نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله: ژنتيك انتشار: 1401/10/10
متن کامل: (257 مشاهده)
نقش پلی‌مورفیسم‌های rs8101606 ، rs10421768 و rs66868858 ژن هپسیدین در سرباری آهن بیماران مبتلا به تالاسمی ماژور مراجعه‌کننده به درمانگاه ظفر تهران معصومه یزدی1، آزیتا آذرکیوان2، فهیمه رنجبر کرمانی3، مجید شهابی4 چکیده سابقه و هدف بیماران تالاسمی ماژور، دچار آنمی شدید بوده و برای بقا وابسته به تزریق خون منظم می‌باشند اما تزریق خون باعث ایجاد مشکلاتی از قبیل سرباری آهن در این بیماران می‌شود. هپسیدین پلی‌پپتیدی است که تنظیم‌کننده اصلی هومئوستاز آهن می‌باشد. اخیراً پلی‌مورفیسم‌هایی در ژن کدکننده هپسیدین شناسایی شده است که در سرباری آهن در بافت‌ها دخیل هستند. هدف از مطالعه، بررسی ارتباط واریانت های rs10421768 ، rs8101606 و rs66868858 در ژن هپسیدین و سرباری آهن در بیماران بتاتالاسمی ماژور بود. مواد و روش‌ها در این پژوهش مقطعی، ۱۰۰ نمونه خون بیماران تالاسمی ماژور مربوط به درمانگاه تالاسمی ظفر در سال 1400 جمع‌آوری شد. پس از استخراج DNA ژنومی، ژنوتیپ پلیمورفیسمها با روش High resolution melt curve analysis تعیین شد. نتایج ژنوتیپ با تعیین توالی تعدادی از نمونه‌ها معتبرسازی شد. برای ارتباط بین ژنوتیپ‌های مختلف و شاخص‌های سرباری آهن از آزمون کای‌دو استفاده شد. مقدار 05/0 p< نشان‌دهنده ارتباط معنادار در نظر گرفته شد. یافته‌ها برمبنای مقدار فریتین سرم ng/mL 1000≥ ، تعداد 72 نفر(72%) از بیماران دارای سرباری آهن بودند. به علاوه مطابق معیارهای فدراسیون بینالمللی تالاسمی، تعداد 33 نفر(33%) از بیماران مبتلا به سرباری آهن قلبی و 63 نفر(63%) دچار سرباری آهن کبدی بودند. هیچ ارتباط معناداری بین ژنوتیپ‌های مختلف و میزان فریتین، آهن قلب و آهن کبد یافت نشد. نتیجه گیری هر چند در این مطالعه ارتباطی بین هر کدام از پلی‌مورفیسم‌های مورد بررسی و سرباری آهن یافت نشد، ممکن است این پلیمورفیسمها به صورت یک هاپلوتیپ واحد در سرباری آهن دخالت داشته باشند که نیازمند مطالعه‌های بیشتر است. کلمات کلیدی:تالاسمی بتا، هپسیدین، سرباری آهن، پلی‌مورفیسم تاریخ دریافت: 07/10/1400 تاریخ پذیرش: 28/04/1401
1- دانشجوی کارشناسی ارشد زیست فناوری پزشکی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- فوق تخصص خون و هماتولوژی کودکان ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 3- PhD طب انتقال خون ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 4- مؤلف مسئول: PhD فرآورده‌های بیولوژیک ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه بتاتالاسمی یکی از رایجترین بیماریهای اتوزومال مغلوب در جهان است. ایران با میانگین شیوع 4%، بالاتر از میانگین جهانی(1%) قرار دارد(1). شدت تالاسمی بستگی به تعداد ژن‌های حذف یا غیرفعال شده دارد که دارای انواع مینور، اینترمدیا و ماژور می‌باشد. نوع ماژور این بیماری به صورت آنمی شدید وابسته به تزریق خون است(2، 1). شخص دارای تالاسمی ماژور معمولاً برای زنده‌ماندن نیازمند تزریق خون منظم می‌باشد و در معرض خطرات ناشی از تزریقات مکرر خون مانند سرباری آهن قرار میگیرد. آهن اضافی به صورت آزاد در پلاسما یا به صورت رسوب در کبد سمی می‌باشد و دارای اثر سوء بر دیگر ارگانهای بدن مانند قلب و کلیه است(3). تجویز داروهای شلاته‌کننده آهن تا حدی به کاهش سرباری آهن کمک می‌کند اما دارای عوارض جانبی مخصوص به خود نیز می‌باشند(4). هموستاز آهن توسط عوامل مختلفی کنترل می‌شود. هپسیدین یک هورمون پلی‌پپتیدی است و توسط ژن HAMP که برروی کروموزوم ۱۹ قرار دارد کد شده و در کبد ساخته می‌شود. هپسیدین تنظیم‌کننده اصلی هومئوستاز آهن می‌باشد(5، 4). میزان هپسیدین در بیماران تالاسمی ماژور بسیار پایین است زیرا ساخت این هورمون سرکوب شده که در نهایت باعث تجمع آهن می‌شود(7-5). هپسیدین از سه طریق آهن خون را تنظیم می‌کند: ۱) ممانعت جذب آهن از روده ۲) توقف آزاد شدن آهن از ماکروفاژها ۳) کنترل آهن ذخیره شده در هپاتوسیت‌ها (8). مطالعه‌های زیادی نشان داده است که بیان هپسیدین متاثر از وجود پلی‌مورفیسم‌هایی بر روی ژن HAMP می‌باشد. پاراجز و همکارانش نشان دادند که وجود پلی‌مورفیسم c.-582A>G باعث کاهش بیان ژن هپسیدین می‌شود(9). مطالعه‌های آندریانی و همکارانش نیز تائیدکننده نقش این پلی‌مورفیسم در افزایش آهن کبدی و افزایش سطح سرمی آهن می‌باشد(10). با توجه به نقش محوری هپسیدین در هموستاز آهن ونیز تاثیر کمی و کیفی پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی در بیان ژن، هدف از این مطالعه بررسی ارتباط پلی‌مورفیسم‌های rs8101606 ، rs10421768 و rs66868858 ژن هپسیدین و سرباری آهن در بیماران تالاسمی ماژور تحت درمان منظم با شلاته‌کننده‌های آهن بود. اگر چه نتایج این تحقیق تاثیری در درمان سرباری آهن در بیماران تالاسمی نداشت ولی میتواند در شناسایی مکانیسمهای تاثیرگذار بر سرباری آهن مؤثر باشد. مواد و روش‌ها این مطالعه از نوع مقطعی غیر مداخلهای(مشاهدهای) و بر روی ۱۰۰ بیمار تالاسمی ماژور که به طور منظم برای دریافت خون به درمانگاه تالاسمی ظفر تهران مراجعه کرده بودند در سال 1400-1399 انجام شد. همگی تحت تزریق منظم خون(با فاصله ۲ تا ۴ هفته)، تحت درمان منظم با داروهای شلاته‌کننده(دسفرال، Exjad، دسفرال/L1، دسفرال/Exjade) بوده و سن بالای ۱۴ سال داشتند. براساس راهنمای فدراسیون بینالمللی تالاسمی (TIF) فریتین بالای ng/mL 1000 سرم به عنوان سرباری آهن در نظر گرفته شد. آهن قلب و کبد توسط T2*MRI اندازه‌گیری شد. طبقه‌بندی شدت سرباری آهن کبد و قلب مطابق جداول بود(جداول 1 و 2). این پژوهش توسط کمیته اخلاق مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون با کد IR.TMI.REC.1399.019 تصویب شد و از همه بیماران رضایتنامه کتبی اخذ شد. آنالیز مولکولی: 3 میلی‌لیتر از خون گرفته شده با EDTA ، با ۱۲ میلی‌لیتر از بافر لیزکننده(mM 150 EDTA ، mM 10 NaHCO3 ، mM 1 NH4CL) مخلـوط و به مدت ۱۰ دقیقه با دور ×g 3000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی دور ریخته شد و رسوب گلبول‌های سفید دو مرتبه با محلول طبیعی سالین شسته شدند. DNA ژنومی از mL ۲/۰ گلبول سفید با کیت GeneAll (تایوان) طبق دستورالعمل کیت استخراج شد. برای پلی‌مورفیسم‌های rs8101606 ، rs10421768 و rs66868858 آغازگرهای اختصاصی طراحی شد و توسط شرکت سینا کلون ساخته شد(جدول 3). برای هر پلی‌مورفیسم تعداد 10 نمونه با واکنشهای
PCR تکثیر و جهت تعیین توالی به شرکت کدون ژنتیک ارسال شد (Sanger method). تعیین ژنوتیپ نمونه‌ها با روش High resolution melt curve analysis (HRM) انجام گردید. ابتدا واکنشهای PCR در حجم نهایی µL 20 و با استفاده از µL 10 میکس HRM (Type- it HRM کیاژن)، غلظت µM 7/0 هر کدام از آغازگرها و نیز ng 20 از DNA ژنومی انجام شد. چرخه دمایی متشکل از 10 دقیقه در 96 درجه سانتی‌گراد و سپس 40 چرخه شامل 10 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد و 30 ثانیه در 60 درجه سانتی‌گراد بود. واکنشهای HRM نیز به صورت 95 درجه سانتی‌گراد 10 ثانیه، 40 درجه سانتی‌گراد 5 ثانیه و 70 درجه سانتی‌گراد 60 ثانیه بود و پس از آن دما تا 97 درجه سانتی‌گراد افزایش یافته و در هر درجه شدت فلوروسنت 25 بار قرائت شد. واکنشهای PCR و HRM با دستگاه Roche Lightcycler 96 انجام گرفت. نتایج ژنوتیپ هر نمونه از روی منحنی ذوب قرائت شد. نمونههای تعیین توالی شده به عنوان تائید نتایج HRM استفاده شدند. آنالیز آماری: نتایج حاصله برای متغیرهایی که توزیع طبیعی داشته‍اند به صورت میانگین و انحراف استاندارد(mean ± SD ) و برای متغیرهایی که توزیع طبیعی نداشته‍اند به صورت شاخص پراکندگی IQR (Interquartile Range) بیان شد. برای مقایسه متغیرهای کیفی از chi-square test استفاده شد. مقدار 05/0 p< به عنوان اختلاف معناداری درنظر گرفته شد. برای تجزیه و تحلیل آماری داده‍ها از نرمافزار SPSS (23 version) استفاده شد. یافته‌ها در مجموع 100 نفر از بیماران تالاسمی ماژور وارد مطالعه شدند. مطابق راهنمایTIF و بر اساس فریتین سرم، 72% از بیماران دارای سرباری آهن بودند. نتایج MRI آهن قلب نشان‌دهنده سرباری آهن در 33% بیماران بود که شدت سرباری عبارت بود از: ۹/۵% بیماران شدید، ۸/۹%
بیماران متوسط و ۷/۱۶% بیماران خفیف. طبق نتایج MRI کبـدی در مجموع 63% بیماران سرباری آهن داشتند که 8/7 % بیماران شدید، ۴/۳۱% بیماران متوسط و ۵/۲۲% بیماران سرباری خفیف داشتند. نتایج تعیین ژنوتیپ پلیمورفیسمها در جدول آمده است(جدول 4). هیچ‌گونه ارتباطی بین پلی‌مورفیسم‌های مورد بررسی و سرباری آهن قلب و کبد و نیز مقدار فریتین سرم مشاهده نشد. برای هر محاسبه تعداد آلل اصلی در مقابل مجموع تعداد آلل مینور به اضافه تعداد هتروزیگوت قرار داده شد. مقادیر p-value برای هر کدام از این پارامترها در جدول نمایش داده شده است(جدول 5). منحنی ذوب واکنشهای HRM در شکل نمایش داده شده است(اشکال 1 و 2).
بحث بتا تالاسمی ماژور شدیدترین فرم تالاسمی است که جهش در هردو ژن سازنده زنجیره بتا وجود دارد و میزان تولید این زنجیره‌ها در حدود صفر است. اگر چه تزریق مکرر خون در سال‌های اول زندگی موجب رشد طبیعی فرد خواهد شد اما اضافه بار آهن عارضه‌ای است که در صورت عـدم استفـاده از درمانهـای شلاتـه‌کننده، موجب اختلالات جدی در سال‌های بعد خواهد شد(4، 3). هپسیدین پروتئینی است که در تنظیم هوموستاز آهن بدن نقش مهمی را ایفا می‌کند. به طور کلی، این هورمون با کاهش جذب آهن از انتروسیتهای دئودنوم و هم‌چنین ممانعـت از آزادسـازی آن از ماکروفـاژهـا، سطـح آهـن را کاهش میدهد(6، 4). در سال‌های اخیر مطالعه‌های زیادی بر روی پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدیSNP)) در ژن‌ها انجام شده است این واریانت‌ها ممکن است پاتوژن نباشند اما میتوانند تغییراتی را بر روی ساختمان پروتئین و میزان بیان آن اعمال کنند. در این تحقیق ارتباط میان واریانت‌های rs8101606 ، rs10421768 ، rs66868858 که از فراوانی نسبتاً زیادی در جمعیت سفید برخوردار هستند، با سرباری آهن با روش HRM مورد مطالعه قرار گرفت. پورن‌پرازرت و همکاران نیز برای تشخیص بیماری آلفا تالاسمی و حذف ژن بتاتالاسمی از این روش استفاده کردند. از مزیت‌های این روش می‌توان به ساده بودن، قدرت تشخیص و دقت بالا حتی در مقادیر کم DNA اشاره کرد. نیاز نداشتن به مراحل بعد از PCR نیز باعث افزایش سرعت و کاهش احتمال آلودگی می‌شود (11). واریانت rs10421768: نتایج مطالعه‌های قبلی تاثیر آلل G این واریانت را در کاهش بیان ژن هپسیدین نشان میدهد، که این کاهش در نهایت منجر به افزایش آهن پلاسما خواهد شد. پاراجز و همکاران تاثیر پلی‌مورفیسمA>G در E-BOX این ژن را مورد بررسی قرار داد که باعث کاهش اتصال فاکتور‌های رونویسی و در نتیجه کاهش بیان هپسیدین می‌شود(13، 12، 8). نتایج به دست آمده در مطالعه ما ارتباطی بین ژنوتیپ‌های این پلی‌مورفیسم و سرباری آهن کبدی و نیز میزان فریتین سرم را نشان نمیدهد. واریانت rs8101606 و rs66868858: تاکنون مطالعه‌ای بر روی این واریانت‌ها در سطح دنیا صورت نگرفته است ولی با توجه به فراوانی نسبتاً بالای آن در جمعیت، حائز اهمیت و قابل بررسی هستند. در مطالعه مشابهی که توسط آندریانی و همکاران بر روی یکی از
پلی‌مورفیسم‌های ژن HAMP دربیماران تالاسمی ماژور انجام شد، وجود این پلی‌مورفیسم با سرباری آهن کبدی و افزایش سطح سرمی فریتین در بیمارانی که به طور منظم درمان آهنزدایی ندارند، ارتباط داشت(10). در حالیکه در مطالعه ما تمامی بیماران درمان منظم داشتند. نمودار‌ها افزایش آهن سرمی و کبدی در حضور موتانت این واریانت‌ها را نشان می‌دهند اما در مطالعه ما ارتباط معناداری میان آن‌ها پیدا نشد. در مطالعه‌ای که آلتس و همکاران بر روی جهش‌های ژن HAMP در بیماری هموکروماتوزیس انجام داد، مشاهده کرد که حضور هم‌زمان جهش در این ژن و ژن هموجوولین در به وجود آمدن این بیماری مؤثر هستند(14). نتیجه‌گیری هپسیدین در هموستاز آهن و متابولیسم آن نقش مهمی را ایفا می‌کند هر چند پروتئینهای دیگری مانند فروپورتین، اریتروفرون و هموجوولین نیز در آن دخیل هستند. وجود واریانت‌های مختلف در هر کدام از این ژن‌ها میتواند بر هموستاز آهن تاثیرگذار باشد. اگر چه ارتباطی برای پلی‌مورفیسم‌های مورد مطالعه در این پژوهش یافت نشد لکن ممکن است نقش آن‌ها به صورت تجمیعی با سایر پلی‌مورفیسم‌های این ناحیه و به صورت هاپلوتیپ باشد که درک آن نیازمند مطالعه‌های جامعتر می‌باشد. تشکر و قدردانی این تحقیق موضوع پایاننامه دوره کارشناسی ارشد زیستفناوری پزشکی است و هزینه آن توسط مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون تأمین شده است. نویسندگان از کارکنان درمانگاه تالاسمی جهت همکاری صمیمانه در جمع‌آوری اطلاعات و نمونه بیماران کمال تشکر را دارند.
Yazdi M, Azarkeivan A, Ranjbar Kermani F, Shahabi M. The role of rs10421768, rs66868858 and 8101606 polymorphisms in hepcidin gene and iron overload in β-thalassemia patients. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2022; 19 (4) :321-328 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1434-fa.html
یزدی معصومه، آذرکیوان آزیتا، رنجبر کرمانی فهیمه، شهابی مجید. نقش پلی‌مورفیسم‌های rs8101606 ، rs10421768 و rs66868858 ژن هپسیدین در سرباری آهن بیماران مبتلا به تالاسمی ماژور مراجعه‌کننده به درمانگاه ظفر تهران. فصلنامه پژوهشی خون. 1401; 19 (4) :321-328
