نقش پلیمورفیسم rs371194629 ناحیه 3’-UTR ژنHLA-G بر استعداد ابتلا به ویروس HTLV-1 در اهداکنندگان خون خراسان رضوی زینب گنجیان مفرد1، علی عرب خزائلی2، فرزاد ملاحسینی3، مجید شهابی4 چکیده سابقه و هدف ویروس HTLV-1 از جمله ویروس‌های منتقله از راه خون میباشد که در برخی مناطق جهان و در مناطقی از شمال شرق ایران به صورت اندمیک مشاهده میشود. مولکول HLA-G که به عنوان یک آنتیژن لکوسیتی غیرکلاسیک شناخته میشود، دارای پلیمورفیسم rs371194629 در ناحیه 3’-UTR خود میباشد که ناشی از یک توالی اضافه 14 نوکلئوتیدی است و در مطالعه‌های مختلف تاثیر آن بر ابتلا به عفونتهای مختلف نشان داده شده است. هدف از این پژوهش، بررسی تاثیر این پلیمورفیسم بر استعداد ابتلا به ویروس HTLV-1 در اهداکنندگان خون خراسان رضوی بود. مواد و روش‌ها در این مطالعه تحلیلی، 131 اهداکننده خون مبتلا به ویروس HTLV-1 و 131 اهداکننده سالم شرکت داشتند. پس از استخراج DNA از لنفوسیت‌های خون محیطی، ژنوتیپ پلیمورفیسم rs371194629 با روش PCR-SSP تعیین شد. یافته‌های آماری به کمک آزمون کای‌دو و نرمافزار 23 SPSS تجزیه و تحلیل گردید. یافته‌ها ژنوتیپ هتروزیگوت DI ، بیشترین فراوانی را در هر دو گروه بیمار و شاهد داشت. نتایج به دست آمده نشاندهنده اختلاف معناداری بین فراوانی ژنوتیپ DD و استعداد ابتلا به ویروس HTLV-1 بود(03/0 p= ، 11/3-14/1 CI= 95% ، 89/1 OR=). بین فراوانی آللهای D و I و بیماری ارتباطی یافت نشد. نتیجه گیری با توجه به نتایج به دست آمده و نیز نتایج دیگران، پلیمورفیسم rs371194629در ناحیه 3’-UTR مولکول HLA-G میتواندیکی از عوامل مؤثر در ابتلا به ویروسHTLV-1 باشد. کلمات کلیدی:HTLV-1 ، عفونت، HLA-G تاریخ دریافت: 21/11/1399 تاریخ پذیرش: 08/10/1400
1- دانشجوی کارشناسی ارشد خون شناسی آزمایشگاهی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- PhD آمار و اپیدمیولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 3- کارشناس ارشد بیوشیمی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون و اداره کل انتقال خون مشهد ـ مشهد ـ ایران 4- مؤلف مسئول: PhD فرآورده‌های بیولوژیک ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه HTLV-1 (Human T-cell lymphotropic virus type1) ویروسی با زنجیره RNA از خانواده دلتا ویروس میباشد (2، 1). نوع 1 این ویروس(HTLV-1) در سال 1979در مبتلایان به بیماریلنفوپرولیفراتیوسلول T و نوع 2 ویروس(HTLV-2) متعاقباً در یک فرد مبتلا به لوسمی مویی شکل به عنوان اولین رتروویروس انسانی شناسایی شد(3). به علاوه موارد محدودی ازآلودگی انسان به نوع 3 و 4 این ویروس در سال‌های اخیر در آفریقای مرکزی گزارش شده است(5، 4). عفونت HTLV-1 میتواند منجر به لوسمی سلول T بزرگسالان(ATL : Adult T-cell leukaemia/lymphoma)، فلج شل گرمسیری همراه با میلوپاتی ناشی از HTLV-1 (HAM/TSP : HTLV-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis)، التهاب عنبیه ونیز التهاب عفونی پوست در کودکان شود(4). آنتیژنهای لکوسیتی(HLA : Human leukocyte antigens) کلاس یک به دو گروه کلاسیک شامل HLA A, B, C وغیر کلاسیک HLA E, G, Fتقسیم میشود. مولکول HLA-G یک HLA کلاس یک غیر کلاسیک با پلیمورفیسم محدود است که غالباً دربارداری ودر طی رابطه مادر و جنین شناخته میشود.این مولکول اثرمستقیم بر مهار پاسخ‌های ایمنی داشته وتولید سلولهای مهاری و تنظیمی را القا میکند(7-3). مطالعه‌ها روی پلیمورفیسمهای ناحیه 3'-UTR مولکول HLA-G در بیماران مبتلا به HTLV-1 نشان میدهد که بعضی پلیمورفیسمها با کاهش تولید HLA-G همراه بوده که در نهایت کاهش احتمال گسترش آلودگی به ویروس HTLV-1 را در پی داشته در حالی که پلیمورفیسمهای دیگر با افزایش تولید HLA-Gودرنتیجه افزایش احتمال آلودگی به ویروس HTLV-1 در سلولهای میزبان همراه بوده است(8). به عنوان مثال ژنوتیپ‌های مختلف پلیمورفیسم rs371194629 که ناشی از یک اضافه(insertion) 14 جفت نوکلئوتیدی در ناحیه 3’-UTR ژن میباشد، در میزان ویروس در جریان خون تاثیر دارد به گونهای که وجود ژنوتیپ bp14+/bp14+ با کاهش بار ویروسی همراه است، در حالی که ژنوتیپ‌های bp14+/bp14-و bp14-/bp14- با افزایش بار ویروس همراه هستند(9). هدف از این مطالعه بررسی تاثیر این پلیمورفیسم(rs371194629) در استعداد ابتلا به عفونت HTLV-1 در اهداکنندگان خون در استان خراسان رضوی بود. مواد و روش‌ها مطالعهانجام شده به صورت تحلیلی و از نوع مورد - شاهدی بود. در این مطالعه از 131 فرد HTLV-1 مثبت که آزمایش الایزا ووسترن بلات مثبت داشتند، به عنوان مورد و از 131 فرد سالم مراجعه‌کننده به پایگاه انتقال خون استان خراسان رضوی به عنوان نمونه شاهد استفاده شد. تمامی نمونهها از نظر عفونتهای ویروسی HBV ، HCV و HIV-1 منفی گزارش شده بودند. از تمام افراد مورد مطالعه رضایت‌نامه کتبی دریافت گردید. این مطالعه مصوب کمیته اخلاق در پژوهش مؤسسه عالی آموزشی پژوهشی طب انتقال خون ایران به شماره IR.TMI.REC.1398.030 است. نمونه خون کامل به مقدار 10 میلیلیتر، در لولههای حاوی ضد انعقاد EDTA جمعآوری گردید. برای نمونه‌های HTLV-1 مثبت با استفاده از گرادیان فایکول لنفوسیت‌های خون جداسازی شده و پس از شستشو با بافر سالین- فسفات در دمای 70- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. برای نمونه‌های گروه شاهد از بافی‌کوت استفاده شد. DNA ژنومیک با استفاده از کیت(PrimerPrep Genomic DNA Isolation Kit from Blood ، سئول، کره) استخراج شد. در ابتدا 10 نمونه با آغازگرهای HLA-G-f و HLA-G-r تکثیر شده و برای تعین توالی ارسال شد(شرکت ژن فناوران، تهران، ایران). از این نمونهها جهت ارزیابی صحت نتایج واکنشهای PCR-SSP (Polymerase chain reaction-sequence specific primer) استفاده شد. برای تعیین ژنوتیپ از روش PCR-SSP استفاده گردید. اساس این روش بر طراحی آغازگرهایی است که در نوکلئوتید 3’ با یکدیگر تفاوت دارند و بدین‌وسیله تعیین ژنوتیپ پلیمورفیسمهای تک نوکلئوتیدی را امکانپذیر میکند. البته در این پژوهش با توجه به تفاوت 14 نوکلئوتیدی دو آلل، قسمتی از توالی آغازگر تشخیص‌دهنده آلل I در داخل این 14 نوکلئوتید قرار داشته و در نتیجه با آلل D (که فاقد 14 نوکلئوتید میباشد) واکنش نخواهد داد. برای تشخیص آلل 14 bp deletion از آغازگرهای HLA-G-f و 629-14d و برای تشخیص آلل 14 bp insertion از آغازگرهای HLA-G-r و 629-14i استفاده شد(جدول 1). واکنشهای PCR در حجم µL 10 حاوی µL 5 از Premix (پارس توس، تهران، ایران)، µL 2/0 از هر کدام از آغازگرها و ng 50 از DNA ژنومیک انجام شد. مشخصات دمایی واکنشهای PCR در جدول آورده شده است(جدول 2). محصول PCR روی ژل آگارز 5/1 درصد حاوی رنگ Green viewer (پارس توس، تهران، ایران) الکتروفورز و عکسبرداری شدند. برای محاسبات آماری از آزمون کای‌دو و نرمافزار 23 SPSS استفاده شد. یافته‌ها فراوانی ژنوتیپها با معادله هاردی وینبرگ بررسی شده و مشخص شد فراوانیها در حالت تعادل قرار دارد (جدول 3). بیشترین فراوانی در هر دو گروه مربوط به ژنوتیپ DI (6/49% برای گروه سالم و 3/40% برای گروه مورد) بود. نتایج آزمونهای آماری نشان داد ژنوتیپ DD شانس ابتلا به عفونت HTLV-1 را افزایش میدهد(03/0 p= ، 11/3-14/1 CI= 95% ، 89/1 OR=)(جدول 4). ارتباطی بین آللهای D و I با بیماری مشاهده نشد. بحث HLA-G یک آنتیژن غیرکلاسیک کلاس 1 میباشد که در تعدیل پاسخ‌های ایمنی نقش دارد. پلیمورفیسم rs371194629 که در 3’-UTR این ژن قرار دارد، بر میزان بیان این ژن تاثیر دارد به گونهای که ژنوتیپ DD باعث بیشترین بیان ژن میشود. در این مطالعه نیز که روی افراد HTLV-1 مثبت انجام شد، مشخص گردید ژنوتیپ DD احتمال ابتلا به ویروس را افزایش میدهد. مطالعه‌های حداد و همکارانش در سال 2010 در ارتباط با تأثیر این پلیمورفیسم بر روی استعداد ابتلا به ویروس HTLV-1 نشاندهنده ارتباط بین ژنوتیپ هتروزیگوت(DI) با میزان ابتلا به بیماری بود(022/0 p= ، 202/2 OR=)(8). هر چند نتایج مطالعه‌های سیلیائو و همکارانش بر خلاف نتایج ما میباشد زیرا در آن مطالعه ژنوتیپ DD ، نقش محافظت‌کننده در برابر ویروس HTLV-1 دارد(9). دلیل این امر را میتوان در تعدد پلیمورفیسمها در ناحیه 3’-UTR ژن HLA-G ذکر کرد که میتوانند به صورت یک هاپلوتیپ خاص اعمال اثر کنند. به علاوه تفاوتهای ژنتیکی جمعیتهای مورد مطالعه نیز باید در نظر گرفته شود. مطالعه‌های ال‌وی و همکارانش نشاندهنده نقش محافظتی آلل II در پیشگیری از ابتلا به عفونت HTLV-1 میباشد که با نتایج مطالعه ما هم‌خوانی دارد. به علاوه نتایج آن‌ها نشان داد که افراد مبتلای دارای این ژنوتیپ(II)، دارای بار ویروسی کمتری نسبت به مبتلایان با دیگر ژنوتیپها میباشند(10). پژوهش سگیت و همکارانش در سال 2013 نیز مؤید نقش ژنوتیپ DD در کاهش خطر انتقال ویروس HIV-1 از مادر به جنین بود به طوری که مادرانی که دارای این ژنوتیپ بودند، دارای بیشترین تعداد سلولهای CD4+ نسبت به دارندگان سایر ژنوتیپها بودند و به میزان کمتری ویروس را به جنین خود منتقل کردند(11). اگر چه تاکنون در کشور ما مطالعهای در رابطه با این پلیمورفیسم و عفونت HTLV-1 صورت نگرفته است اما
سایر مطالعه‌ها مؤید ارتباط این پلیمورفیسم با آدنوکارسینومای معده، سقطهای مکرر و هپاتیت B مزمن میباشد(15-12). در مطالعه ما نیز ژنوتیپ DD خطر ابتلا به عفونت HTLV-1 را افزایش میدهد. این ژنوتیپ باعث افزایش بیان بیشتر آنتیژن HLA-G می‌گردد هر چند چگونگی ارتباط بین افزایش بیان این آنتیژن و افزایش خطر ابتلا به عفونت مشخص نشده است. نتیجه‌گیری آنتیژنهای سیستم HLA نقش مهمی در استعداد ابتلا به عفونتهای مختلف دارند. آنتیژن HLA-G نیز از این قاعده مستثنی نمیباشد. یافته‌های این مطالعه نیز نشان دهنده تاثیر پلیمورفیسم rs371194629 در استعداد ابتلا به عفونت HTLV-1 میباشد. با توجه به نتایج مطالعه ما و نیز مطالعه‌های مشابه، مناسب است در رابطه با نقش سایر پلیمورفیسمهای ناحیه 3’-UTR ژن HLA-G نیز بررسی به عمل آید. به علاوه نقش این پلیمورفیسم(14 bp indel) در استعداد ابتلا به سایر عفونتهای منتقله از راه خون به خصوص HBV و HCV و نیز سیر بیماری ناشی از آن‌ها نیز بررسی شود. تشکر و قدردانی این مقاله نتیجه پایاننامه کارشناسی ارشد رشته خون‌شناسی آزمایشگاهی و بانک خون میباشد که هزینه آن توسط مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون تأمین شده است.
Ganjian Mofrad Z, Arabkhazaeli A, Mollahoseini F, Shahabi M. Role of HLA-G 14 bp Indel polymorphism on susceptibility to HTLV-1 infection in blood donors of Khorasan Razavi Blood Center. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2022; 19 (1) :24-29 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1392-fa.html
گنجیان مفرد زینب، عرب خزائلی علی، ملاحسینی فرزاد، شهابی مجید. نقش پلیمورفیسم rs371194629 ناحیه 3’-UTR ژن HLA-G بر استعداد ابتلا به ویروس HTLV-1 در اهداکنندگان خون خراسان رضوی. فصلنامه پژوهشی خون. 1401; 19 (1) :24-29
