جلد 20، شماره 2 - ( تابستان 1402 )
جلد 20 شماره 2 صفحات 133-123 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Alavi P, Chegini A, Samiee S, Alaie M. Changes in the amount of mitochondrial DNA during storage in RBCs and Leukoreduced red blood cells. bloodj 2023; 20 (2) :123-133
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1444-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1444-fa.html
علوی پویا، چگینی آزیتا، سمیعی شهرام، علایی مستانه. تغییرات میزان میتوکندریالDNA طی نگهداری در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم و گلبول قرمز کم لکوسیت. فصلنامه پژوهشی خون. 1402; 20 (2) :123-133
استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
متن کامل [PDF 767 kb]
(664 دریافت)
| چکیده (HTML) (1187 مشاهده)
مقدمه
11 درصد بیماران بستری شده در بیمارستان(تقریباً یک نفر از هر 10 نفر) به تزریق خون نیاز دارند(1). بنابراین تهیه خون کافی و سالم ارتباط مستقیمی با سلامت عمومی جامعه دارد. اما علی‌رغم این نقش حیاتی، انتقال خون به عنوان یک شمشیر دو لبه عمل می‌کند و ممکن است عوارضی اعم از ایمونولوژیک و غیر ایمونولوژیک داشته باشد. واکنش‌های ایمونولوژیک شامل آسیب حاد ریوی مرتبط با انتقال خون(TRALI)، واکنش‌های همولیتیک، واکنش‌های آلرژیک، واکنش‌های تب‌زا، بیماری پیوند علیه میزبان ناشی از انتقال خون، پورپورای ناشی از انتقال خون و ایمونومودولاسیون(immunomodulation) هستند. واکنش غیر ایمونولوژیک شامل انتقال عوامل عفونی، گرانباری گردش خون، همولیز فیزیکی و شیمیایی و کاهش فشار خون می‌باشند(2). TRALI یک واکنش خطرناک ناشی از انتقال خون است که به صورت حاد رخ داده و با ادم ریوی به دنبال تزریق فرآرده‌های خونی همراه است(3). علی‌رغم مطالعه‌های زیاد، هنوز پاتوفیزیولوژی TRALI به صورت کامل شناسایی نشده و به همین دلیل درمان آن عموماً به صورت غیر اختصاصی و حمایتی است. برای مدت طولانی، علت بروز TRALI، وجود لکوآگلوتینین (آنتی‌بادی‌ها) فرد اهداکننده علیه آنتی‌ژن‌های HLA و HNA فرد گیرنده در نظر گرفته می‌شد. ولی این فرضیه مورد شک قرار گرفت، زیرا تنها درصد کمی از پلاسمای اهداکنندگان دارای آنتی‌بادی‌های ضد HNAو HLA هستند(4). به تدریج ایده دیگری در خصوص وجود واسطه‌های بیوشیمیایی و التهابی مثل میکروپارتیکل‌ها و الگوهای مولکولی مرتبط با آسیب(DAMP : Damage Associated molecular pattern) به عنوان تحریک واکنش TRALI در نظر گرفته شد(5).
فرآورده‌های کنسانتره گلبول قرمز به عنوان پر کاربردترین فرآورده‌های خونی در درمان بسیاری از اختلالات خونی و غیر خونی استفاده می‌شود. امروزه مدت زمان نگهداری کنسانتره گلبول قرمز، بسته به مواد افزوده شده به کیسه فرآورده بین 35 تا 42 روز است. آسیب‌های گلبـول قـرمز حیـن نگهـداری کـه بـه نــام آسیـب دوران
ذخیره‌سازی شناخته می‌شوند، برای مدت‌های طولانی مورد مطالعه قرار گرفته‌اند و با این حال اهمیت بالینی این آسیب‌ها هنوز به صورت کامل شناسایی نشده است. آسیب دوران ذخیره‌سازی باعث کاهش عملکرد گلبول‌های قرمز می‌شوند که از جمله می‌توان به کاهش انعطاف‌پذیری، کاهش قابل توجه ATP و در نتیجه کاهش توانایی گلبول‌های قرمز برای اکسیژن‌رسانی اشاره کرد. هم‌چنین استرس اکسیداتیو یکی از شایع‌ترین آسیب‌های دوران ذخیره‌سازی است که با افزایش عوارض ناشی از انتقال خون پس از تزریق گلبول قرمز همراه است(6). DAMP ها که به عنوان آلارمین‌ها نیز شناخته می‌شوند، گروهی از بیومولکول‌های وابسته به میزبان هستند که در شرایط خاص مثل تروما، آسیب بافتی و استرس سلولی رها می‌شوند و به عنوان سیگنال‌های خطر اندوژن عمل کرده و باعث القای پاسخ التهابی از طریق فعال کردن سیستم ایمنی طی التهاب غیر عفونی می‌شوند(8، 7). از جمله مهم‌ترین انواع DAMP ها می‌توان به DNA (اعم از DNA ژنومی و DNA میتوکندریایی) متابولیت‌های پورینی و پروتئین گروه با تحرک بالا(HMGB ؛ High-mobility group protein) اشاره کرد. بر اساس مطالعه‌ها نشان داده شده که DNAs به همراه HMGB1 ها می‌توانند در بسیاری از واکنش‌های بیولوژیکی دخیل باشند و این فاکتورها می‌توانند بر روی واکنش‌های التهابی و هم‌چنین تحریک سیستم ایمنی اثرگذار بوده و به واسطه فعال کردن مسیرهای سیگنالینگ NF-kB باعث تولید واسطه‌های التهابی گردند.
میتوکندری‌ها به عنوان کارخانه انرژی سلول شناخته می‌شوند، اندامک‌های منحصر به فردی هستند که دارای DNA اختصاصی(mtDNA) می‌باشند. mtDNA انسانی به صورت DNA دو رشته‌ای حلقوی بوده و دارای 16529 جفت باز است و rRNA وtRNA میتوکندریایی و نیز 13 واحد از پروتئین‌های زنجیره تنفسی را کد می‌کند(9). طی استرس‌های سلولی و میتوکندریایی، قطعاتی از mtDNA جدا شده و وارد گردش خون می‌شود که به عنوان mtDNA DAMPs خوانده می‌شوند.mtDNA DAMPs با اتصال به TLR-9 (Toll Like Receptor-9) منجر به فعال شدن فرآیند التهابی می‌شود (10). مطالعه‌های مختلف نشان داده‌اند که سطح mtDNA DAMPs در پلاسمای بیماران مبتلا به سندروم پاسخ التهابی سیستمی ناشی از تروما افزایش می‌یابد و با افزایش میزان مرگ و میر همراه است(12، 11). هم‌چنین سطح mtDNA DAMPs در بیماران مبتلا به سپسیس و سندروم دیسترس تنفسی حاد(ARDS) افزایش می‌یابد و با افزایش مرگ و میر همراه است(13).
مطالعه‌های آزمایشگاهی در سطح کشت سلولی و حیوانات آزمایشگاهی نشان داده‌اند که mtDNA DAMPs منجر به آسیب سلول‌های اندوتلیال و ادم ریوی می‌شوند(14، 12). طی فرآیند تهیه فرآورده‌های RBC، پلاکت‌ها و گلبول‌های سفید به مقادیر مختلف در فرآورده باقی می‌مانند و می‌توانند به عنوان منبعی برای رهاسازیmtDNA DAMPs عمل کنند. با توجه به موارد ذکر شده، وجود mtDNA DAMPs در فرآورده خونی می‌تواند به عنوان یکی از مارکرهای کیفیت فرآورده و عوامل تحریک‌کننده آسیب سلول‌های اندوتلیال و بروز واکنش TRALI عمل کند. با توجه به این که هنوز مطالعه‌ای در زمینه ارزیابی میزان mtDNA DAMPs و مقایسه آن در فرآورده‌های گلبول قرمز تهیه شده به روش‌های مختلف در ایران انجام نشده، هدف از این پژوهش، ارزیابی سطح mtDNA DAMPs در فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت در مقایسه با گلبول قرمز متراکم (بدون کاهش لکوسیت) طی زمان نگهداری در روزهای 0، 5 و 35 بود.
مواد و روش‌ها
این مطالعه از نوع توصیفی مقطعی بود. در این مطالعه واحدهای گلبول قرمز فرآوری شده با روش سانتریفوژ از خون کامل(شامل PRBCs وکم لکوسیت) اهداکنندگان مراجعه‌کننده به مرکز نوآوری‌های سازمان انتقال خون ایران تهیه گردید. بر روی تعداد ۱۵ واحد گلبول قرمز متراکم تهیه شده از خون کامل و ۱۵ عدد گلبول قرمز کم لکوسیت از اهداکنندگان داوطلب با کسب رضایتنامه آگاهانه جهت استفاده محصول در کار تحقیقاتی بررسی انجام شد(15). خونگیری با رعایت اصول صحیح و به صورت استریل از اهداکنندگان مستمر انجام گرفت. معیار ورود به مطالعه اهداکنندگان جنس مرد، سن 35 تا 50 سال و با هموگلوبین 13 تا 16 بودند تا کیسههای گلبول قرمز دارای شرایط یکسانی باشند و انتخابی از نظر گروه خونی صورت نگرفت.
سپس تمامی کیسههای قابل نگهداری تا 35 روز(حاوی ماده ضد انعقاد CPDA1)، در شرایط استاندارد در یخچال ویژه بانک خون با دمای 6-2 درجه سانتی‌گراد نگهداری و مرتباً زنجیره سرمای آن کنترل و در چارت مخصوص ثبت گردید. شـماره و برچسـبی خـاص بـر روی کیسههای مختلف گلبول قرمز تهیـه و چسـبانیده شـدند. در واقع به هـر کیسـه، کـد شناسـه مخصوص این مطالعه اختصاص داده شـد. هـم چنین تاریخ تهیه و تحویل فـرآورده در چـک لیسـت‌هـای مخصوص ثبت گردید. نمونـه‌گیـری از تمامی کیسه‌ها با شرایط استریل، به روشی همانند و در سیستم بسته صورت گرفت و در دمای 2 تا 4 درجه به آزمایشگاه منتقل شد و توسط سل کانتر کالیبره از نظر شمارش گلبول سفید، پلاکت و گلبول قرمز مورد ارزیابی قرار گرفت. برای مقایسه بین خون تازه(تا 5 روز) و آخرین روزی که امکان استفاده گلبول قرمز متراکم هست، در روزهای 5 و 35 نمونه‌برداری از کیسه‌ها انجام گرفت. نمونههای گرفته شده به مدت 20 دقیقه در دور g 2500 و در دمای 4-2 درجه سانتریفوژ شده و سوپرناتانت در کرایو ویال ریخته شده و در دمای منفی 80 درجه سانتی‌گراد فریز شدند.
در ابتدا mtDNA برای کنترل مثبت واکنش Real-time PCR و رسم منحنی استاندارد تهیه گردید. استخراج mtDNA با استفاده از کیت qiamp blood DNA mini kit (کیاژن ـ آلمان) صورت گرفت.
آغازگرها(پرایمرها) به صورت لیوفیلیزه و هر کدام از آن‌ها با استفاده از محلولTAE (Tris-acetate-EDTA) به غلظت μM 100 رسانیده شد و 2 تا 3 دقیقه ورتکس فیوژ گردید و محلول استوک به دست آمد. برای هر چند بار استفاده آغازگرهای استوک با استفاده از آب مقطر استریل، اتوکلاو شده به غلظت µM 10 رسانده شدند. سپس برای NADH) ND6 دهیدروژناز زیر واحد 6) کـــه اختصاصـی
mtDNA میباشد، طبق جداول 2، 3، RT PCR با سایبرگرین انجام شد و منحنیهای تکثیر و منحنیهای ذوب این آغازگر تجزیه و تحلیل گردیدند(شکل1)(جداول 2 و 3).
جهت انجام Real time PCR برای ژن هدف ND6و رفرانس ژن B2M (Beta-2-Microglobulin) انتخاب شده طبق دستورالعمل کیت Jena (بیوساینس) مسترمیکس، آغازگر و آب مقطر بر روی یخ به میکروتیوب اضافه شد. قابل ذکر است که پیش از استفاده از مسترمیکس و آغازگرها و پس از اضافه شدن هر کدام از اجزای واکنـش،
میکروتیوب ورتکس فیوژ میگردید.
برای تهیه منحنی استاندارد برای ژنهای ND6 و B2M و تعیین کارآیی آغازگرها پس از تهیه رقتهای سریالی برای محصولات ژنهایB2M و ND6 ، برای هر رقت،Real-time PCR به صورت داپلیکیت انجام گردید و برای هر ران کاری کنترل منفی(NTC) نیز گذاشته شد. سپس منحنی استاندارد توسط نرم‌ا فزار Rotor-gene به صورت خودکار رسم گردید و میزان کارآیی هر آغازگر محاسبه شد. برای نمونههای DNA استخراج شده در روزهای 0، 5 و 35 کیسههای مورد و کنترل طبق دستورالعملهای ذکر شده برای ژن هدف و رفرانس ژن،Real-time PCR به صورت داپلیکت انجام شد. پس از تکثیر mtDNA و ژن کنترل داخلی و تجزیه و تحلیل اختصاصیت توسط منحنی ذوب و بررسی عدم وجود آلودگی با توجه به منحنی تکثیر NTC ، طبق منحنی استاندارد و فرمول، تعداد کپیهای mtDNA به صورت کمی مطلق محاسبه گردید.
یافته‌ها
نتایج نشان داد که میانگین هموگلوبین در کیسههای خون مورد بررسی 3/4 ± 6/17 گرم در دسی‌لیتر بود. میانگین پلاکت در آن‌ها نیز 60/50 ± 02/132 هزار در میلی‌متر مکعب خون و هم چنین میانگین شمارش گلبول‌های قرمز نیز 14/0 ± 07/6 میلیون در هر میکرولیتر خون و در نهایت میانگین شمارش گلبول‌های سفید در تمامی کیسههای خون مورد بررسی نیز 3/2 ± 98/4 به ازای هر میکرولیتر از خون به دست آمد. بـررسی ارتبـاط میـزان سطـح mtDNA در گروه‌هــای گلبول قرمز متراکم و گلبول قرمز کم لکوسیت و در روزهای صفر، 5 و 35 و مقایسه میانگین تعداد نسخه DNA میتوکندریال آزاد (کپی نامبر mtDNA) در دو گروه گلبول قرمز متراکم و گلبول قرمز کم لکوسیت انجام شد. نتایج نشان داد که میانگین کپی نامبر mtDNA در روز صفر در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم 83/0 ± 227/2 بود در حالی که در فرآورده گلبول‌های قرمز کاهش لکوسیت یافته 23/1 ± 552/2 مشاهده گردید. میزان تغییرات ND6 در روز پنجم در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم 73/0 ± 687/1 بود در حالی که در فرآورده گلبول‌های قرمز کاهش لکوسیت یافته 38/1 ± 049/2 بود. هم چنین میزان تغییرات ND6 در روز 35 در فرآورده‌های گلبول‌های قرمز متراکم 62/0 ± 566/1 بود در حالــی کــه در فـرآورده گلبول‌هـای قرمـز
WBC در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم و گلبول‌های قرمز کم لکوسیت وجود داشت ولی این ارتباط بین آن‌ها از نظر آماری معنادار نبود.
بحث
فرآورده‌های خونی یکی از فاکتورهای اصلی در درمان بسیاری از بیماری‌ها از جمله بیماری سیکل سل، تالاسمی و بسیاری از بیماری‌های دیگر میباشد. استفاده از فرآورده‌های خون برای درمان بیماران نتایج قابل قبولی داشته و در بسیاری از شرایط باعث بهبود وضعیت بالینی آن‌ها می‌گردد(16). این در حالی است که استفاده از این فرآورده‌ها در شرایطی می‌تواند دارای یک سری عوارض خاص برای بیماران باشد. بر اساس مطالعه‌ها نشان داده شده که عدم سازگاری فرآورده‌های خونی بین دهنده و گیرندگان می‌تواند باعث بروز واکنش‌های ناشی از تزریق خون در گیرندگان خون گردد(17). علاوه بر بروز واکنش‌های ناشی از تزریق خون، ذخیره‌سازی فرآورده‌های خون نیز می‌تواند در بروز واکنش‌های ناشی از تزریق خون مؤثر باشد. بدین منظور مطالعه‌ها نشان داده‌اند که ذخیره‌سازی فرآورده‌های خون می‌تواند بر روی سلول‌های خونی و هم چنین سیستم ایمنی و سیستم فیزیولوژیکی گیرندگان خون تأثیرگذار باشد. یکی از فاکتورهایی که در طول ذخیره‌سازی در فرآورده‌های خون از جمله کیسههای گلبول قرمز متراکم و پلاکت تولید می‌گـردد، mtDNA می‌باشــد. مطالعه‌هـا نشان داده‌انـد کـه mtDNA می‌تواند به عنوان یک فاکتور مولکول‌های پاتوژن مرتبط با آسیب یا DAMP باشد و باعث تحریک سیستم ایمنی و القای واکنش‌های التهابی گردد(18). از طرفی نشان داده شده که تزریق فرآورده‌های خون حاوی mtDNA به بیماران می‌تواند بر روی سیستم ایمنی آن‌ها تاثیرگذار باشد و باعث وخیم‌تر شدن شرایط بالینی آن‌ها گردد. تاکنون مطالعه‌های بسیار کمی در ارتباط با میزان کپی نامبر mtDNA در فرآورده‌های خون گلبول قرمز متراکم انجام شده است. با این حال اطلاعات به دست آمده دارای نتایج ضد و نقیضی میباشد و نتیجه‌گیری کلی در ارتباط با میزان کپی نامبر mtDNA در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم(packed cell) ارایه نکرده‌اند. ما در این مطالعه به ارزیابی میزان کپی نامبر mtDNA در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم و گلبول‌های قرمز کم لکوسیت و ارتباط آن با مدت زمان ذخیره‌سازی فرآورده‌ها پرداختیم.
بر روی تعداد ۱۵ واحد گلبول قرمز متراکم تهیه شده از خون کامل و ۱۵ عدد گلبول قرمز کم لکوسیت از اهداکنندگان تحقیق انجام گردید. هدف از مطالعه، ارزیابی میزان mtDNA در این فرآورده‌های خون در روزهای صفر، پنج و 35 روز پس از ذخیره‌سازی آن‌ها بود. قبل از اندازه‌گیری کپی نامبر mtDNA ، برخی از اندکس‌های شمارش کامل گلبول‌های قرمز در کیسههای خون مورد ارزیابی قرار گرفت که به شرح زیر میباشد. بر این اساس نتایج نشان داد که میانگین هموگلوبین در کیسههای خون 3/4 ± 6/17 گرم در دسی‌لیتر و میانگین پلاکت نیز 60/50 ± 02/132 هزار در میلی‌متر مکعب خون بود. هم‌چنین میانگین شمارش گلبول‌های قرمز نیز 14/0 ± 07/6 میلیون در هر میکرولیتر خون بود. و در نهایت میانگین شمارش گلبول‌های سفید در کیسه خون نیز 3/2 ± 98/4 به ازای هر میکرولیتر از خون بود. میزان کپی نامبر mtDNA در فرآورده گلبول قرمز متراکم در مقایسه با فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت در روزهای 5 و 35 روز از ذخیره‌سازی فرآورده‌ها بیشتر بود که این اختلاف بین آن‌ها از نظر آماری هم معنادار بود(05/0p< ).
مطالعه‌ای توسط لی و همکاران انجام گرفت. در این مطالعه هدف بررسی میزان mtDNA در فرآورده‌های گلبول قرمز، پلاکت و پلاسمای تازه منجمد بود. mtDNA که در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفته بود شامل COX1 ، ND1 و ND6 بود. نشان داده شد که میزان mtDNA در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم، فرآورده‌های پلاسمایی و گلبول‌های قرمز کم لکوسیت افزایش یافته بود در حالی که بیشترین میزان mtDNA در فرآورده‌های پلاسمایی وجود داشت. پس از بررسی‌های بیشتر نشان داده شد که افزایش میزان mtDNA در فرآورده‌های خون می‌تواند همراه با بروز عوارض آسیب ریوی مرتبط با تزریق خون در بیماران باشد. در نهایت آن‌ها نتیجه‌گیری کردند که افزایش میزان mtDNA در فرآورده‌های خون همراه با بروز آسیب‌های ریوی حاد مرتبط با تزریق خون در بیماران است(19).
سیمونس و همکاران مطالعه‌ای به منظور ارزیابی میزان DAMP (mtDNA) در فرآورده‌های خون شامل گلبول‌های قرمز، پلاسمای تازه منجمد و فرآورده‌های پلاکتی انجام دادند. پس از ارزیابی‌ها نتایج نشان داد که میزان mtDNA در فرآوده‌های پلاکتی و پلاسمایی در مقایسه با سایر فرآورده‌ها بیشتر بود. هم چنین آن‌ها نشان دادند که افزایش میزان mtDNA در طول دوران نگهداری در فرآورده‌های خون همراه با افزایش میزان بروز سندروم زجر تنفسی در بیماران بود. از این رو این طور نتیجه‌گیری کردند که افزایش میزان mtDNA در فرآورده‌های خون در طول ذخیره‌سازی می‌تواند همراه با خطر بروز عوارض در بیماران باشد که نیازمند اتخاذ استراتژی‌های مناسب در طول درمان بیماران با استفاده از فرآورده‌های خون میباشد(20). مطالعه‌ای که توسط شی و همکاران به منظور مقایسه میزان mtDNA در گلبول‌های قرمز کامل فیلتر شده و فرآورده گلبول‌های قرمز متراکم فیلتر شده انجام گرفت، نشان داده شد که میزان mtDNA در فرآورده‌های خون تازه در مقایسه با فرآورده‌های خون ذخیره شده بیشتر بود. علاوه بر این مشخص گردید که میزان mtDNA در فرآورده‌های خون کامل در مقایسه با فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم بیشتر بود که این اختلاف‌ها از نظر آماری معنادار بود. به عبارت دیگر در مطالعه شی تاثیر روش‌های آماده کردن فرآورده‌های خون بر روی میزان mtDNA نیز بررسی شد. نتایج نشان داد که میزان mtDNA در فرآورده‌هایی که خون کامل قبل از تهیه فرآورده با استفاده از فیلتر به دست آمده بود در مقایسه با گلبول‌های قرمز متراکم که با استفاده از فیلتراسیون تهیه گردیده بودند بیشتر بود(21). این مطالعه همسو با تحقیق ما بود.
مطالعه دیگری توسط باکور و همکاران به منظور ارزیابی میزان وزیکول‌های خارج سلولی و mtDNA در فرآورده‌های خون انجام گرفت. در این مطالعه از فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم، خون کامل، فرآورده‌های آفرزیس شده و فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت استفاده گردید. نتایج نشان داد که میزان mtDNA در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم و فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت با افزایش میزان مدت زمان ذخیره‌سازی افزایش یافته بود. بر این اساس مشخص شد میزان mtDNA در فرآورده‌هایی که به مدت 42 روز ذخیره‌سازی شده بودند در مقایسه با فرآورده‌هایی که 5 روز از زمان نگهداری آن‌ها گذشته بود، بیشتر بود که این اختلاف از نظر آماری معنادار بود(05/0 p<)(15). علاوه بر این با افزایش میزان mtDNA در فرآورده‌ها، وزیکول‌های خارج سلولی نیز در فرآورده‌های خون با افزایش مدت زمان ذخیره‌سازی در فرآورده‌های خون افزایش یافته بود. نتایج این مطالعه با نتایج مطالعه حاضر همسو بود. یاسوئی و همکاران مطالعه‌ای به منظور ارزیابی میزان mtDNA در فرآورده‌های خون از جمله گلبول‌های قرمز متراکم، پلاکت‌ها، پلاسمای تازه منجمد و گلبول‌های قرمز کم لکوسیت انجام دادند. پس از ارزیابی و تجزیه و تحلیل داده‌ها نتایج نشان داد که میزان mtDNA در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم در مقایسه با سایر فرآورده‌ها بیشتر بود. هم چنین نشان داده شد که افزایش میزان mtDNA در فرآورده‌ها همراه با افزایش خطر بروز واکنش‌های غیرهمولیتیک مرتبط با تزریق خون در گیرندگان بود به طوری که هر چه میزان mtDNA در فرآورده‌ها بیشتر به دست آمد، خطر بروز عوارض در گیرندگان نیز افزایش یافت(22).
در مطالعه حاضر نتایج نشان داد که ارتباط مستقیمی بین میزان WBC و کپی نامبر mtDNA در فرآورده‌های پکدسل و فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت وجود داشت. هر چه میزان WBC در فرآورده‌های خون بیشتر بود میزان کپی نامبر mtDNA نیز افزایش یافته بود. مطالعه‌ای توسط تیکسترا و همکاران به منظور ارزیابی ارتباط میزان گلبول‌های سفید با میزان mtDNA در فرآورده‌های پلاکتی تهیه شده با روش‌های پلاسمای غنی از پلاکت و روش بافی‌کوت انجام شد. نتایج نشان داد که میزان mtDNA در فرآورده‌های کم لکوسیت در مقایسه با فرآورده‌های دیگر کمتر بود و میزان گلبول‌های سفید و قطعات آن در فرآورده‌های تهیه شده با روش بافی‌کوت در مقایسه با روش‌های دیگر همانند روش پلاسمای غنی از پلاکت بیشتر بود(23). مطالعه دیگری توسط فوچز و همکاران بر روی کیسههای خون که از سگ‌ها جمع‌آوری شده بود، انجام گرفت. آن‌ها نشان دادند نشانگرهای NET در طول ذخیره‌سازی RBC افزایش یافـت و در کیسه‌هـای غیـر کم
لکوسیت بیشتر از واحدهای کم لکوسیت بود(24).
در مطالعه حاضر نتایج نشان داد که در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم، تعداد نسخه میتوکندریال آزاد(Mitochondrial copy number) DNA با میزان پلاکت‌ها در فرآورده رابطه مستقیمی داشت، این در حالی بود که مشخص گردید میزان کپی نامبر mtDNA با میزان پلاکت‌ها در فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت ارتباط داشت. به عبارت دیگر نشان داده شد که هر چه میزان پلاکت در فرآورده‌ها بیشتر باشد، میزان کپی نامبر mtDNA در فرآورده‌ها نیز افزایش می‌یابد. در مطالعه‌ای که توسط کوگناس و همکاران انجام گرفت، نشان داده شد که افزایش میزان پلاکت در فرآورده‌ها همراه با افزایش میزان mtDNA بود. از طرف دیگر نشان داده شد که با افزایش مدت زمان ذخیره‌سازی فرآورده‌های پلاکتی، میزان mtDNA در آن‌ها افزایش می‌یابد(25).
نتیجه‌گیری
تعداد نسخه mtDNA آزاد در فرآورده‌های گلبول قرمز
متراکم بیشتر از کم لکوسیت بود و ارتباط مستقیمی بین میزان WBC و تعداد نسخه mtDNA آزاد مشاهده گردید. هر چه میزان پلاکت بیشتر بود، میزان تغییرات mtDNA نیز افزایش پیدا کرده بود(0001/0 p<).
تشکر و قدردانی
این مقاله حاصل پایان نامه دانشـجویی دوره کارشناسـی ارشـد رشتـه خونشناسـی مـــرکز تحقیقات مؤسسه عالـی آموزشـــی و پژوهشـــی طـــب انتقـــال خـــون بـــا کـــد اخلاق IR.TMI.REC.1398.024 مـی‌باشـد. بودجه این مطالعه توسط مؤسسه آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون تأمین گردیده و تهیه فرآورده توسط بخش نوآوری سازمان و همه مراحـل عملـی پـروژه در مرکـز تحقیقـات سـازمان انتقال خون انجام شده است.
متن کامل: (934 مشاهده)
تغییرات میزان میتوکندریالDNA طی نگهداری در فرآورده‌های گلبول قرمز
متراکم و گلبول قرمز کم لکوسیت
پویا علوی1، آزیتا چگینی2، شهرام سمیعی3، مستانه علایی4
چکیده
سابقه و هدف
وجود میتوکندریالDNA در فرآورده‌های خونی می‌تواند باعث تغییرات فیزیولوژیک سلول‌ها و در نهایت بروز عوارض در بیماران گردد. هدف از این مطالعه، ارزیابی تأثیر مدت زمان ذخیره‌سازی بر روی تعداد نسخه میتوکندریالDNA آزاد در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم و گلبول‌های قرمز کم لکوسیت بود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه توصیفی مقطعی، تعداد 15 واحد گلبول قرمز متراکم تهیه شده از خون کامل و 15 عدد گلبول قرمز کم لکوسیت وارد مطالعه شدند. پس از ارزیابی پارامترهای هماتولوژیک در هر کیسه با استفاده از روش RT-PCR تعداد نسخه میتوکندریالDNA آزاد، در فرآورده‌های خون در روزهای 0 ، 5 و 35 انجام گردید. پس از جمع‌آوری داده‌ها، آزمایش شاپیرو و من‌ویتنی انجام و تجزیه و تحلیل با نرم‌افزار 2009 REST صورت گرفت.
یافته‌ها
میانگین هموگلوبین در کیسههای خون gr/dL 3/4 ± 6/17 بود. میانگین پلاکت در کیسههای گلبول قرمز نیز 60/50 ± 02/132 هزار در میلی‌متر مکعب خون، هم‌چنین میانگین شمارش گلبول‌های قرمز نیز 14/0 ± 07/6 میلیون در هر میکرولیتر خون و میانگین شمارش گلبول‌های سفید در کیسه خون نیز 3/2 ± 98/4 در میکرولیتر بود. تعداد نسخه میتوکندریالDNA آزاد در فرآورده گلبول قرمز متراکم در مقایسه با فرآورده گلبول قرمز کم لکوسیت در روزهای 5 و 35 بیشتر بود.
نتیجه گیری
تعداد نسخه میتوکندریالDNA آزاد در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم بیشتر از گلبول قرمز کم لکوسیت بود و ارتباط مستقیمی بین میزان WBC و تعداد نسخه میتوکندریالDNA آزاد وجود دارد.
کلمات کلیدی: گلبول‌های قرمز، میتوکندریال، ژن‌ها
تاریخ دریافت: 15/12/1400
تاریخ پذیرش : 01/03/1402
1- دانشجوی کارشناسی ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
1- مؤلف مسئول: متخصص بیهوشی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157
متراکم و گلبول قرمز کم لکوسیت
پویا علوی1، آزیتا چگینی2، شهرام سمیعی3، مستانه علایی4
چکیده
سابقه و هدف
وجود میتوکندریالDNA در فرآورده‌های خونی می‌تواند باعث تغییرات فیزیولوژیک سلول‌ها و در نهایت بروز عوارض در بیماران گردد. هدف از این مطالعه، ارزیابی تأثیر مدت زمان ذخیره‌سازی بر روی تعداد نسخه میتوکندریالDNA آزاد در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم و گلبول‌های قرمز کم لکوسیت بود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه توصیفی مقطعی، تعداد 15 واحد گلبول قرمز متراکم تهیه شده از خون کامل و 15 عدد گلبول قرمز کم لکوسیت وارد مطالعه شدند. پس از ارزیابی پارامترهای هماتولوژیک در هر کیسه با استفاده از روش RT-PCR تعداد نسخه میتوکندریالDNA آزاد، در فرآورده‌های خون در روزهای 0 ، 5 و 35 انجام گردید. پس از جمع‌آوری داده‌ها، آزمایش شاپیرو و من‌ویتنی انجام و تجزیه و تحلیل با نرم‌افزار 2009 REST صورت گرفت.
یافته‌ها
میانگین هموگلوبین در کیسههای خون gr/dL 3/4 ± 6/17 بود. میانگین پلاکت در کیسههای گلبول قرمز نیز 60/50 ± 02/132 هزار در میلی‌متر مکعب خون، هم‌چنین میانگین شمارش گلبول‌های قرمز نیز 14/0 ± 07/6 میلیون در هر میکرولیتر خون و میانگین شمارش گلبول‌های سفید در کیسه خون نیز 3/2 ± 98/4 در میکرولیتر بود. تعداد نسخه میتوکندریالDNA آزاد در فرآورده گلبول قرمز متراکم در مقایسه با فرآورده گلبول قرمز کم لکوسیت در روزهای 5 و 35 بیشتر بود.
نتیجه گیری
تعداد نسخه میتوکندریالDNA آزاد در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم بیشتر از گلبول قرمز کم لکوسیت بود و ارتباط مستقیمی بین میزان WBC و تعداد نسخه میتوکندریالDNA آزاد وجود دارد.
کلمات کلیدی: گلبول‌های قرمز، میتوکندریال، ژن‌ها
تاریخ دریافت: 15/12/1400
تاریخ پذیرش : 01/03/1402
1- دانشجوی کارشناسی ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
1- مؤلف مسئول: متخصص بیهوشی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157
-14665
3- کارشناس ارشد بیوشیمی ـ مربی مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4- متخصص آسیب‌شناسی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4- متخصص آسیب‌شناسی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه
11 درصد بیماران بستری شده در بیمارستان(تقریباً یک نفر از هر 10 نفر) به تزریق خون نیاز دارند(1). بنابراین تهیه خون کافی و سالم ارتباط مستقیمی با سلامت عمومی جامعه دارد. اما علی‌رغم این نقش حیاتی، انتقال خون به عنوان یک شمشیر دو لبه عمل می‌کند و ممکن است عوارضی اعم از ایمونولوژیک و غیر ایمونولوژیک داشته باشد. واکنش‌های ایمونولوژیک شامل آسیب حاد ریوی مرتبط با انتقال خون(TRALI)، واکنش‌های همولیتیک، واکنش‌های آلرژیک، واکنش‌های تب‌زا، بیماری پیوند علیه میزبان ناشی از انتقال خون، پورپورای ناشی از انتقال خون و ایمونومودولاسیون(immunomodulation) هستند. واکنش غیر ایمونولوژیک شامل انتقال عوامل عفونی، گرانباری گردش خون، همولیز فیزیکی و شیمیایی و کاهش فشار خون می‌باشند(2). TRALI یک واکنش خطرناک ناشی از انتقال خون است که به صورت حاد رخ داده و با ادم ریوی به دنبال تزریق فرآرده‌های خونی همراه است(3). علی‌رغم مطالعه‌های زیاد، هنوز پاتوفیزیولوژی TRALI به صورت کامل شناسایی نشده و به همین دلیل درمان آن عموماً به صورت غیر اختصاصی و حمایتی است. برای مدت طولانی، علت بروز TRALI، وجود لکوآگلوتینین (آنتی‌بادی‌ها) فرد اهداکننده علیه آنتی‌ژن‌های HLA و HNA فرد گیرنده در نظر گرفته می‌شد. ولی این فرضیه مورد شک قرار گرفت، زیرا تنها درصد کمی از پلاسمای اهداکنندگان دارای آنتی‌بادی‌های ضد HNAو HLA هستند(4). به تدریج ایده دیگری در خصوص وجود واسطه‌های بیوشیمیایی و التهابی مثل میکروپارتیکل‌ها و الگوهای مولکولی مرتبط با آسیب(DAMP : Damage Associated molecular pattern) به عنوان تحریک واکنش TRALI در نظر گرفته شد(5).
فرآورده‌های کنسانتره گلبول قرمز به عنوان پر کاربردترین فرآورده‌های خونی در درمان بسیاری از اختلالات خونی و غیر خونی استفاده می‌شود. امروزه مدت زمان نگهداری کنسانتره گلبول قرمز، بسته به مواد افزوده شده به کیسه فرآورده بین 35 تا 42 روز است. آسیب‌های گلبـول قـرمز حیـن نگهـداری کـه بـه نــام آسیـب دوران
ذخیره‌سازی شناخته می‌شوند، برای مدت‌های طولانی مورد مطالعه قرار گرفته‌اند و با این حال اهمیت بالینی این آسیب‌ها هنوز به صورت کامل شناسایی نشده است. آسیب دوران ذخیره‌سازی باعث کاهش عملکرد گلبول‌های قرمز می‌شوند که از جمله می‌توان به کاهش انعطاف‌پذیری، کاهش قابل توجه ATP و در نتیجه کاهش توانایی گلبول‌های قرمز برای اکسیژن‌رسانی اشاره کرد. هم‌چنین استرس اکسیداتیو یکی از شایع‌ترین آسیب‌های دوران ذخیره‌سازی است که با افزایش عوارض ناشی از انتقال خون پس از تزریق گلبول قرمز همراه است(6). DAMP ها که به عنوان آلارمین‌ها نیز شناخته می‌شوند، گروهی از بیومولکول‌های وابسته به میزبان هستند که در شرایط خاص مثل تروما، آسیب بافتی و استرس سلولی رها می‌شوند و به عنوان سیگنال‌های خطر اندوژن عمل کرده و باعث القای پاسخ التهابی از طریق فعال کردن سیستم ایمنی طی التهاب غیر عفونی می‌شوند(8، 7). از جمله مهم‌ترین انواع DAMP ها می‌توان به DNA (اعم از DNA ژنومی و DNA میتوکندریایی) متابولیت‌های پورینی و پروتئین گروه با تحرک بالا(HMGB ؛ High-mobility group protein) اشاره کرد. بر اساس مطالعه‌ها نشان داده شده که DNAs به همراه HMGB1 ها می‌توانند در بسیاری از واکنش‌های بیولوژیکی دخیل باشند و این فاکتورها می‌توانند بر روی واکنش‌های التهابی و هم‌چنین تحریک سیستم ایمنی اثرگذار بوده و به واسطه فعال کردن مسیرهای سیگنالینگ NF-kB باعث تولید واسطه‌های التهابی گردند.
میتوکندری‌ها به عنوان کارخانه انرژی سلول شناخته می‌شوند، اندامک‌های منحصر به فردی هستند که دارای DNA اختصاصی(mtDNA) می‌باشند. mtDNA انسانی به صورت DNA دو رشته‌ای حلقوی بوده و دارای 16529 جفت باز است و rRNA وtRNA میتوکندریایی و نیز 13 واحد از پروتئین‌های زنجیره تنفسی را کد می‌کند(9). طی استرس‌های سلولی و میتوکندریایی، قطعاتی از mtDNA جدا شده و وارد گردش خون می‌شود که به عنوان mtDNA DAMPs خوانده می‌شوند.mtDNA DAMPs با اتصال به TLR-9 (Toll Like Receptor-9) منجر به فعال شدن فرآیند التهابی می‌شود (10). مطالعه‌های مختلف نشان داده‌اند که سطح mtDNA DAMPs در پلاسمای بیماران مبتلا به سندروم پاسخ التهابی سیستمی ناشی از تروما افزایش می‌یابد و با افزایش میزان مرگ و میر همراه است(12، 11). هم‌چنین سطح mtDNA DAMPs در بیماران مبتلا به سپسیس و سندروم دیسترس تنفسی حاد(ARDS) افزایش می‌یابد و با افزایش مرگ و میر همراه است(13).
مطالعه‌های آزمایشگاهی در سطح کشت سلولی و حیوانات آزمایشگاهی نشان داده‌اند که mtDNA DAMPs منجر به آسیب سلول‌های اندوتلیال و ادم ریوی می‌شوند(14، 12). طی فرآیند تهیه فرآورده‌های RBC، پلاکت‌ها و گلبول‌های سفید به مقادیر مختلف در فرآورده باقی می‌مانند و می‌توانند به عنوان منبعی برای رهاسازیmtDNA DAMPs عمل کنند. با توجه به موارد ذکر شده، وجود mtDNA DAMPs در فرآورده خونی می‌تواند به عنوان یکی از مارکرهای کیفیت فرآورده و عوامل تحریک‌کننده آسیب سلول‌های اندوتلیال و بروز واکنش TRALI عمل کند. با توجه به این که هنوز مطالعه‌ای در زمینه ارزیابی میزان mtDNA DAMPs و مقایسه آن در فرآورده‌های گلبول قرمز تهیه شده به روش‌های مختلف در ایران انجام نشده، هدف از این پژوهش، ارزیابی سطح mtDNA DAMPs در فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت در مقایسه با گلبول قرمز متراکم (بدون کاهش لکوسیت) طی زمان نگهداری در روزهای 0، 5 و 35 بود.
مواد و روش‌ها
این مطالعه از نوع توصیفی مقطعی بود. در این مطالعه واحدهای گلبول قرمز فرآوری شده با روش سانتریفوژ از خون کامل(شامل PRBCs وکم لکوسیت) اهداکنندگان مراجعه‌کننده به مرکز نوآوری‌های سازمان انتقال خون ایران تهیه گردید. بر روی تعداد ۱۵ واحد گلبول قرمز متراکم تهیه شده از خون کامل و ۱۵ عدد گلبول قرمز کم لکوسیت از اهداکنندگان داوطلب با کسب رضایتنامه آگاهانه جهت استفاده محصول در کار تحقیقاتی بررسی انجام شد(15). خونگیری با رعایت اصول صحیح و به صورت استریل از اهداکنندگان مستمر انجام گرفت. معیار ورود به مطالعه اهداکنندگان جنس مرد، سن 35 تا 50 سال و با هموگلوبین 13 تا 16 بودند تا کیسههای گلبول قرمز دارای شرایط یکسانی باشند و انتخابی از نظر گروه خونی صورت نگرفت.
سپس تمامی کیسههای قابل نگهداری تا 35 روز(حاوی ماده ضد انعقاد CPDA1)، در شرایط استاندارد در یخچال ویژه بانک خون با دمای 6-2 درجه سانتی‌گراد نگهداری و مرتباً زنجیره سرمای آن کنترل و در چارت مخصوص ثبت گردید. شـماره و برچسـبی خـاص بـر روی کیسههای مختلف گلبول قرمز تهیـه و چسـبانیده شـدند. در واقع به هـر کیسـه، کـد شناسـه مخصوص این مطالعه اختصاص داده شـد. هـم چنین تاریخ تهیه و تحویل فـرآورده در چـک لیسـت‌هـای مخصوص ثبت گردید. نمونـه‌گیـری از تمامی کیسه‌ها با شرایط استریل، به روشی همانند و در سیستم بسته صورت گرفت و در دمای 2 تا 4 درجه به آزمایشگاه منتقل شد و توسط سل کانتر کالیبره از نظر شمارش گلبول سفید، پلاکت و گلبول قرمز مورد ارزیابی قرار گرفت. برای مقایسه بین خون تازه(تا 5 روز) و آخرین روزی که امکان استفاده گلبول قرمز متراکم هست، در روزهای 5 و 35 نمونه‌برداری از کیسه‌ها انجام گرفت. نمونههای گرفته شده به مدت 20 دقیقه در دور g 2500 و در دمای 4-2 درجه سانتریفوژ شده و سوپرناتانت در کرایو ویال ریخته شده و در دمای منفی 80 درجه سانتی‌گراد فریز شدند.
در ابتدا mtDNA برای کنترل مثبت واکنش Real-time PCR و رسم منحنی استاندارد تهیه گردید. استخراج mtDNA با استفاده از کیت qiamp blood DNA mini kit (کیاژن ـ آلمان) صورت گرفت.
آغازگرها(پرایمرها) به صورت لیوفیلیزه و هر کدام از آن‌ها با استفاده از محلولTAE (Tris-acetate-EDTA) به غلظت μM 100 رسانیده شد و 2 تا 3 دقیقه ورتکس فیوژ گردید و محلول استوک به دست آمد. برای هر چند بار استفاده آغازگرهای استوک با استفاده از آب مقطر استریل، اتوکلاو شده به غلظت µM 10 رسانده شدند. سپس برای NADH) ND6 دهیدروژناز زیر واحد 6) کـــه اختصاصـی
mtDNA میباشد، طبق جداول 2، 3، RT PCR با سایبرگرین انجام شد و منحنیهای تکثیر و منحنیهای ذوب این آغازگر تجزیه و تحلیل گردیدند(شکل1)(جداول 2 و 3).
جهت انجام Real time PCR برای ژن هدف ND6و رفرانس ژن B2M (Beta-2-Microglobulin) انتخاب شده طبق دستورالعمل کیت Jena (بیوساینس) مسترمیکس، آغازگر و آب مقطر بر روی یخ به میکروتیوب اضافه شد. قابل ذکر است که پیش از استفاده از مسترمیکس و آغازگرها و پس از اضافه شدن هر کدام از اجزای واکنـش،
میکروتیوب ورتکس فیوژ میگردید.
برای تهیه منحنی استاندارد برای ژنهای ND6 و B2M و تعیین کارآیی آغازگرها پس از تهیه رقتهای سریالی برای محصولات ژنهایB2M و ND6 ، برای هر رقت،Real-time PCR به صورت داپلیکیت انجام گردید و برای هر ران کاری کنترل منفی(NTC) نیز گذاشته شد. سپس منحنی استاندارد توسط نرم‌ا فزار Rotor-gene به صورت خودکار رسم گردید و میزان کارآیی هر آغازگر محاسبه شد. برای نمونههای DNA استخراج شده در روزهای 0، 5 و 35 کیسههای مورد و کنترل طبق دستورالعملهای ذکر شده برای ژن هدف و رفرانس ژن،Real-time PCR به صورت داپلیکت انجام شد. پس از تکثیر mtDNA و ژن کنترل داخلی و تجزیه و تحلیل اختصاصیت توسط منحنی ذوب و بررسی عدم وجود آلودگی با توجه به منحنی تکثیر NTC ، طبق منحنی استاندارد و فرمول، تعداد کپیهای mtDNA به صورت کمی مطلق محاسبه گردید.
یافته‌ها
نتایج نشان داد که میانگین هموگلوبین در کیسههای خون مورد بررسی 3/4 ± 6/17 گرم در دسی‌لیتر بود. میانگین پلاکت در آن‌ها نیز 60/50 ± 02/132 هزار در میلی‌متر مکعب خون و هم چنین میانگین شمارش گلبول‌های قرمز نیز 14/0 ± 07/6 میلیون در هر میکرولیتر خون و در نهایت میانگین شمارش گلبول‌های سفید در تمامی کیسههای خون مورد بررسی نیز 3/2 ± 98/4 به ازای هر میکرولیتر از خون به دست آمد. بـررسی ارتبـاط میـزان سطـح mtDNA در گروه‌هــای گلبول قرمز متراکم و گلبول قرمز کم لکوسیت و در روزهای صفر، 5 و 35 و مقایسه میانگین تعداد نسخه DNA میتوکندریال آزاد (کپی نامبر mtDNA) در دو گروه گلبول قرمز متراکم و گلبول قرمز کم لکوسیت انجام شد. نتایج نشان داد که میانگین کپی نامبر mtDNA در روز صفر در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم 83/0 ± 227/2 بود در حالی که در فرآورده گلبول‌های قرمز کاهش لکوسیت یافته 23/1 ± 552/2 مشاهده گردید. میزان تغییرات ND6 در روز پنجم در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم 73/0 ± 687/1 بود در حالی که در فرآورده گلبول‌های قرمز کاهش لکوسیت یافته 38/1 ± 049/2 بود. هم چنین میزان تغییرات ND6 در روز 35 در فرآورده‌های گلبول‌های قرمز متراکم 62/0 ± 566/1 بود در حالــی کــه در فـرآورده گلبول‌هـای قرمـز
|
NA
|
کم لکوسیت یافته 0036/0 ± 09675/0 بود. در نهایت تجزیه و تحلیل داده‌ها نشان داد که ارتباط معناداری بین میزان تغییرات ND6 در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم در روزهای صفر، پنج و 35 از زمان ذخیره‌سازی وجود نداشت این در حالی بود که ارتباط معناداری بین میزان تغییرات ND6 در فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت یافته مشاهده گردید(0001/0 p<)(شکل 2). نتایج نشان داد که میزان تغییرات ND6 با میزان Hb در هر دو فرآورده گلبول قرمز و گلبول‌های قرمز کم لکوسیت ارتباط داشت به طوری که هر چه میزان Hb بیشتر بود، میزان تغییرات ND6 نیز افزایش پیدا کرده بود. با این حال ارتباط معناداری بین آن‌ها از نظر آماری وجود نداشت (شکل3).
هم چنین میزان تغییرات ND6 با میزان پلاکت در هر دو فرآورده گلبول قرمز متراکم و گلبول‌های قرمز کم لکوسیت یافته ارتباط داشت به طوری که هر چه میزان پلاکت بیشتر بود میزان تغییرات ND6 نیز افزایش پیدا کرده بود. با این حال ارتباط معناداری بین آن‌ها از نظر آماری وجود نداشت (شکل4). ارتباط مستقیمی بین میزان تغییرات ND6 و تعداد
هم چنین میزان تغییرات ND6 با میزان پلاکت در هر دو فرآورده گلبول قرمز متراکم و گلبول‌های قرمز کم لکوسیت یافته ارتباط داشت به طوری که هر چه میزان پلاکت بیشتر بود میزان تغییرات ND6 نیز افزایش پیدا کرده بود. با این حال ارتباط معناداری بین آن‌ها از نظر آماری وجود نداشت (شکل4). ارتباط مستقیمی بین میزان تغییرات ND6 و تعداد
بحث
فرآورده‌های خونی یکی از فاکتورهای اصلی در درمان بسیاری از بیماری‌ها از جمله بیماری سیکل سل، تالاسمی و بسیاری از بیماری‌های دیگر میباشد. استفاده از فرآورده‌های خون برای درمان بیماران نتایج قابل قبولی داشته و در بسیاری از شرایط باعث بهبود وضعیت بالینی آن‌ها می‌گردد(16). این در حالی است که استفاده از این فرآورده‌ها در شرایطی می‌تواند دارای یک سری عوارض خاص برای بیماران باشد. بر اساس مطالعه‌ها نشان داده شده که عدم سازگاری فرآورده‌های خونی بین دهنده و گیرندگان می‌تواند باعث بروز واکنش‌های ناشی از تزریق خون در گیرندگان خون گردد(17). علاوه بر بروز واکنش‌های ناشی از تزریق خون، ذخیره‌سازی فرآورده‌های خون نیز می‌تواند در بروز واکنش‌های ناشی از تزریق خون مؤثر باشد. بدین منظور مطالعه‌ها نشان داده‌اند که ذخیره‌سازی فرآورده‌های خون می‌تواند بر روی سلول‌های خونی و هم چنین سیستم ایمنی و سیستم فیزیولوژیکی گیرندگان خون تأثیرگذار باشد. یکی از فاکتورهایی که در طول ذخیره‌سازی در فرآورده‌های خون از جمله کیسههای گلبول قرمز متراکم و پلاکت تولید می‌گـردد، mtDNA می‌باشــد. مطالعه‌هـا نشان داده‌انـد کـه mtDNA می‌تواند به عنوان یک فاکتور مولکول‌های پاتوژن مرتبط با آسیب یا DAMP باشد و باعث تحریک سیستم ایمنی و القای واکنش‌های التهابی گردد(18). از طرفی نشان داده شده که تزریق فرآورده‌های خون حاوی mtDNA به بیماران می‌تواند بر روی سیستم ایمنی آن‌ها تاثیرگذار باشد و باعث وخیم‌تر شدن شرایط بالینی آن‌ها گردد. تاکنون مطالعه‌های بسیار کمی در ارتباط با میزان کپی نامبر mtDNA در فرآورده‌های خون گلبول قرمز متراکم انجام شده است. با این حال اطلاعات به دست آمده دارای نتایج ضد و نقیضی میباشد و نتیجه‌گیری کلی در ارتباط با میزان کپی نامبر mtDNA در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم(packed cell) ارایه نکرده‌اند. ما در این مطالعه به ارزیابی میزان کپی نامبر mtDNA در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم و گلبول‌های قرمز کم لکوسیت و ارتباط آن با مدت زمان ذخیره‌سازی فرآورده‌ها پرداختیم.
بر روی تعداد ۱۵ واحد گلبول قرمز متراکم تهیه شده از خون کامل و ۱۵ عدد گلبول قرمز کم لکوسیت از اهداکنندگان تحقیق انجام گردید. هدف از مطالعه، ارزیابی میزان mtDNA در این فرآورده‌های خون در روزهای صفر، پنج و 35 روز پس از ذخیره‌سازی آن‌ها بود. قبل از اندازه‌گیری کپی نامبر mtDNA ، برخی از اندکس‌های شمارش کامل گلبول‌های قرمز در کیسههای خون مورد ارزیابی قرار گرفت که به شرح زیر میباشد. بر این اساس نتایج نشان داد که میانگین هموگلوبین در کیسههای خون 3/4 ± 6/17 گرم در دسی‌لیتر و میانگین پلاکت نیز 60/50 ± 02/132 هزار در میلی‌متر مکعب خون بود. هم‌چنین میانگین شمارش گلبول‌های قرمز نیز 14/0 ± 07/6 میلیون در هر میکرولیتر خون بود. و در نهایت میانگین شمارش گلبول‌های سفید در کیسه خون نیز 3/2 ± 98/4 به ازای هر میکرولیتر از خون بود. میزان کپی نامبر mtDNA در فرآورده گلبول قرمز متراکم در مقایسه با فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت در روزهای 5 و 35 روز از ذخیره‌سازی فرآورده‌ها بیشتر بود که این اختلاف بین آن‌ها از نظر آماری هم معنادار بود(05/0p< ).
مطالعه‌ای توسط لی و همکاران انجام گرفت. در این مطالعه هدف بررسی میزان mtDNA در فرآورده‌های گلبول قرمز، پلاکت و پلاسمای تازه منجمد بود. mtDNA که در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفته بود شامل COX1 ، ND1 و ND6 بود. نشان داده شد که میزان mtDNA در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم، فرآورده‌های پلاسمایی و گلبول‌های قرمز کم لکوسیت افزایش یافته بود در حالی که بیشترین میزان mtDNA در فرآورده‌های پلاسمایی وجود داشت. پس از بررسی‌های بیشتر نشان داده شد که افزایش میزان mtDNA در فرآورده‌های خون می‌تواند همراه با بروز عوارض آسیب ریوی مرتبط با تزریق خون در بیماران باشد. در نهایت آن‌ها نتیجه‌گیری کردند که افزایش میزان mtDNA در فرآورده‌های خون همراه با بروز آسیب‌های ریوی حاد مرتبط با تزریق خون در بیماران است(19).
سیمونس و همکاران مطالعه‌ای به منظور ارزیابی میزان DAMP (mtDNA) در فرآورده‌های خون شامل گلبول‌های قرمز، پلاسمای تازه منجمد و فرآورده‌های پلاکتی انجام دادند. پس از ارزیابی‌ها نتایج نشان داد که میزان mtDNA در فرآوده‌های پلاکتی و پلاسمایی در مقایسه با سایر فرآورده‌ها بیشتر بود. هم چنین آن‌ها نشان دادند که افزایش میزان mtDNA در طول دوران نگهداری در فرآورده‌های خون همراه با افزایش میزان بروز سندروم زجر تنفسی در بیماران بود. از این رو این طور نتیجه‌گیری کردند که افزایش میزان mtDNA در فرآورده‌های خون در طول ذخیره‌سازی می‌تواند همراه با خطر بروز عوارض در بیماران باشد که نیازمند اتخاذ استراتژی‌های مناسب در طول درمان بیماران با استفاده از فرآورده‌های خون میباشد(20). مطالعه‌ای که توسط شی و همکاران به منظور مقایسه میزان mtDNA در گلبول‌های قرمز کامل فیلتر شده و فرآورده گلبول‌های قرمز متراکم فیلتر شده انجام گرفت، نشان داده شد که میزان mtDNA در فرآورده‌های خون تازه در مقایسه با فرآورده‌های خون ذخیره شده بیشتر بود. علاوه بر این مشخص گردید که میزان mtDNA در فرآورده‌های خون کامل در مقایسه با فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم بیشتر بود که این اختلاف‌ها از نظر آماری معنادار بود. به عبارت دیگر در مطالعه شی تاثیر روش‌های آماده کردن فرآورده‌های خون بر روی میزان mtDNA نیز بررسی شد. نتایج نشان داد که میزان mtDNA در فرآورده‌هایی که خون کامل قبل از تهیه فرآورده با استفاده از فیلتر به دست آمده بود در مقایسه با گلبول‌های قرمز متراکم که با استفاده از فیلتراسیون تهیه گردیده بودند بیشتر بود(21). این مطالعه همسو با تحقیق ما بود.
مطالعه دیگری توسط باکور و همکاران به منظور ارزیابی میزان وزیکول‌های خارج سلولی و mtDNA در فرآورده‌های خون انجام گرفت. در این مطالعه از فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم، خون کامل، فرآورده‌های آفرزیس شده و فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت استفاده گردید. نتایج نشان داد که میزان mtDNA در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم و فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت با افزایش میزان مدت زمان ذخیره‌سازی افزایش یافته بود. بر این اساس مشخص شد میزان mtDNA در فرآورده‌هایی که به مدت 42 روز ذخیره‌سازی شده بودند در مقایسه با فرآورده‌هایی که 5 روز از زمان نگهداری آن‌ها گذشته بود، بیشتر بود که این اختلاف از نظر آماری معنادار بود(05/0 p<)(15). علاوه بر این با افزایش میزان mtDNA در فرآورده‌ها، وزیکول‌های خارج سلولی نیز در فرآورده‌های خون با افزایش مدت زمان ذخیره‌سازی در فرآورده‌های خون افزایش یافته بود. نتایج این مطالعه با نتایج مطالعه حاضر همسو بود. یاسوئی و همکاران مطالعه‌ای به منظور ارزیابی میزان mtDNA در فرآورده‌های خون از جمله گلبول‌های قرمز متراکم، پلاکت‌ها، پلاسمای تازه منجمد و گلبول‌های قرمز کم لکوسیت انجام دادند. پس از ارزیابی و تجزیه و تحلیل داده‌ها نتایج نشان داد که میزان mtDNA در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم در مقایسه با سایر فرآورده‌ها بیشتر بود. هم چنین نشان داده شد که افزایش میزان mtDNA در فرآورده‌ها همراه با افزایش خطر بروز واکنش‌های غیرهمولیتیک مرتبط با تزریق خون در گیرندگان بود به طوری که هر چه میزان mtDNA در فرآورده‌ها بیشتر به دست آمد، خطر بروز عوارض در گیرندگان نیز افزایش یافت(22).
در مطالعه حاضر نتایج نشان داد که ارتباط مستقیمی بین میزان WBC و کپی نامبر mtDNA در فرآورده‌های پکدسل و فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت وجود داشت. هر چه میزان WBC در فرآورده‌های خون بیشتر بود میزان کپی نامبر mtDNA نیز افزایش یافته بود. مطالعه‌ای توسط تیکسترا و همکاران به منظور ارزیابی ارتباط میزان گلبول‌های سفید با میزان mtDNA در فرآورده‌های پلاکتی تهیه شده با روش‌های پلاسمای غنی از پلاکت و روش بافی‌کوت انجام شد. نتایج نشان داد که میزان mtDNA در فرآورده‌های کم لکوسیت در مقایسه با فرآورده‌های دیگر کمتر بود و میزان گلبول‌های سفید و قطعات آن در فرآورده‌های تهیه شده با روش بافی‌کوت در مقایسه با روش‌های دیگر همانند روش پلاسمای غنی از پلاکت بیشتر بود(23). مطالعه دیگری توسط فوچز و همکاران بر روی کیسههای خون که از سگ‌ها جمع‌آوری شده بود، انجام گرفت. آن‌ها نشان دادند نشانگرهای NET در طول ذخیره‌سازی RBC افزایش یافـت و در کیسه‌هـای غیـر کم
لکوسیت بیشتر از واحدهای کم لکوسیت بود(24).
در مطالعه حاضر نتایج نشان داد که در فرآورده‌های گلبول قرمز متراکم، تعداد نسخه میتوکندریال آزاد(Mitochondrial copy number) DNA با میزان پلاکت‌ها در فرآورده رابطه مستقیمی داشت، این در حالی بود که مشخص گردید میزان کپی نامبر mtDNA با میزان پلاکت‌ها در فرآورده‌های گلبول قرمز کم لکوسیت ارتباط داشت. به عبارت دیگر نشان داده شد که هر چه میزان پلاکت در فرآورده‌ها بیشتر باشد، میزان کپی نامبر mtDNA در فرآورده‌ها نیز افزایش می‌یابد. در مطالعه‌ای که توسط کوگناس و همکاران انجام گرفت، نشان داده شد که افزایش میزان پلاکت در فرآورده‌ها همراه با افزایش میزان mtDNA بود. از طرف دیگر نشان داده شد که با افزایش مدت زمان ذخیره‌سازی فرآورده‌های پلاکتی، میزان mtDNA در آن‌ها افزایش می‌یابد(25).
نتیجه‌گیری
تعداد نسخه mtDNA آزاد در فرآورده‌های گلبول قرمز
متراکم بیشتر از کم لکوسیت بود و ارتباط مستقیمی بین میزان WBC و تعداد نسخه mtDNA آزاد مشاهده گردید. هر چه میزان پلاکت بیشتر بود، میزان تغییرات mtDNA نیز افزایش پیدا کرده بود(0001/0 p<).
تشکر و قدردانی
این مقاله حاصل پایان نامه دانشـجویی دوره کارشناسـی ارشـد رشتـه خونشناسـی مـــرکز تحقیقات مؤسسه عالـی آموزشـــی و پژوهشـــی طـــب انتقـــال خـــون بـــا کـــد اخلاق IR.TMI.REC.1398.024 مـی‌باشـد. بودجه این مطالعه توسط مؤسسه آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون تأمین گردیده و تهیه فرآورده توسط بخش نوآوری سازمان و همه مراحـل عملـی پـروژه در مرکـز تحقیقـات سـازمان انتقال خون انجام شده است.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
