تولید رده سلولی لنفوبلاستوئید تولید کننده آنتی‌بادی از لنفوسیت‌های B بیماران تالاسمی ایمن شده علیه آنتی‌ژن KELL با ویروس اپشتاین بار پریا احمدی صید محمدی1، زهره شریفی2، آرزو اودی3، سعیده میلانی4 چکیده سابقه و هدف آلوایمیونیزاسیون به علت مواجهه لنفوسیت‌های B با آنتی‌ژن بیگانه به دنبال تزریق خون ناسازگار ایجاد می‌شود. یکی از راه‌های شناسایی آنتی‌ژن‌های گروه‌های خونی، استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال می‌باشد. هدف از مطالعه حاضر، ترانسفورماسیون سلول‌های آلوایمن شده ضد آنتی‌ژن Kell در افراد تالاسمی به کمک ویروس اپشتاین بار و تولید سلول‌های لنفوبلاستوئید تولیدکننده آنتی بادی ضد Kell می‌باشد. مواد و روش‌ها در یک مطالعه تجربی، سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی(PBMC) از 10بیمار تالاسمی ایمن شده علیه آنتی‌ژن KELL به روش گرادیان غلظتی فایکول جدا و با سوپ ویروسی اپشتاین بار به دست آمده از محیط کشت خط سلولی B95-8 به مدت 4 ساعت مواجه شد. پس از گذشت یک تا سه هفته، تولید کلون‌های لنفوبلاستوئیدی تولیدکننده آنتی‌بادی و اختصاصیت آنتی‌بادی تولیدی به ترتیب با مشاهده میکروسکوپی، الایزا و روش میکرو هماگلوتیناسیون بررسی شد. یافته‌ها نتایج به دست آمده نشان داد که مواجهه سلول‌های PBMC بیماران تالاسمی ایمن شده علیه آنتی‌ژن KELL با سوپ ویروسی EBV سبب ایجاد کلون‌های لنفوبلاستوئیدی می‌گردد. بررسی سوپ سلولی کلون‌های تولیدی نشان داد که آنتی بادی تولیدی توسط این سلول‌ها قادر به شناسایی گلبول‌های قرمز حاوی آنتی‌ژن KELL و آگلوتیناسیون آن‌ها با آزمایش میکروهماگلوتیناسیون می‌باشد. نتیجه گیری براساس یافته‌های به دست آمده ترانسفورماسیون PBMC بیماران تالاسمی ایمن شده علیه آنتی‌ژن KELL باعث ایجاد سلول‌های لنفوبلاستوئیدی تولیدکننده آنتی‌بادی ضد این آنتی‌ژن می‌گردد. کلمات کلیدی:آلوایمیونیزاسیون، ویروس اپشتاین بار، لنفوسیت‌های B تاریخ دریافت: 01/03/1401 تاریخ پذیرش: 20/06/1401
1- دانشجوی کارشناسی ارشد خون‌شناسی آزمایشگاهی و بانک خون ـ آزمایشگاه مونوکلونال ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- PhD ویروس شناسی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 3- PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 4- مؤلف مسئول: PhD زیست فناوری پزشکی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه در طول چند دهه گذشته، آنتی‌بادی‌های مونوکلونال به ابزاری کاربردی در تشخیص، درمان و تحقیقات بیوشیمیایی تبدیل شده‌اند(1).آنتی‌بادی‌های مونوکلونال عمدتاً شامل سه نوع، آنتی‌بادی موشی، انسانی و آنتی‌بادی‌های نوترکیب می‌باشند(2). آنتی‌بادی‌های مونوکلونال انسانی به سختی قابل تولید می‌باشند چرا که در مقایسه با نوع موشی که بر ایمن‌سازی حیوان استوار است، ایمن‌سازی انسان به علت مسائل اخلاقی امکان‌پذیر نمی‌باشد(3). آلوایمیونیزاسیون نوعی پاسخ ایمنی علیه آنتی‌ژن‌های بیگانه در پی تزریق فرآورده‌های خونی به خصوص گلبول‌های قرمز و هم‌چنین به دنبال رخداد حاملگی می‌باشد(5، 4). تالاسمی یکی از رایج‌ترین اختلالات وراثتی است که به علت کاهش یا فقدان تولید زنجیره آلفا یا بتای گلوبین به وجود می‌آید(6). اصلی‌ترین رویکرد درمانی در این بیماران، تزریق خون است که از جمله عوارض اصلی آن آلوایمیونیزاسیون می‌باشد(7). بیشترین آلوآنتی‌بادی تولیدی در این بیماران طبق مطالعه‌های انجام شده در ایران، آنتی‌بادی KELL است(4). از سلول‌های ایمن شده این بیماران می‌توان برای تولید آنتی‌بادی مونوکلونال استفاده نمود. یکی از روش‌های تولید آنتی‌بادی‌های مونوکلونال، ترانسفورماسیون سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی توسط ویروس اپشتاین بار می‌باشد. ویروس اپشتاین بار، ویروسی از خانواده هرپس ویروس نوع 4 است که لنفوسیت‌های B را از طریق گیرنده CD21آلوده می‌کند و سبب تقسیم پی در پی سلول‌ها و به وجود آمدن سلول‌های لنفوبلاستوئید تولیدکننده آنتی‌بادی می‌شود(10-8). مهار ترانسفورماسیون سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی(PBMC) به وسیله ویروس اپشتاین بار به علت حضور سلول‌های لنفوسیت T سیتوتوکسیک می‌تواند اتفاق بیوفتد(11). سیکلوسپورین A نوعی داروی سرکوبگر ایمنی می‌باشد که باعث مهار فعال‌سازی سلول‌های T سیتوتوکسیک در in vivoوin vitro می‌شود. در حضور سیکلوسپورین A، مهار ترانسفورماسیون رفع شده و رشد لنفوسیت‌های B ترانسفورم شده افزایش می‌یابد(13، 12). با توجه به اهمیت آنتی‌بادی‌های مونوکلونال درتشخیص خون‌های ناسازگار، هدف این مطالعه ترانسفورماسیون سلول‌های لنفوسیتی آلو ایمن شده بیماران تالاسمی علیه گروه خونی KELL به کمک ویروس اپشتاین بار جهت تولید سلول‌های لنفوبلاستوئید تولیدکننده آنتی‌بادی ضد KELL بود. مواد و روش‌ها مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. در این مطالعه از نمونه خون 10 بیمار تالاسمی ایمن شده علیه آنتی‌ژن KELL استفاده شد. تمامی نمونه‌ها پس از تصویب پروژه و تایید و اخذ کد اخلاق با شماره IR.TMI.REC.1399.025 از سازمان انتقال خون، با مراجعه به درمانگاه تالاسمی ظفر استان تهران با اخذ رضایت‌نامه‌ای که جهت انجام کارهای پژوهشی از بیماران تالاسمی گرفته شده است، تهیه شدند. در این پژوهش گروه مورد بررسی سلول‌های تک هسته‌ای بیماران تالاسمی مواجه یافته با سوپ ویروسی و گروه کنترل منفی مورد استفاده جهت بررسی عملکرد سوپ ویروسی و روند ترانسفورماسیون، سلول‌های تک هسته‌ای بیماران تالاسمی پیش از مواجه با سوپ ویروسی بود. تهیه سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی(PBMC ) : 6 میلی‌لیتر خون حاوی ضد انعقاد EDTA از مرکز تالاسمی ظفر تهیه و با استفاده از روش گرادیان غلظتی فایکول سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی PBMC جداسازی گردیدند(14). تهیه سوپ ویروسی: سلول‌های ترشح‌کننده ویروسEBV به نام B95-8 (در فاز رشد نمایی) در فلاسک‌های 75 میلی‌متری از مرکز ذخایر ژنتیک خریداری شد و در محیط کامل RPMI1640 کشت داده شدند و 7-2 روز بعد از رشد و زرد شدن کامل محیط کشت، مایع رویی برداشته و در فالکون 15 میلی‌لیتری ریخته و با دور g 360 به مدت 7 دقیقه سانتریفوژ شد. مایع رویی با استفاده از سرنگ از فیلتر 22/0 میلی‌متری عبور داده شد و در حجم مورد نظر در میکروتیوپ استریل جمع‌آوری شد و در فریزر(70-) درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. ترانسفورماسیون سلول‌های تک هسته‌ای: بعد از جمع‌آوری سلول‌های تک هسته‌ای، به ازای هر یک میلیون سلول جدا شده یک میلی‌لیتر از سوپ ویروسی اضافه گردید و به مدت 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد دارای 5 درصد CO2 انکوبه شد. هر 15 دقیقه یک بار سلول‌ها به آرامی مخلوط شدند. بعد از سپری شدن زمان انکوباسیون سلول‌ها در پلیت 96 خانه‌ای ته صاف(105 سلول به ازای هر چاهک) در حضور 1/0 میکروگرم بر میلی‌لیتر سیکلوسپورین در محیط کشت RPMI تقسیم و کشت داده شدند. پلیت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد دارای 5 درصد CO2 انکوبه گردید. بعد از 24 ساعت مایع رویی هر چاهک با محیطRPMI تازه حاوی سیکلوسپورین تعویض گردید. تشکیل سلول‌های لنفوبلاستوئید در فواصل زمانی 48 و72 ساعت و یک تا سه هفته بعد از ترانسفورماسیون با میکروسکوپ معکوس بررسی شد. 7 تا 10 روز بعد از کشت سلول‌های مجاور شده با ویروس اپشتاین بار، آزمایش میکروهماگلوتیناسیون جهت تعیین اختصاصیت آنتی‌بادی و آزمایش الایزا جهت تایید تولید آنتی‌بادی انجام شد. تست الایزا: وجود آنتی‌بادی اختصاصی علیه آنتی‌ژن Kell در مایع رویی هر چاهک مورد آزمایش در کنار چاهک‌های کنترل منفی و مثبت با استفاده از آزمایش میکرو هماگلوتیناسیون تایید شد. برای این امر 50 میکرولیتر از مایع رویی هر چاهک به انتهای چاهک 96 خانه‌ای U شکل اضافه شد و50 میکرولیتر از سوسپانسیون 1 تا 2 درصد گلبول‌های قرمز Kell مثبت تهیه شده از ویال‌های غربالگر به چاهک‌ها اضافه گردید. به مدت 45 دقیقه در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه گردید و بعد از این مدت وجود آگلوتیناسیون به طور ماکروسکوپی و میکروسکوپی بررسی شد. تست میکروآگلوتیناسیون: جهت بررسی تولید آنتی‌بادی از پلیت‌های کوت شده با آنتی‌هیومن گلوبولین با غلظت 5 میکروگرم در میلی‌لیتر در آزمایشگاه مونوکلونال سازمان انتقال خون استفاده شد. به این منظور50 میکرولیتر از مایع رویی چاهک‌هایی که آزمایش هماگلوتیناسیون آن‌ها مثبت شد به همراه چاهک‌های کنترل منفی جمع‌آوری شد و به پلیت کوت شده با آنتی‌هیومن افزوده شد. در این آزمایش سرم IgG انسانی با غلظت ng/mL 110 به عنوان کنترل مثبت و چاهک Non-coated به عنوان کنترل منفی الایزا در نظر گرفته شد. پلیت به مدت 40 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه گردید. پس از سه بار شست و شو با بافر PBS-Tween ، 50 میکرولیتر از محلول کونژوگه Anti-Human HRP به هر چاهک افزوده شد و به مدت 40 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه گردید. بعد از سه بار شست و شو با بافر فسفات، به هر چاهک 50 میکرولیتر از محلول سوبسترای تترامتیل بنزیدی(TMB) افزوده شد و بعد از20 دقیقه با افزودن 30 میکرولیتر محلول اسید واکنش متوقف شد. آزمایش در دفعات مختلف انجام و جذب نوری در طول موج nm 450 با دستگاه الایزاریدر خوانده شد. نرم‌افزار آماری و آزمون آماری: مقادیر جذب نوری به دست آمده از روش الایزا از دفعات مختلف کاری، جمع‌آوری شد. سپس میانگین و انحراف معیار و مقدار p با استفاده از نرم‌افزار تحلیل آماری R محاسبه شد. یافته‌ها بــا تـرانسفـورمـاسیون سلول‌هــای لنفوسیتــی، شروع تغییرات مورفولوژیکی سلول‌ها که شامل افزایش سایز سلول و شروع تشکیل کلون‌های سلولی بود، بعد از 48 ساعت از مواجهه با ویروس EBV مشاهده شد. تغییرات سلول‌ها و شکل‌گیری کلون سلولی در روزهای مختلف در شکل نشان داده شده است(شکل 1). بعد از گذشت 14-7 روز، آزمایش هماگلوتیناسیون در
پلیت‌های U شکل مطابق روش بیان شده انجام گردید. بررسی میکروسکوپی چاهک‌های انجام شده، مثبت شدن تعدادی از چاهک‌ها را تایید نمود(شکل 2). بررسی آزمایش الایزای چاهک‌هایی که میکروهماگلوتیناسیون آن‌ها مثبت بود در مقایسه با کنترل مثبت و منفی نتیجه قابل قبولی را نشان داد(جدول 1).
بحث
تولید خط سلولی لنفوبلاستوئید یکی از ارزشمندترین دستاوردهای علم بیوتکنولوژی به شمار می‌رود. از جمله کاربردهای سلول‌های لنفوبلاستوئید می‌توان به عرضه آنتی‌ژن در ارزیابی‌های ایمونولوژیک، تولید آنتی‌بادی‌های مونوکلونال انسانی و رفع محدودیت دسترسی به نمونه بیولوژیک مورد نظر با تولید منبع سلولی نامحدود از نمونه اولیه اشاره کرد. دستیابی به سلول لنفوبلاستوئید تولیدکننده آنتی‌بادی مستلزم حساس‌سازی سلول‌ها علیه آنتی‌ژن مورد نظر در بدن حیوانـات آزمایشگاهـی و یا در محیـط کشـت می‌باشد که این مسأله خود زمانبر بوده و با توجه به متفاوت بودن شرایط آزمایشگاهی با بدن انسان، نتیجه مطلوب و مورد نظر را می‌تواند به همراه نداشته باشد. از طرفی ایمن‌سازی انسان علیه آنتی‌ژن خاص نیز به دلیل مسائل اخلاقی مقدور نیست. عارضه ایمن شدن علیه آنتی‌ژن‌های گروه‌های خونی یکی از مشکلاتی است که به علت تزریق خون‌های مکرر در بیماران تالاسمی رخ می‌دهد. از طرفی بیشترین آلوآنتی‌بادی تولیدی در این بیماران طبق مطالعه‌های انجام شده در ایران، آنتی‌بادی KELL می‌باشد(15). با توجه به اهمیت و کاربرد گسترده آنتی‌بادی‌های مونوکلونال، در این مطالعه برای اولین بار در ایران موفق شدیم با جداسازی سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی بیماران تالاسمی ایمن شده علیه آنتی‌ژن KELL طـی تزریق خون‌های مکرر به روش گرادیان غلظتی فایکول و با استفاده از روش EBV-Transformation به تولید خط سلولی لنفوبلاستوئید تولیدکننده آنتی‌بادی بپردازیم. پیشتر فانگ و همکارانش با توجه به اهمیت آلو‌آنتی‌بادی‌های انسانی به عنوان ابزار بالینی مهم در آزمایش‌های تشخیصی آزمایشگاهی مانند تعیین گروه‌های خونی برای تزریق خون و پیوند بافت و هم‌چنین در زمینه درمان مانند پیشگیری از بیماری همولیتیکی نوزادان ناشی از مغایرت سیستم گروه خون Rh ، به فکر تولید Anti-A از خون محیطی افراد طبیعی افتادند. فانگ بیان داشت که با جداسازی سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی افراد طبیعی و استفاده از روش EBV-Transformation ، امکان تولید خط سلولی لنفوبلاستوئید تولیدکننده Anti-A در آزمایشگاه وجود دارد. آن‌ها جهت حذف سلول‌های سیتوتوکسیک از روش روزت استفاده نمودند و جهت پایداری کلون حاصل از امتزاج سلول‌های لنفوبلاستویید با سلول‌های میلومایی بهره بردندو موفق به تولید آنتی‌بادی شدند(16). هم‌چنین پاشا با اشاره به اهمیت آنتی‌بادی مونوکلونال انسانی اختصاصی علیه سیستم Rh و کاربرد آن در تعیین گروه خونی و ممانعت از اریتروبلاستوز، به طراحی پژوهشی براساس جداسازی سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی خانمی با سیستم Rh- و سابقه حاملگی با جنین Rh+ و ترانسفورماسیون سلول‌ها با استفاده از ویروس اپشتاین بار پرداخت (17). فراسن و همکارانش نیز از EBV-Transformation برای تولید خط سلولی لنفوبلاستوئید استفاده نمودند. از جمله تفاوت‌هایی که پژوهش آن‌ها نسبت به کارهای پیشین و حتی پژوهش ما داشته و باعث افزایش کارآیی ترانسفورماسیون با توجه به نتایج حاصل از کار به بیش از 80 درصد شده بود، جداسازی اختصاصی سلول‌ها با روش FACS Aria بود که اختصاصاً لنفوسیت‌های B جدا و با اپشتاین بار مواجه شده بود(18). لمسکایا با اشاره به این که بسیاری از مطالعه‌های ژنتیکی و مولکولی نیازمند نمونه بیولوژیکی تجدیدپذیر می‌باشند، به بیان روش اصلاح شده EBV-Transformation پرداخت. از جمله مزیت‌های استفاده از خون محیطی، سهولت دستیابی به آن می‌باشد اما بارزترین مشکل آن طول عمر کوتاه سلول‌های خون محیطی است. ویروس اپشتاین بار قادر است لنفوسیت‌های B خون محیطی انسان را به سلول‌های تکثیرشونده به صورت نامحدود تبدیل کند که این سلول‌ها قابل نگهداری در محیط کشت می‌باشند. لمسکایا با جداسازی پلاسمای خون محیطی و مجاورسازی آن با سوپ ویروسی به کشت سلول‌ها در حضور سیکلوسپورین A پرداخت. نتایج حاصل از کار اشاره به موفقیت نامیراسازی سلول‌های B در کنار دیگر سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی در مدت زمان کوتاه با حجم کم نمونه دارد(19). در پژوهش حاضر نیز با دریافت حجم کم نمونه خون بیماران تالاسمی موفق به تولید خط سلولی لنفوبلاستوئید تکثیر شونده شدیم. بهبود کارآیی EBV-Transformation مستلزم استفاده از ترکیبات سرکوبگری مانند سیکلوسپورین می‌باشد. سیکلوسپورین مهارکننده تولید سایتوکین‌ها و رهاسازی اینترلوکین‌ها محسوب می‌شود که منجر به کاهش فعالیت سلول‌های T سیتوتوکسیک می‌گردد(20). پلوکین و همکارانش با بررسی اثر سیکلوسپورین در حذف سلول‌های سیتوتوکسیک از محیط کشت در روش EBV-Transfusion ، شاهد تداوم تکثیر سلول‌های لنفوبلاستوئید بودند(11). هم‌چنین چائگ لیو طی بررسی‌هایی که بر روش‌های متفاوت EBV-Transformation داشت، بیان کرد سیکلوسپورین با حذف لنفوسیت‌های سیتوتوکسیک، تاثیر مثبتی در روند تولید خط سلولی لنفوبلاستوئید دارد(21). در پژوهش حاضر نیز افزودن محیط کشت حاوی سیکلوسپورین با حذف اثر لنفوسیت‌های سیتوتوکسیک، سبب بهبود روند ترانسفورماسیون و افزایش تعداد کلون‌های حاصل شد. با توجه به بررسی مطالعه‌های پیشین و نتایج به دست آمده از مطالعه کنونی، نشان داده شد که مواجهه سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی بیماران تالاسمی آلو ایمن ضد آنتی‌ژن KELL با ویروس EBV با استفاده از روش EBV-Transformation سبب تولید خط سلولی لنفوبلاستوئید تولید آنتی‌بادی ضد KELL می‌گردد. نتیجه‌گیری کلون‌های سلولی لنفوبلاستوئید تولید کننده آنتی‌بادی ضد KELL که از ترانسفورماسیون سلول‌های حسـاس شده افـراد تالاسمی علیه گروه خونی KELL در پی تزریق خون‌های سازگار به وجود آمده‌اند با ویروس EBV ، قادر به تشخیص و آگلوتیناسیون گلبول‌های قرمز حاوی این آنتی‌ژن در محیط کشت می‌باشد. آنتی‌بادی تولیدی می‌تواند به عنوان ابزاری جهت غربالگری و تشخیص گروه‌های خونی سازگار در بیماران نیازمند تزریق مداوم خون مورد استفاده قرار گیرد. تشکر و قدردانی این مقاله حاصل پایان‌نامه دانشجویی دوره کارشناسی ارشد رشته هماتولوژی و طب انتقال خون مرکز تحقیقات مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون با کد اخلاقIR.TMI.REC.1399.025 می‌باشد. بودجه این مطالعه توسط مؤسسه آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون تأمین گردیده و همه مراحل عملی پروژه در مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون انجام شده است.
Ahmadi Sead Mohammadi P, Sharifi Z, Oodi A, Milani S. Evaluation of the development of specific lymphoblastoid cell line producing antibody from B lymphocytes in thalassemia patients immunized against KELL antigen by Epstein-Barr virus. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2023; 20 (1) :11-18 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1449-fa.html
احمدی صید محمدی پریا، شریفی زهره، اودی آرزو، میلانی سعیده. تولید رده سلولی لنفوبلاستوئید تولید کننده آنتی‌بادی از لنفوسیت‌های B بیماران تالاسمی ایمن شده علیه آنتی‌ژن KELL با ویروس اپشتاین بار. فصلنامه پژوهشی خون. 1402; 20 (1) :11-18
