چکیده سابقه و هدف ایجاد آنتیبادی علیه آنتیژنهای HLA و آنتیژنهای اختصاصی پلاکتی HPA به دنبال تزریق خونو فرآوردهها محتمل است. این امر منجر به بروز عوارضی نظیر پورپورای پس از تزریق، مقاومت پلاکتی ایمیون، ترومبوسیتوپنی و خونریزی در گیرندگانمیگردد. در این مطالعه، آنتیژنها وآنتیبادیهای پلاکتی به طور همزمان در بیماران با تزریق خون مکرر بررسی شدند. مواد و روشها در این مطالعه توصیفی، آنتیژنها و آنتیبادیهای پلاکتی به روش PCR-SSP و فلوسیتومتری PIFT در 30 بیمار تالاسمی ماژور و 30 بیمار هماتوانکولوژی با تزریق خون مکرر که شمارش پلاکتی یک ساعت پس از تزریق /µL 450000-150000 داشتند،بررسی شدند.برای مقایسه نتایج جمعیتهای مورد مطالعه، از 19 SPSS و آزمون آماری کایدو استفاده شد. یافتهها در بررسی فراوانی ژنوتیپی در بیماران هماتوانکولوژی و تالاسمی، ژنوتیپ HPA-1a/1a دارای بیشترین فراوانی و ژنوتیپهای HPA-1a/1b و HPA-3b/3b دارای کمترین فراوانی بودند. هموزیگوت 1b/1b و 2b/2b و5b/5b مشاهده نشدند. آلل HPA-4b در بیماران مورد بررسی یافت نشد. نتیجه فلوسیتومتری PIFT در 10 بیمار هماتوانکولوژی (30%) و یک بیمار تالاسمی(3/3%) مثبت شد. فراوانی موارد مثبت آنتیبادیها در گروه بیماران هماتوانکولوژیک واضحاً بیشتر از گروه تالاسمی بود(006/0 p=). نتیجه گیری با توجه به فراوانی 100 درصدی آللHPA-4a و فقدان آلل HPA-4b و عدم مشاهده ژنوتیپ هموزیگوت b/b آللهای HPA-1/-2/-5 در بیماران این مطالعه، احتمال وقوع آلوایمیونیزاسیون پلاکتی ناشی از آنتیبادیهای ضد این آنتیژنها در این بیماران کمتر است. کلمات کلیدی: پلاکتها، آنتیژنها، آنتیبادیها، PCR
تاریخ دریافت: 16/7/99 تاریخ پذیرش: 25/9/99
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- مؤلف مسئول: متخصص آسیبشناسی بالینی و تشریحی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665 3- کارشناس ارشد بیوشیمی بالینی ـ مربی مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 4- دکترای ایمونولوژی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه بیمارانی که به طور مکرر خون و فرآوردههای خونی نظیر پلاکت دریافت میکنند(multitransfused)، بر ضد آلوآنتیژنهای دریافتی نظیر آنتیژنهای اختصاصی پلاکت (Human platelet Antigens ؛ HPA) و آنتیژنهای سازگاری نسجی (Human Leukocyte Antigens؛HLA )، آلوآنتیبادی تولید میکنند(1). آلوایمیونیزاسیون علیه آنتیژنهای پلاکتی میتواند پس از تزریق خون، پیوند اعضا و در افراد سالم به دنبال بارداری ایجاد شود. این آنتیبادیها بر خلاف آنتیبادیهای ضد آنتیژنهای گلبولهای قرمز به صورت طبیعی ساخته نمیشوند(2). عمده عوارضی که به دلیل ناسازگاری آنتیژنهای پلاکتی و آلوایمیونیزاسیون و متعاقب آن تولید آلوآنتیبادیها روی میدهند شامل ترومبوسیتوپنی آلوایمیون نوزادان، پورپورای پس از تزریق و مقاومت پلاکتی هستند(3). خود آنتیژنهای پلاکتی همچنین جزو مولکولهای سازگاری نسجی فرعی(mHC; Minor Histocompatibility Complex ) میباشند(4). علاوه بر دریافتکنندگان فرآورده پلاکتی، در برخی از بیماران با تزریق خون مکرر مانند بیماران بتا تالاسمی ماژور که به طور منظم گلبول قرمز متراکم(PRBC) دریافت میکنند، خطر آلوایمیونیزاسیون نه تنها بر علیه آنتیژنهای RBC بلکه همچنین بر ضد آنتیژنهای HPA و HLA-1 نیز وجود دارد که میتواند به سبب حضور تعداد اندک پلاکت و لکوسیت موجود در پلاسمای کیسههای PRBC رخ دهد. آگاهی از این مسأله میتواند سبب بهبود آمادهسازی کیسههای PRBC ، مثل به کارگیری فرآوردههای کم لکوسیت، با به حداقل رساندن آلوایمیونیزاسیون پلاکتی و کاهش عوارض ناشی از آن شود (6، 5). در بیماران هماتوانکولوژینیز به دنبال تزریق مکرر فرآورده پلاکتی و از آن جایی که آنتیژنهای ABO گروه خونی به مقدار کمی(کمتر از RBC) روی پلاکت نیز بروز میکنند، تزریق فرآوردههای پلاکتی ناسازگار از لحاظ ABO به غیر از تولید anti-A وanti-B ، میتواند تولید سایر آلوآنتیبادیها نظیر آنتیبادی ضـد HLA و HPA را نیـز در بدن بیمار سبب شده و خطر آلوایمیونیزاسیون پلاکتی را افزایش دهد(7). وفور ایمیونیزاسیون علیه آنتیژنهای HLA در بیماران با تزریق خون مکرر در مطالعههای متعدد به میزانهای مختلفی گزارش شده است، به طوری که در مطالعههای گوناگون، تا 69% در بیماران لوسمیک، 80% در بیماران آنمیآپلاستیک،30% تا 60% در بیماران مبتلا به سایر بدخیمیهای خونی و30% در بیماران بتاتالاسمی ماژور، این آنتیبادیها را ردیابی کردهاند. همچنین آنتیبادیهای ضد HPA در 90% از موارد پورپورای پس از انتقال خون، 56% از مبتلایان به ترومبوسیتوپنی اتوایمیون اولیه و 33% از مبتلایان به ترومبوسیتوپنی ایمیون ثانویه دیده میشوند(9، 8). با این اوصاف تعیین نوع آنتیژنهای پلاکتی جهت تشخیص، مدیریت و درمان عوارض بالینی فوقالذکر ضروری به نظر میرسد. در میان روشهای مولکولی که تاکنون برای بررسی آنتیژنهای پلاکتی استفاده شدند، PCR-SSP (Polymerase Chain Reaction-sequence-specific primers) بیشترین و سادهترین کاربرد را دارد(6). آنتیبادیهای ضد آنتیژنهای پلاکتیHLA و HPA همچنین احتمال وقوع مقاومت پلاکتی در بیماران با تزریق خون مکرر را افزایش میدهند و باعث عدم تاثیر تزریق پلاکت و عدم افزایش شمارش پلاکتی متعاقب تزریق در این بیماران میگردند. بنابراین در بیماران با تزریق خون مکرر، تزریق فرآورده پلاکتی HLA/HPA سازگار توصیه میشود(11، 10). از سوی دیگر آلوآنتیبادیهای پلاکتی نه تنها بر علیه آلل a (آلل با وفور بیشتر) آنتیژنهای اختصاصی پلاکت(HPAs) بلکه بر علیه آلل b (آلل با وفور پایینتر) نیز ممکن است تولید شوند. از این رو تعیین ژنوتیپ آنتیژنهای پلاکتی در بیماران هماتوانکولوژیک هم در تشخیص علت ترومبوسیتوپنی آلوایمیون و هم در فراهم ساختن فرآورده پلاکتی سازگار با این آنتیژنها ارزش دارد. همچنین بررسیها نشان میدهند که در بیماران با ژنوتیپ هتروزیگوت a/b (که هر دو آلل وجود دارد) از نظر آنتیژنهای پلاکتی، احتمال ناسازگار بودن فرآورده تزریق شده در بیمار خیلی کم و یا نزدیک به صفر است ولی در بیمارانی که ژنوتیپ هموزیگوت aa و یا bb را برای هر آلل دارند، احتمال وقوع آلوایمیونیزاسیون پس از هر تزریق وجود دارد. از این رو مطالعه و بررسی آنتیژنهای پلاکتی در بیماران با عارضه ترومبوسیتوپنی ضروری است(12). هم چنین در بین آنتیژنهای اختصاصی پلاکتی به نظر میرسد آلوایمیونیزاسیون علیه HPA-5b بیشترین فراوانی را در بیماران با تزریق خون مکرر دارد(13). در این مطالعه به بررسی هم زمان آنتیژنهای پلاکتی (به روش مولکولی PCR-SSP) و آنتیبادیهای پلاکتی(به روش فلوسایتومتری PIFT یا Platelet Immuno flourescent Test) در بیماران با تزریق خون مکرر(بیماران تالاسمی ماژور و بیماران دارای اختلالات هماتوانکولوژیک) پرداخته شده است.
مواد و روشها این مطالعه توصیفی در فاصله زمانی آبان 1397 تا آبان 1398 بر روی 60 بیمار مولتی ترانسفیوز شامل 30 بیمار تالاسمی ماژور و 30 بیمار دارای اختلالات هماتوانکولوژیک صورت گرفت. معیار ورود به این مطالعه مولتی ترانسفیوز بودن بیماران(دریافت حداقل دو نوبت فرآورده پلاکتی و/یا پک سل توسط بیماران) و عدم وجود مقاومت پلاکتی(دارا بودن شمارش پلاکتی در محدوده µL/450000-150000 یک ساعت پس از تزریق پلاکت بر اساس گزارش CBC آزمایشگاهو تایید همکاران بالینی طرح) بود. بیماران هماتوانکولوژیک از بیمارستان شریعتی تهران(بخش هماتولوژی مرکز تحقیقات هماتولوژی/ انکولوژی و پیوند مغز استخوان) و بیماران تالاسمی ماژور از مرکز تالاسمی ظفر پس از اخذ رضایتنامه کتبی و با کد اخلاق IR.TMI.REC.1397.024از مؤسسه عالی آموزشی پژوهشی طب انتقال خون وارد مطالعه شدند. هر دو گروه بیماران به تایید همکاران بالینی طرح فاقد عوامل مستعدکننده ایجاد مقاومت پلاکتی غیر ایمیون شامل تب، مصرف داروهایی نظیر هپارین و آمفوتریسین B، خونریزی، عفونت و بزرگی طحال بودند. مقدار 3 میلیلیتر خون کامل در لولههای درب بنفش حـاوی ضـد انعقـاد EDTAK3 (بـرای بـررسی مــولکولی آنتیژنهای پلاکتی) و مقدار 3 میلیلیتر از سرم در لولههای لخته ژلدار درب زرد(برای بررسی سرمی آنتیبادیهای پلاکتی) از هر بیمار گرفته شد. نمونهها در دمای محیط و سریعاً به آزمایشگاه منتقل شدند و در فاصله 3 ساعت از نمونهگیری، بافیکوت حاول گلبولهای سفید آن جدا شده و استخراج DNA با استفاده از ستون فیلتردار سیلیکایی در کیت کیاژن بر اساس لیز سلولها و آزاد شدن ژنوم از پروتئینها صورت گرفت. DNA به سیلیکا ژل غشاء ستون کیت کیاژن متصل شده وخالصسازی شد و سپس جذب نوری اسید نوکلئیک در دو طول موج 260و 280 نانومتری اندازهگیری شد(14). بخش سرمی نمونه نیز در دمای 70- درجه سانتیگراد تا زمان بررسی آنتیبادیها در چند میکروتیوب تقسیم و نگهداری شد.
بررسی آنتیژنهای پلاکتی: برای تعیین ژنوتیپ آللهایa وb آنتیژنهای HPA-1/-2/-3/-4/-5/-15 از روش PCR-SSPاستفاده گردید. برای هر آلل لوله جداگانه و در نهایت برای هر نمونه DNAواکنش در 12 لوله جداگانه انجام شد. توالی آغازگرها (محصول بیونیر کره) که از طریق شرکت تکاپو زیست تهیه شدند در جدول آمده است(جدول 1). حجم کلی محتـوای واکنـش 20 میکرولیتر( شامل 4 میکرولیتر نمونه DNA ، 3/10 میکرولیتر از مخلوط واکنش و 7/5 میکرولیتر از مخلوط آغازگرها) در هر لوله بود. مخلوط آغازگرها خود شامل یک میکرولیتر از هر یک از آغازگر مخصوص آلل(allele specific primer)، آغازگر مشترک دو آلل(common primer)، یک جفت آغازگر HGH (Human Growth Hormone) (به عنوان کنترل داخلی و کنترل مثبت واکنش PCR) و 7/3 میکرولیترdH2O بود که مقدار مصرفی هر کدام بسته به غلظت نهایی مورد نظر برای آن آغازگر داشت. مقـدار آنزیـم DNA تک پلیمراز (Units 1000 ، رٌوش) بـرای هـر واکنش 3/0 میکرولیتر بود که به مخلوط واکنش اضافه شد. مخلوط واکنش شامل: 10 میکرولیتر از x Master Mix2 برای هر لوله واکنش بود. غلظت نهایی MgCl2 در همه واکنشها 5/1 میکرومولار در نظـر گـرفته شـد. واکـنش PCR در تـرموسایکلر بیـــوراد
جدول 1: توالی آغازگرها، اندازه، غلظت نهایی و اندازه مورد انتظار برای محصولات تکثیری در هر آنتیژن
(TC135) انجـام گـرفت. چرخـه انجام PCR برای تکثیر به شرح زیر بود: پس از یک دقیقه انکوباسیون در دمای 96 درجه سانتیگراد برای فعال شدن، چرخه آمپلیفیکاسیون در 3 مرحله در نظر گرفته شد. مرحله اول 5 چرخه شامل: 96 درجه سانتیگراد به مدت 25 ثانیه، 68 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، 72 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، مرحله دوم 20 چرخه شامل: 96 درجه سانتیگراد به مدت 25 ثانیه، 61 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، 72 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه و مرحله سوم 15چرخه شامل: 96 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، 51 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، 72 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه. واکنش در پایان با مرحله الانگیشن(Eloangation) شامل 1 چرخه در 72 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه، تکمیل شد. پس از انجام مراحل تکثیر، برای الکتروفورز در روی ژل آگاروز 2%، محصولات PCR به نسبت 1 به 4 با ماده رنگی سایبرگرین مخلوط شده و باندهای حاصله با ترانس ایلومیناتورUV در طول موج 320 نانومتر مشاهده و با استفاد از Gel DOC عکسبرداری صورت گرفت و در نهایت عکسها مورد بررسی قرار گرفتند.
تفسیر نتایج روش PCR : غلظت آغازگرهای HGH که به عنوان کنترل داخلی در هر واکنش لحاظ شدند، طوری محاسبه گردید که کمتر از آغازگرهای اصلی باشند و در هنگام تکثیر رقابتی ایجاد نکنند و در نتیجه وجود باند کنترل داخلی مؤید صحت روند آزمایش و مواد مورد استفاده بود. باندهای مربوط به آللها با استفاده از سایز مارکر و مقایسه آن با باند موجود در هر ردیف تشخیص داده شدند(جدول 1). نتایج حاصله یادداشت شده و سپس وفور موارد مشاهده شده با موارد قابل انتظار با قانون هاردی وینبرگ و با استفاده از آزمون آماری کایدو مقایسه گردید. در صورت عدم اختلاف یعنی موارد مشاهده شده با موارد قابل انتظار طبق قانون هاردی وینبرگ مطابقت دارد و با وارد کردن فراوانی آللی موارد هموزیگوت و هتروزیگوت در محاسبهگر خودکار هاردی وینبرگ(بر اساس معادله 1= ab2 + 2b + 2a)، وفور آللهای a و b برای آنتیژنهای پلاکتی محاسبه شدند. برای مقایسه فراوانی نسبی ژنها در جمعیتهای مختلف نیز از مقایسه نسبتها با آزمون کایدو و نرمافزار 19 SPSS استفاده شد. 05/0 p< بیانگر تفاوت معنادار بود. در صورت فقدان باند تنها در حالتی جواب را منفی و به عنوان عدم حضور آلل تلقی کردیم که تکثیر ژن کنترل (HGH) صورت گرفته و باندی به اندازه bp 429 در الکتروفورز مشاهده شد.
بررسی آنتیبادیهای پلاکتی: ابتدا Pooled پلاکتی از گروه خون O تهیه شد. نمونههای خون کامل که از5 فرد سالم در لوله حاوی ضد انعقاد EDTA جمعآوری شده بود، توسط آنتی سرم گروهبندی ABO (لورن) گروهبندی گردید. این لوله با نیروی g200 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردید. پس از سانتریفیوژ خون کامل به سه قسمت تبدیل شد. قسمت ته لوله حاوی RBC، قسمت میانی بافیکوت و قسمت رویی حاوی پلاسما و پلاکت بود که به آن پلاسمای غنی از پلاکت(PRP ، Platelet Rich Plasma) گفته می شود. در این مرحله با سمپلر و به آرامیPRP را از لوله جدا کرده و در یک لوله مجزا ریخته شد. سپس 5/0 میلیلیتر از آن با دستگاه سل کانتر شمارش گردید و در نهایت تعداد کل پلاکت در هر میلی لیتر از PRP مورد نظر محاسبه گردید و به نحوی رقیقسازی انجام شد که سوسپانسیون پلاکتی با تعداد pLt/mL 105×10 از افراد با گروه خون O تهیه شد. 50 میکرولیتر از Pooled PRP مذکور را در لوله فلوسیتومتری ریخته و 50 میکرولیتر ازسرم بیمار را به آن افزودیم. در لوله کنترل فقط سوسپانسیون و بافر به جای سرم بیمار در لوله جداگانه اضافه گردید. به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه و پس از طی زمان انکوباسیون، سوسپانسیون 3 مرتبه با (PBS; phos phate buffered saline)(نیروی g2000 و زمان 10 دقیقه) شست و شو داده شد. پس از آخرین مرحله شست و شو، به رسوب زیرین از آنتیهیومن گلوبولین کونژوگه با FITC (داکو) اضافه گردید. آنتیسرم مذکور در غلظت نهایی30/1 با PBS رقیق شده و به لوله واکنش 50میکرولیتر اضافه نموده و به مدت 30 دقیقه در تاریکی در محیط آزمایشگاه انکوبه گردید. سپس یک بار بامحلول شستشو PBS ، 10 دقیقه در دور g200 سانتریفیوژ گردید. مایع رویی دور ریخته شد و مابقی برای تجزیه و تحلیل به دستگاه فلوسیتومتری داده شد و تا event 10000 قرائت شد(15). روش فلوسیتومتری با استفاده از دستگاهpartec-cyFlow انجام شد و توسط نرمافزار فلومکس تجزیه و تحلیل گردید. در روش فلوسیتومتری در هر ران کاری یک نمونه کنترل مثبت (حاوی Daco Anti-HLA Positive Contorol + پولد پلاکتی) و یک نمونه کنترل منفی(حاوی PBS + پولد پلاکتی) و ایزوتایپ کنترل(حاوی Daco Isotype Control + پولد پلاکتی) به عنوان کنترل استفاده شدند. برای تنظیم نمودارها و ولتاژ دستگاه و شروع خوانش، ابتدا لوله حاوی ایزوتایپ کنترل به دستگاه فلوسیتومتری داده شد.
یافتهها در این مطالعه آنتیژنها و آنتیبادیهای پلاکتی در 60 بیمار در دو گروه شامل 30 نفر در گروه بیماران دارای اختلالات هماتوانکولوژیک(بدون مقاومت پلاکتی) و30 نفر در گروه بیماران تالاسمی ماژور به شرح زیر مورد بررسی قرار گرفتند: در گروه بیماران هماتوانکولوژیک از 30 بیمار با تزریق خون مکرر(مراجعهکننده به بیمارستان شریعتی تهران) با میانگین سنی 1/4 ± 10/30 سال و محدوده سنی 47-10 سال، شامل 16 (3/53%) زن و 14 (6/46%) مرد و با شمارش پلاکتی یک ساعت پس از تزریق در محدوده µL/450000-1500000 ، 25 نفر(4/83%) مبتلا بهAML ، 3 نفر(10%) مبتلا به ALL ، 1 نفر (3/3%) مبتلا به سندرم میلودیسپلازی و 1نفر(3/3%) نیز مبتلا به هموگلوبینوری حملهای شبانه بودند. در این بیماران فراوانی مطلق و نسبی ژنوتیپی و وفور آللی آنتیژنهای پلاکتی به دست آمد (جدول 2). ارزشp محاسبـه شده بـرای وفـور ژنوتیپی آنتیژنهای
جدول 2: فراوانی مطلق و نسبی ژنوتیپی و فراوانی آللی آنتی ژنهای پلاکتی در بیماران با اختلال هماتولوژیک(بدون مقاومت پلاکتی)
مختلف در محدوده 98/0 p>> 7/0 نشان داد که فراوانی آللی در این بیماران مطابق قانون هاردی واینبرگ قابل محاسبه است که در ستون اول جدول 2 از سمت راست نمایش داده شده است. در این گروه وفور آلل a برای آنتیژنهایHPA-1,-2,-3,-4 ,-5, -15 از وفور آلل b، بیشتر به دست آمد. همچنین موردی از آلل HPA-4b و نیز موردی از هموزیگوت bb برای آنتیژنهای HPA-1,-2,-5 در این گروه مشاهده نشد. در بررسی آنتیبادیهای پلاکتی به روش PIFT در بیماران این گروه، شدت فلورسنت قرائت شده در روش فلوسیتومتری برای 30 نمونه، در محدوده30/46%-1/0% متغیر بود که برای آن میانگین و انحراف معیار محاسبه شد. برای تعیین cut off اگر درصد قرائت شده شدت فلورسنت برای فرد از M+ 2SD شدت فلورسنت(MF) قرائت شده (عدد 4/10% به دست آمده در مطالعه ما)، بزرگتر شد، نتیجه مثبت و اگر کمتر از 4/10% بود منفی تلقی شدند. در کل نتایجPIFT برای 9 نفر(30 %) شامل 4 زن و 5 مرد در این گروه مثبت(بالای 4/10%) شدند که 5 نفر از این بیماران دچار AML؛ 3 نفر از این بیماران دچار ALL؛ و یک نفر نیز مبتلا به PNH بودند. در گروه بیماران تالاسمی نیز تعداد 30 بیمار با میانگین سنی 4/10 ± 4/36 سال و محدوده سنی 68-21 سال شامل 17(6/56%) زن و 13 (3/43%) مرد از مراجعین مرکز تالاسمی ظفر با مشارکت همکار طرح انتخاب شده و مورد مطالعه قرار گرفتند. بیماران منتخب سابقه عوارض همولیتیک تزریق خون نداشتند. این بیماران سالها فرآورده گلبول قرمز متراکم(و در سالهای اخیر از نوع کم لکوسیت عمدتاً prestorage) دریافت کرده بودند.فراوانی مطلق و نسبی ژنوتیپی و فراوانی آللی آنتیژنهای مختلف پلاکتی در این بیماران به دست آمد (جدول 3).
جدول 3: فراوانی مطلق و نسبی ژنوتیپی و فراوانی آللی آنتیژنهای پلاکتی در بیماران مبتلا به تالاسمی ماژور
جدول 4: وفور ژنوتیپی آنتیژنهای پلاکتی در دو گروه بیماران مورد بررسی
ارزش p محاسبه شده برای وفور ژنوتیپی آنتیژنهای مختلف در محدوده 092/0 <p< 83/0 نشان داد که فراوانی
آللی برای HPAs در این بیماران مطابق قانون هاردی واینبرگ قابل محاسبه است که در ستون اول از سمت راست جدول 3 نمایش داده شده است. در بررسی آنتیبادیهای پلاکتی به روش PIFT در این گروه شدت فلورسنت قرائت شده در روش فلوسیتومتری برای 30 نمونه بیمار مبتلا به تالاسمی مورد بررسی در این مطالعه، در 29 نمونه در محدوده 60/3%-1/0% متغیر و منفی بود و فقط در یک مورد(3/3%) بیمار خانم 85/57% قرائت شد که با توجه به این که بیش از 4/10% بود، مثبت در نظر گرفته شد. در مقایسه وفور ژنوتیپی آنتیژنها و فراوانی آنتیبادیها در دو گروه بیماران مورد بررسی در این مطالعه دیده شد که وفور ژنوتیپی همه آنتیژنهای پلاکتی بین بیماران تالاسمی و بیماران هماتوانکولوژیک یکسان است و این دو گروه از این لحاظ اختلاف معناداری ندارند. همچنین آلل HPA-4b در هیچ یک از بیماران در مطالعه مشاهده نشد(جدول 4). نتیجه PIFTدر 10 نفر از کل بیمارانشامل 4 زن و 5 مرد از بیماران با اختلالات هماتوانکولوژی و یک زن مبتلا به تالاسمی مثبت شد. فراوانی موارد مثبت این آنتیبادیها بین گروه بیماران هماتوانکولوژیک آشکارا و به طور معناداری بیشتر از گروه تالاسمی بود(006/0 p=). نتایج قرائت شده ژل الکتروفورز PCR یک بیمار و یک نمونه نمودار سیتوگرام مثبت فلوسیتومتری نیز نشان داده شد(شکلهای 1 و 2).
شکل 1: باندهای حاصل از الکتروفورز محصولات PCR مربوط به ژنهای مختلف HPAs در یکی از بیماران. در این شکل طول باند HPA-1:90 bp /HPA-2:258 bp /HPA-3: 367 bp /HPA-4:126 bp /HPA-5:250 bp و HPA-15:225 bp است و NC در چاهک اول کنترل منفی میباشد.
شکل 2: نمودار سیتوگرام یک بیمار مثبت از نظر وجود آنتیبادیهای پلاکتی توسط آزمایش PIFT . نمودار SSC/FSCR1 gate)) میزان سلولهای مورد بررسی را نشان میدهد. نمودار count/FL2 (RN2 gate) میزان سلولهای CD41 مثبت(پلاکتها) و نمودار count/FL1 (RN1gate) میزان پلاکتهای مثبت از نظر آنتیبادیهای پلاکتی را نشان میدهد، (39/48= RN1 میباشد).
بحث در این مطالعه آنتیژنهای پلاکتی به روش مولکولیPCR-SSP و آنتیبادیهای ضد آنتیژنهای پلاکتی به روش فلو PIFT در60 بیمار با تزریق خون مکرر شامل 30 بیمار هماتوانکولوژی بدون مقاومت پلاکتی و 30 بیمار تالاسمی ماژور بررسی شدند. وفور آللی آنتیژنهای پلاکتی در بیماران دارای اختلالات هماتوانکولوژی بدون مقاومت پلاکتی به صورت: (95/0) HPA-1a ، (05/0) HPA-1b ، (87/0) HPA-2a ، (13/0) HPA-2b ، (52/0) HPA-3a ، (48/0) HPA-3b ، (0/1) HPA-4a ، (92/0) HPA-5a ، (08/0) HPA-5b ، (55/0) HPA-15a و (45/0) HPA-15b و در بیماران تالاسمی ماژور به صورت: (97/0) HPA-1a ، (03/0) HPA-1b ، (85/0) HPA-2a ، (15/0) HPA-2b ، (63/0) HPA-3a ، (37/0) HPA-3b ، (0/1) HPA-4a ، (0/1) HPA-5a ، (48/0) HPA-15a و (52/0) HPA-15b به دست آمد. هیچ موردی از HPA-4b در این مطالعه دیده نشد. در مقایسه وفور آللی آنتیژنهای پلاکتی بین این دو گروه، اختلاف معناداری بین وفور ژنوتیپی و آللی آنتیژنهای HPA-1,2,3,4,5,15 آنها مشاهده نشد. طبق نتایج حاصله در بررسی فراوانی آنتیژنهای پلاکتی بین این دو گروه بیمار، به نظر میرسد بیشترین میزان هموزیگوسیتی به ترتیب مربوط به آنتیژنهای HPA-4a/4a با فراوانی 100% و HPA-1a/1a با فراوانی 97% و HPA-5a/5a با فراوانی 92% باشد. در مقابل کمترین میزان هموزیگوسیتی در HPA-4b/4b و HPA-1b/1b و به ترتیب با فراوانی صفر و 3% مشاهده شد. از سوی دیگر بیشترین میزان هتروزیگوسیتی مربوط به آنتیژن HPA-3 با میزان 7/56% و سپس آنتیژن HPA-15 با فراوانی50% و کمترین میزان هتروزیگوسیتی در این بیماران مربوط به آنتیژن HPA-2 با درصد فراوانی 7/36% بود. میزان فراوانی ژنیHPA-1 در این مطالعه با مطالعه نوذری در سال 2019 و مدنی در سال 2007 که هر دو بر روی اهدا کنندگان خون انجام شده مشابهت داشته و بین این دو مطالعه و مطالعه حاضر اختلاف معناداری مشاهده نشد(17، 16). در مطالعه مستخدمین که در سال 2019 بر روی بیماران هماتوانکولوژی دارای مقاومت پلاکتی صورت گرفت، فراوانی آللa برایHPA-1,3,4,5 و آلل b برای HPA-2,15 در جمعیت مورد مطالعه بیشتر به دست آمد که این یافتهها به جز در موردHPA-2 ، با مطالعه حاضر مشابهت داشتند. همچنین در مطالعه مستخدمین هیچ موردی از HPA-4b و HPA-5b در بیماران دیده نشد که در خصوص HPA-4b با مطالعه ما مشابهت دارد. از سوی دیگر آنتیبادی ضد HPA در 4% بیماران مقاومت پلاکتی ردیابی شد(18)، در حالی که در مطالعه حاضر در 3/3% بیماران تالاسمی و 30% بیماران هماتوانکولوژی بدون مقاومت پلاکتی موفق به ردیابی این آنتیبادیها شدیم. در مطالعه دیگری که در سال 2005 توسط هالی در آفریقای مرکزی انجام گرفته بود، درصد فراوانی آنتیژن HPA-1a 100% گزارش شده و هیچ موردی از آنتیژن 1b یافت نشده که این تفاوت اندک با نتایج حاصل از فراوانی این آنتیژن در مطالعه ما احتمالا به دلیل حجم کم نمونه در این مطالعه است و اختلاف معناداری با هم ندارند(19). مدنی در مطالعهای در سال 2007 فراوانی آنتیژنهای پلاکتی و وفور آللی و محدوده وفور آنتیژنهای پلاکتی در اهداکنندگان خون(افراد سالم) در کشورهای مختلف شامل انگلستان، چین، ژاپن، بحرین، اسپانیا، فنلاند، اتریش، کره، آمریکا، عربستان، تایلند و هم چنین ایران را بررسی کرد(17). در مقایسه وفور آللی بیماران مطالعه حاضر با محدودههای وفور آللهای آنتیژنهای پلاکتی در جمعیتهای مختلف اهدا کنندگان(افراد سالم) در جهان، مشخص شد که فراوانی به دست آمده در بیماران این مطالعه برای آلل a مربوط به HPA-2, -15 اندکی کمتر از محدوده فوق و وفور آلل HLA-15b اندکی بیشتر از محدوده فوق است اما این اختلافها معنادار نمیباشند. وفور آللی آنتیژنهای مختلف به دست آمده برای آلل a مربوط به HPA-1 در هر دو گروه تالاسمی و بیماران هماتوانکولوژیک فاقد مقاومت پلاکتی گرچه اندکی بیش از این محدوده است اما با وفور آللهای آن در اهداکنندگان خون در ایران تفاوت معناداری ندارد. وفور سایر آللها برای این دو گروه کما بیش در محدوده وفور آللی برای جمعیت اهداکنندگان کشورهای مختلف قرار دارد. گر چه اختلافات فوق با محدودههای کلی در جمعیت اهداکنندگان مختلف مشاهده شدند اما این موارد معنادار نبودند. در جمعیتهای مختلف وفور آلل b برای HPA-15 در مقایسه با آلل a این آنتیژن بیشتر است که در مورد مطالعه ما نیز چنین بود(20). وفور ژنوتیپی و آللی بین دو گروه بیماران مورد بررسی در این مطالعه با اهداکنندگان خون ایرانی در مطالعه مدنی و همکاران مقایسه شد(17)(جدول 5). در مقایسه وفور آللی آنتیژنهای مختلف پلاکتی بین بیماران مبتلا به تالاسمی با اهداکنندگان خون در ایران(با 002/0 p=) و بیماران هماتوانکولوژی بدون مقاومت پلاکتی با اهداکنندگان(با 001/0 p=)، مشخص شد که فقط وفور آللهای a و b برای HPA-2 در هر دو گروه با اهداکنندگان تفاوت معناداری دارند و در سایر موارد بین این بیماران و اهداکنندگان ایرانی خون، مشابهت وجود دارد. به بیان دیگر وفور آللی برای HPA-2a/-2b بین اهداکنندگان برای آللهای2a و2b به ترتیب 54/0 و 46/0 و در بیماران تالاسمی 85/0 و 15/0 و در بیماران فاقد مقاومت پلاکتی87/0 و 13/0 ، بیانگر وفور بیشتر آللb در بین اهداکنندگان و وفور کمتر آن در بیماران این مطالعه میباشد و این امر شاید بتواند مطرحکنننده احتمال آلوایمونیزاسیون بیشتر علیه این آلل باشد که اثبات آن البته نیاز به بررسیها و مطالعههای بیشتر دارد. از سوی دیگر نتایج این تحقیق، حضور آنتیبادیهای ضد HPA در بیماران تالاسمی ماژور و بیماران هماتوانکولوژیک بدون مقاومت پلاکتی که در طی درمان فرآورده گلبول قرمز متراکم و یا پلاکت دریافت نموده بودند را به ترتیب در 3/3% (1 نفر) و30% (9 نفر) بیمـاران
جدول 5: مقایسه وفور ژنوتیپی و آللی بین بیماران این مطالعه با اهداکنندگان خون در ایران(21)
نشان داد که نشاندهنده میزان بالای حضور آنتیبادیهای پلاکتی در بیماران هماتوانکولوژیک نسبت به بیماران تالاسمی بود(006/0 p=). با توجه به این که بیماران هماتوانکولوژیک در روند درمان بیشتر فرآورده پلاکتی و بیماران تالاسمی بیشتر فرآورده گلبول قرمز متراکم دریافت میکنند، بیشتر بودن فراوانی آنتیبادیهای پلاکتی در گروه هماتوانکولوژی قابل قبول است. از سویی پیدا شدن آنتیبادیهای پلاکتی در بیماران تالاسمی که غالباً فرآورده پلاکتی دریافت نمیکنند، احتمالاً میتواند ناشی از این باشد که متعاقب تزریق گلبول قرمز متراکم در بیماران تالاسمی، علاوه بر آلوایمونیزاسیون علیه آنتیژنهای گلبول قرمز، آلوایمونیزاسیون علیه آنتیژنهای اختصاصی پلاکت HPAs و HLA-I هم به دلیل مقادیر مختصر پلاکت و گلبول سفید موجود در کیسههای خون متراکم روی میدهد. در مطالعه شایگان که در سال 2004 بر روی 82 بیمار هماتوانکولوژی با روش فلوسیتومتری صورت گرفت، 2/53% از بیماران دارای آنتیبادی ضد HLA-1 و 9/43% دارای آنتیبادی ضد HPA بودند که همانند مطالعه ما نشان از وفور بالای آلوایمیونیزاسیون پلاکتی در این بیماران دارد(4). در مطالعه فریرا از برزیل در سال 2011 در 16 بیمار هماتوانکولوژی بالاتر از 18 سال (شامل 9 زن و 7 مرد)، آنتیبادیهای ضد پلاکتی را به روش PIFT و آنتیبادیهای HLA-I را به روش پانل راکتیو با کیت آماده به روش فلوسیتومتری بررسی کردند. 5 بیمار مبتلا به AML ، 2 نفر مبتلا به ALL ، 4 نفر مبتلا به هوچکین و 2 نفر نیز مبتلا به CLL بودند که 11 نفرشان سابقه تزریق خون و فرآوردههای آن را داشتند. آنها دریافتند 9 بیمار (56%) دارای آلوآنتیبادی بودند. 8 نفر(50%) از بیماران PIFT مثبت شده که 3 نفرشان(19%) نیز پانل راکتیو مثبت شدند. اما فقط 3 نفر از 9 بیماری که دارای آلوآنتیبادی بودند(30%)، مقاومت پلاکتی داشتند و 6 نفر از افراد آلوایمیونیزه(70%) فاقد مقاومت پلاکتی بودند(21). به عبارتی حضور آنتیبادیهای پلاکتی الزاماً به معنای مقاومت پلاکتی نمیباشد زیرا این آنتیبادیها در 30% موارد در غیاب علایم بالینی مقاومت پلاکتی، در بیماران وجود دارند(22). یافتههای این مطالعه با یافتههای مطالعه حاضر که در 9 بیمار از 30 بیمار هماتوانکولوژی(30%) که فاقد مقاومت پلاکتی بودند، آنتیبادیهای پلاکتی را پیدا کردند، مشابهت داشت. در مطالعه کومار در سال 2014 بر روی 80 بیمار مبتلا به تالاسمی ماژور با تزریق خون مکرر، آنتیبادیهای ضد HPAs و HLA به روش الایزا بررسی شدند و مشخص شد که آلوایمونیزاسیون علیه HPAs در 9 بیمار (25/11%) و علیه HLA-I در23 بیمار(30 %) روی داده است و 59% بیماران فاقد آلوایمونیزاسیون بودند(5). در مطالعه حاضر نیز در 1(3/3%) بیمار تالاسمی ماژور، علیرغم عدم دریافت فرآورده پلاکتی، آنتیبادی ضد HPA ردیابی شد. توجیه این موارد آلوایمونیزاسیون نیز احتمالاً این است که متعاقب تزریق گلبول قرمز متراکم در بیماران تالاسمی علاوه بر آلوایمونیزاسیون علیه آنتیژنهای گلبول قرمز، آلوایمونیزاسیون علیه آنتیژنهای اختصاصی پلاکت HPAs و HLA-1 هم به دلیل مقادیر مختصر پلاکت و گلبول سفید موجود در کیسههای خون متراکم روی میدهد. در مطالعه کومار، بیشترین وفور آنتیبادیها مربوط به آنتیبادیهای علیه HPA-1b -2b , -5bبوده است(5). از سوی دیگر آنتیژنهای گروه فرعی(Bg antigen) Bennet-Goodspeed در سطح گلبولهای قرمز، از نظر ساختاری با HLA-1 شباهت دارند، لذا خود گلبول قرمز میتواند متهم اولیه برای آلوایمونیزاسیون علیه این آنتیژنها محسوب شود. این آنتیبادیها با کاهش بقای گلبولهای قرمز و همولیز گلبولهای تزریقی، میتوانند واکنشهای همولیتیک تأخیری را ایجاد نمایند(23). در مطالعهای که تازاری در سال2008 انجام داد و حضور آنتیبادیهای ضد HPAs را در 10 بیمار مبتلا به تالاسمی ماژور به روش(monoclonal antibody immobilized platelet antigen ) MAIPA بررسی کرد، حضور آنتیبادی بر ضد آللهای a و b مربوط به HPA-2 در 2 بیمار تالاسمی مشخص شد که نتیجه از لحاظ ردیابی آنتیبادیها با نتایج مطالعه حاضر دارای مشابهت است. فرضیه احتمالی دیگری که برای تولید آنتیبادی در مطالعه تازاری مطرح شده آن است که HPA-2 (که بر روی CD2 قرار دارد) در این گروه بیماران احتمالاً ایمونوژنتر از HPA-1,-3 (که بر روی کمپلکس CD41/61 قرار دارد) میباشد(23). نتیجهگیری در مقایسه وفور آللی کل بیماران در مطالعه حاضر با محدودههای وفور آللهای آنتیژنهای پلاکتی در جمعیتهای مختلف اهداکنندگان در جهان، مشخص شد که فراوانی به دست آمده در کل بیماران برای آلل a مربوط به HPA-2, -15 اندکی کمتر از محدوده فوق و وفور آللHLA-15b اندکی بیشتر از محدوده فوق است اما این اختلافات معنادار نیستند. با توجه به فراوانی 100 درصدی آللHPA-4a و فقدان آلل HPA-4b و عدم مشاهده ژنوتیپ هموزیگوت b/b آللهای HPA-1/-2/-5 در بیماران این مطالعه، احتمال وقوع آلوایمیونیزاسیون پلاکتی ناشی از آنتیبادیهای ضد این آنتیژنها در بیماران با تزریق خون مکرر کمتر است. البته انجـام مطالعههـای بیشتـر بـا حجـم نمونـه بیشتر بر روی فراوانی این آنتیژنها ضروری به نظر میرسد. تشکر و قدردانی این مقاله حاصل پایـاننامـه دانشـجویی مصـوب مرکز تحقیقات انتقال خون، مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ایران در مقطع کارشناسی ارشد و با کد اخلاق IR.TMI.REC.1397.024 مصوب کمیته اخلاق در پژوهش مؤسسه و بخشی از یافتههای طرح پژوهشی "بررسی آنتیژنها و آنتیبادیهای پلاکتی در بیماران مبتلا
به مقاومت پلاکتی و بیماران با تزریق مکرر خون و فرآوردهها" میباشد. بدینوسیله از آقای دکتر اسمردیس حاجتی مسئول محترم بخش فلوسیتومتری به دلیل کمکهای بیدریغشان در انجام و تنظیم و خوانش نتایج فلوسیتومتری و خانم دکتر آزیتا آذر کیوان و دکتر سعید محمدی و خانم سلطانآبادی که در جمعآوری نمونههای مورد نیاز این پژوهش همکاری صمیمانهای داشتند، تشکر و قدردانی میگردد.
Ebrahinzadeh E, Alaei M, Samiee S, Shaiegan M. Platelet antigens and antibodies in multitransfused patients. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2020; 17 (4) :294-307 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1376-fa.html
ابراهیم زاده الناز، علایی مستانه، سمیعی شهرام، شایگان مژگان. بررسی آنتیژنها و آنتیبادیهای پلاکتی در بیماران با تزریق خون مکرر. فصلنامه پژوهشی خون. 1399; 17 (4) :294-307