اینترفرون گاما(IFN-γ) و CPGODN در ایمونیزاسیون آزمایشگاهی: به منظور ارزیابی اثرIL-4 ،IFN-γ وCPGODN در ایمونیزاسیون آزمایشگاهی در یکی از پلیتهای کشت سلولی حاصل از مواجه با آنتیژنهای محلول و ذرهای RhD میزان ۱۰ میکرولیتر IL-4 با غلظت اولیه pgrmL ۱۹، ۱۰ میکرولیتر IFN-γبا غلظت اولیه ۱۰۰۰pgrmL و ۲۰ میکرولیتر از ترکیبIL-4 وIFN-γ به چاهکهای پلیت کشت سلولی افزوده شد. در پلیت دیگر نیز به لنفوسیتها که با آنتیژن محلول و ذرهای RhD مواجه شده بودند میزان ۲۵ میکرولیتر IFN-γ با غلظت اولیه ۱۰۰۰pgrmL و ۳ میکرولیتر CpGODN با غلظت اولیه µgrmL ۲۰۰ اضافه گردید.
متعاقباً یک هفته پس از انکوباسیون سلولهای مواجه شده با آنتیژن RhD ،IL-4 ،IFN-γ و CPGODN برای بررسی وضعیت ایمونیزاسیون و تولید آنتیبادی از آزمایش الایزا استفاده شد و نتایج به صورت OD گزارش گردید. سپس جهت تعیین غلظت آنتیبادی تولیدی حاصل از تحریک لنفوسیتها با عوامل بهینهکننده ایمونیزاسیون از آزمایش الایزای کمی استفاده شد. در آزمایش الایزای کمی از نمونههای استاندارد حاوی آنتیبادی IgG با غلظتهای ۲/۰ ، ۲ ، ۱۰ و ۱۰۰ نانوگرم بر میلیلیتر (ngrmL ) استفاده شده و پس از رسم نمودار غلظت – جذب نوری اقدام به تعیین غلظت آنتیبادی موجود در سوپرناتانت حاصل از تحریک لنفوسیتها با عوامل بهینهکننده ایمونیزاسیون گردید. بدین منظور جذب نوری نمونههای استاندارد(که به ترتیب غلظت برابر است با : ۱۹۸/۰ ، ۳۰۱/۰ ، ۴۰۷/۰ و ۵۱۵/۱) استفاده شد. نتایج این غلظتها گزارش شدند(جداول 2 و 3). در نهایت برای مقایسه اثرIL-4 ، IFN-γ ، CPGODN و ترکیبIFN-γ با IL-4 وCPGODN به منظور تحریک لنفوسیتها جهت تولید آنتیبادی در ایمونیزاسیون آزمایشگاهـی، از تجزیـه و تحلیـل آماری ANOVA استفاده شد. نتایج این تجزیه و تحلیل نشان داد میان میانگین تولید آنتیبادی توسط مواد تحریکی ذکر شده (شاملIL-4 ، IFN-γ ، CPGODN و ترکیب IFN-γ باIL-4 و CPGODN) اختلاف معناداری وجود دارد (۰۱۴/۰p=). به ترتیب ترکیب IFN-γ با IL-4 و ترکیب IFN-γ با CPGODN ، CPGODN با IL-4 دارای بیشترین اثرگذاری در تحریک لنفوسیتها جهت تولید آنتیبادی علیه آنتیژن RhD در ایمونیزاسیون آزمایشگاهی میباشند(به ترتیب با تولید آنتیبادی به غلظت ۲۹۳/۳۱ ± ۱۹۵/۸۲ ، ۸۳۱/۳۶ ± ۸۵۱/۷۵، ۸۱۴/۲۴ ± ۱۳۴/۶۶، ۱۰۳/۱۸ ± ۲۳۳/۵۲ و ۲۵۲/۱۸ ± ۱۱۲/۴۴ نانوگرم بر میلیلیتر) (جدول 4). بحث امروزهآنتیبادیمونوکلونالدرزمینههایمختلفهمچونتحقیقات،تشخیصودرمانموردتوجههستند. بنابرایندستیابیبهآنتیبادیاختصاصیبرایآنتیژنموردنظربا میل ترکیبیبالابهمنظوررسیدنبهایناهداف،ضروریمیباشد. یکیازاین آنتیبادیهایمونوکلونالکهدرعلم ایمونوهماتولوژیوطبانتقالخونبسیار حائز اهمیتاستودرتایپینگسیستم Rh مورداستفادهقرارمیگیرد،آنتی Dمیباشد. آنتیبادی مونوکلونالانسانیضدآنتیژن D سیستم Rh علاوهبرطبانتفالخون،دربالیننیزحائزاهمیتمیباشدبه دلیلاین کهازاینآنتیبادیدرجهتتولیدآمپولروگامبهمنظورجلوگیریازحساسسازیمادر Rh منفی کهدارایجنین Rh مثبتاست،استفادهمیشود. یکی از مراحل تولید آنتیبادی مونوکلونال، ایمونیزاسیون لنفوسیتها میباشد. لذا موفقیت در تولید آنتیبادی مونوکلونال وابسته به بهینگی در مرحله ایمونیزاسیون لنفوسیتها میباشد. لنفوسیتهای جدا شده به روش فایکول از کیسههای خون، لنفوسیتهای بکری(Naïve Lymphocyte) هستند که تاکنون با آنتیژن برخورد نکردهاند. طبق فرضیه دو سیگنالی(Two Signal Hypothesis) جهت تحریک لنفوسیتهای بکر و افزایش قدرت تکثیر و تمایز آنها، نیاز به دو سیگنال میباشد که سیگنال اول توسط آنتیژن و سیگنال دوم توسط مواد کمک تحریکی(Co-Stimulatory Factor) القا میشود. از آن جایی که افزایش قدرت تکثیر و تمایز لنفوسیتهای بکر با بهبود ایمونیزاسیون همراه میباشد، لذا جهت بهینگی و بهبود در ایمونیزاسیون لنفوسیتهای بکر، آنتیژن و مواد کمک تحریکی نقش به سزایی ایفا میکنند. بنابراین در این مطالعه با بهرهگیری از این فرضیه و با استفاده از آنتیژن و مواد کمک تحریکی بررسیهایی صورت گرفته تا به آنتیبادی در محیط آزمایشگاهی دست یافته شود. از جمله مهمترین مواد کمک تحریکی میتوان به اینترلوکین ۴ (IL-4) و اینترفرون گاما(IFN-γ) اشاره کرد که نقش مهمی در بهبود و بهینگی ایمونیزاسیون ایفا میکنند. در مطالعه حاضر نیز نتایج نشان دادهاند که استفاده از IFN-γ ،IL-4 و ترکیبی از این دو ماده در همراهی با آنتیژن میتوانند در بهبود ایمونیزاسیون آزمایشگاهی مؤثر باشند. در مطالعههای ونجر و همکاران و ایچیم و همکاران نتایج مشابهی به دست آمده و یافتهها به ترتیب بیانگر نقش بهینهکننده IL-4 و IFN-γ در ایمونیزاسیون میباشند (16، 15). همچنیندر مطالعهحاضرنتایجنشان دادهاندکهاستفادهازترکیب IL-4 و IFN-γ میتوانند اثر سینرژیسمی(همافزایی) درتحریکتولیدآنتیبادیاز لنفوسیتهای B ازطریقالقایسلولهای T کمکی نوعیک (Th1)داشتهباشندومتعاقباًمنجربهبهبوددر ایمونیزاسیونآزمایشگاهیشوند.بهگونهایکهدر مطالعهکیگان وهمکاراننیزایناثرسینرژیسمی ترکیبات IL4 و IFN-γ درتحریکلنفوسیتهاجهت تولیدآنتیبادیوالقایایمونیزاسیونمشاهدهشده است(17). به علاوه سیتوزین فسفوگوانین اولیگودئوکسی نوکلئوتید(CPG ODN) نیز میتواند به عنوان یک ماده محرک در القای ایمونیزاسیون آزمایشگاهی مؤثر واقع گردد.CPG ODN یک آگونیست رسپتور شبهToll (Toll Like Receptor 9 = TLR9) میباشد که این رسپتور در درون سلولهایB نقش مهمی در افزایش انتقال سیگنال کمپلکس رسپتورB ( B Cell Receptor = BCR) ایفا میکند لذا مادهCPG ODN با اتصال به این رسپتور میتواند در همراهی با آنتیژن منجر به افزایش میزان سیگنالینگ مؤثر در تکثیر لنفوسیتها شده و از این طریق در بهبود ایمونیزاسیون مؤثر باشد. در مطالعه حاضر نیز نتایج نشاندهنده نقشCPG ODN در بهبود و بهینگی ایمونیزاسیون میباشد. در مطالعه ژانگ و همکاران نیز یافتهها حاکی از این مطلب بودند که به کارگیری CPG ODN نقش مؤثری در افزایش ایمونیزاسیون ایفا میکند که این یافتهها با نتایج مطالعه ما مشابه بوده است(18). علاوه بر مواد محرک، آنتیژن نیز در بهینگی ایمونیزاسیون آزمایشگاهی دخیل میباشد. از جمله مهمترین پارامترهای مرتبط با آنتیژن در بهبود و بهینگی ایمونیزاسیون میتوان به غلظت و اشکال آنتیژنی اشاره کرد. افزایش غلظت آنتیژن از آن جایی که با افزایش سیگنال اول طبق فرضیه دو سیگنالی در تحریک لنفوسیتها همراهی دارد لذا در بهبود و بهینگی ایمونیزاسیون دخیل است. در مطالعه حاضر نیز نتایج نشان دادهاند که با افزایش غلظت آنتیژن، ایمونیزاسیون آزمایشگاهی افزایش مییابد. در مطالعههای اسپرنجر و همکاران و همچنین بوننفنت و همکاران نتایج مشابه گزارش شده است و یافتهها بیانگر این مطلب میباشند که به ترتیب با افزایش غلظت آنتیژن به میزان ۷ و ۱۵ میکروگرم بر میلیلیتر ایمونیزاسیون نیز افزایش مییابد و به عبارت دیگر افزایش غلظت آنتیژن یک عامل بهینهکننده در ایمونیزاسیون میباشد(20، 19). از طرفی از آن جایی که آنتیژن RhD یک ایمونوژن قوی است، لذا غلظتهای بالای این آنتیژن میتواند در بهینگی ایمونیزاسیون آزمایشگاهی و تولید آنتیبادی به تنهایی مؤثر باشد. طبق دستورالعملهای سازمان غذا و داروی آمریکا(FDA = Food and Drug Administration)، آنتیD مجوز استفاده در واحد بانک خون را دارد که به صورت ممزوج(Blend) تهیه شده باشد. آنتیD ممزوج حاوی ترکیبی از آنتیبادی IgM و IgG است. لذا با استفاده از غلظتهای مناسب آنتیژن RhD در هنگام مواجه لنفوسیتهای B بکر با این آنتیژن در اولین برخورد میتوان آنتیبادی از کلاس IgM تولید نمود و در همراهی آنتیژن RhD وIFN-γ که خود در بهینگی ایمونیزاسیون مؤثر بوده است میتوان کلاس آنتیبادی را تغییر داد و آنتیبادی از کلاس IgG تهیه کرد و بدین ترتیب یک آنتیD ممزوج ایجاد نمود. پارامتردیگر مرتبطباآنتیژندربهینگیایمونیزاسیون،اشکالآنتیژنی میباشد.آنتیژن RhD یکآنتیژنپروتئینیاستوازنظرساختمانفضاییدارایساختارسوموچهارممیباشد . بهگونهایکهآنتیژن RhD تخلیصشدهازسطح RBC دارایساختمانفضاییاولولیآنتیژنذرهای RhD موجوددرسطح RBC دارایساختمانسومو چهارماست. طبقمطالعههایانجامشده، ساختار سوموچهارمپروتئینهابهدلیلاپیتوپفضایی نسبتبهساختاراولآنهاکهدارایاپیتوپخطی است، ایمونوژنترمیباشندامادرمطالعهحاضر آنتیژنتخلیصشدهازسطح(RBC آنتیژن محلول) RhDتوانستهاستدربهبودایمونیزاسیون آزمایشگاهیمؤثرواقعگرددکهعلتآن خلوصآنتیژنیمیباشد. به گونهایکهدر مطالعههای باروسو وهمکارانوهمچنین چن و همکـاران،خلـوصآنتیژنیبهعنوانیکعاملمهم دربهبودایمونیزاسیونگزارششدهاست(22، 21). نتیجهگیری استفاده از اینترفرون گاما(IFN-γ)، ترکیب آن با اینترلوکین۴ (IL-4) وCpGODN به عنوان بهینهکنندهترین عوامل جهت تولید آنتیبادی از لنفوسیتهای جدا شده به روش فایکول در ایمونیزاسیون آزمایشگاهی شناخته شد. بررسی اثر مخلوط سیتوکاینهای مختلف نیاز به مطالعههای بعدی دارد. تشکر و قدردانی این مقاله حاصل پایاننامه دانشجویی دوره کارشناسی ارشد رشته هماتولوژی و طب انتقال خون در مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون با کد اخلاق IR.TMI.REC.1400.008 میباشد. بودجه این مطالعه توسط مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون تأمین گردیده و همه مراحل علمی پروژه در آزمایشگاه آنتیبادی مونوکلونال انجام شده است.
Amrovani M, Yari F, Milani S, Amoohossein B. Evaluation of effective factors in the optimization of immunization to achieve antibodies against RhD antigen in culture medium. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2022; 19 (4) :257-269 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1457-fa.html
امروانی مهران، یاری فاطمه، میلانی سعیده، عموحسین بهناز. عوامل مؤثر در بهینگی ایمونیزاسیون جهت دستیابی به آنتی بادی علیه آنتیژن RhD در محیط کشت. فصلنامه پژوهشی خون. 1401; 19 (4) :257-269