جلد 17، شماره 4 - ( زمستان 1399 )
جلد 17 شماره 4 صفحات 275-270 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Ghanbari Matlob M, Sharifi Z. Hepatitis B virus genotyping in asymptomatic HBV blood donors in Tehran. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2020; 17 (4) :270-275
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1349-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1349-fa.html
قنبری مطلوب مریم، شریفی زهره. تعیین ژنوتیپ ویروس هپاتیت B در اهداکنندگان خون مبتلا به هپاتیت B فاقد علائم در شهر تهران در سال 1398-1397. فصلنامه پژوهشی خون. 1399; 17 (4) :270-275
استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
متن کامل [PDF 404 kb]
(959 دریافت)
| چکیده (HTML) (2002 مشاهده)
مقدمه
هپاتیت B یکی از شایع‌ترین عفونت‌های ویروسی در انسان است و عامل یکی از شدیدترین عفونت‌های ویروسی کبدی در جهان می‌باشد. این ویروس عامل اصلی سرطان کبد بوده و به عنوان دهمین عامل مرگ و میر در جهان اعلام شده است. در حال حاضر این بیماری به عنوان یک معضل بهداشتی در جهان تلقی می‌شود. این بیماری بسیار مسری است و به طور عمده از طریق انتقال خون، روش‌های تزریق ناامن، تماس جنسی و انتقال مادر به کودک منتقل می‌شود(1). عفونت با هپاتیت B می‌تواند با نتایج بالینی متفاوتی از حامل بدون علامت گرفته تا سیروز کبدی و سرطان کبد(HCC) همراه باشد. به طور متوسط حدود 25 درصد از افراد مبتلا به عفونت هپاتیت B مزمن که تحت درمان قرار نمی‌گیرند، به خاطر مشکلات ناشی از سیروز کبدی یا هپاتوسلولار کارسینوما جان خود را از دست می‌دهند(2). ژنوم ویروس HBV دارای چهار قالب خوانش باز(ORF : Open reading frame)، شامل preS-S ، precore-core ، pol و x که دارای همپوشانی هستند و در مجموع ۷ پلی‌پپتید را کد می‌کنند، می‌باشد. preS-S از سه ناحیه preS2, preS1 وs تشکیل شده که پروتئین‌های پوشش ساختاری ویروس به نام‌های M ,L و S را کد می‌کنند. به طور خاص، مناطق preS1 و preS2 متغیرترین توالی ژنوم ویروسی به نظر می‌رسند. جهش‌های نقطه‌ای، حذف و اضافه در ژن‌های preS ویروس هپاتیت B در میان حامل‌های غیر فعال شناسایی شده‌اند. ناحیه preS با پلیمراز ویروس دارای همپوشانی است و موتاسیون‌هایی که در preS اتفاق می‌افتد، می‌تواند در فعالیت آنزیم پلیمراز تاثیر بگذارد(3).
نتیجه عفونت HBVبه نحوه انتقال، عوامل ژنتیکی میزبان، ژنوتیپ ویروسی و جهش‌های سازگار و هم‌چنین عوامل محیطی وابسته است. چندین مطالعه اپیدمیولوژی مولکولی ارتباط بین ژنوتیپ‌های HBV و نتایج مختلف اپیدمیولوژیکی، ویروسی و بالینی عفونت را گزارش کرده‌اند(4). HBV را می‌توان در حداقل ده ژنوتیپ طبقه‌بندی کرد، با نام‌های A–J و چهار زیرگروه اصلی ayw، ayr ، adw و adr که مربوط به توزیع جغرافیایی است. ژنوتیپ غالب HBV در بین بیماران مبتلا به عفونت HBV در آمریکای شمالی، شمال غربی اروپا و آفریقا A است، در حالی که ژنوتیپ B و C غالباً در چین و ژاپن یافت می‌شود. ژنوتیپ D مشهورترین ژنوتیپی است که به طور گسترده به ویژه در کشورهای مدیترانه، خاورمیانه و جنوب آسیا توزیع می‌شود(5). ژنوتیپ C در بیماران سیروزی شایع است. ژنوتیپ A اغلب منجر به مزمن شدن بیماری می‌شود و ژنوتیپ D معمولاً در مصرف‌کنندگان مواد مخدر تزریقی شایع است. ژنوتیپ C پاسخ به درمان کمتری به داروهای ضد ویروسی نشان می‌دهد. به نظر می‌رسد تنوع ژنوتیپی ویروس هپاتیت B بر الگوهای بالینی متفاوت از عفونت، شدت بیماری، پیشرفت بیماری و پاسخ به درمان مؤثر بوده و آگاهی از توزیع ژنوتیپ‌های HBV از اهمیت بالایی در برنامه واکسیناسیون و درمان‌های ضد ویروسی، تشخیص و پیشگیری از بیماری برخوردار می‌باشد(7، 6). برای تعیین ژنوتیپ‌های ویروس هپاتیت B از روش‌های مختلفی استفاده می‌شود مانند توالی‌یابی،PCR RFLP و PCR Probe-Assay با استفاده از آغازگرهای اختصاصی که در حال حاضر تعیین توالی، دقیق ترین روش می‌باشد. هدف از این مطالعه، تعیین ژنوتیپ ویروس هپاتیت B در اهداکنندگان مبتلا به هپاتیت B بود.
مواد و روش‌ها
مطالعه انجام گرفته یک مطالعه مقطعی بود که در آزمایشگاه ویروس‌شناسی مرکز رشد سازمان انتقال خون تهران در سال 1398-۱۳۹۷ صورت گرفت. در این مطالعه از نمونه‌های خونی که جهت انجام آزمایش‌های غربالگری اهدای خون در لوله‌های حاوی EDTA از افراد دریافت شده بود، استفاده شد. از تمامی شرکت‌کنندگان در این مطالعه رضایت‌نامه کتبی گرفته شد. نمونه‌های مورد استفاده همگی HBsAg مثبت و به صورت تصادفی ساده جهت مطالعه انتخاب شدند. پس از جداسازی بافی‌کوت و پلاسما، نمونه‌های سرم در دمای ۷۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.
۲۰ نمونه از اهداکنندگان خون پایگاه انتقال خون تهران که از لحاظ سرولوژی HBsAg مثبت بودند، جهت
استخراج DNA ویروسی استفاده شدند.
پس از استخراج DNA ویروسی به منظور تولید مقدار زیادی از ژنوم ویروس، از روش Nested-PCR استفاده شد. جهت انجام PCR مراحل اول و دوم به ترتیب از دو جفت آغازگر S out و S in استفاده شد(جدول 1).
واکنش PCR در حجم نهایی 25میکرولیتر صورت گرفت. به منظور انجام PCR ، مواد مورد نیاز در میکروتیوپ‌های استریل mL 2/0 ریخته شد و در دستگاه ترمال سایکلر قرار گرفت(جدول 2). پس از اتمامPCR اول، 5/1 میکرولیتر از محصول آن به عنوان الگو جهت انجام PCR دوم استفاده شد.
چرخه دمایی در مرحله اول PCR شامل دناتوراسیون اولیه در دمای ۹۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه بود. سپس واکنش طی ۳۵ چرخه شامل دناتوراسیون به مدت ۴۵ ٍثانیه در دمای ۹۴ درجه سانتی‌گراد، اتصال آغازگرها به مدت ۳۵ ثانیه در دمای ۶۳ درجه سانتی‌گراد، طویل شدن به مدت ۵۵ ثانیه در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد و در نهایت طویل شدن رشته ساخته شده به مدت ۵ دقیقه در ۷۲ درجه سانتی‌گراد ادامه یافت.
چرخه دوم در مرحله دوم Nested-PCR با همان چرخه دمایی مرحله اول انجام گرفت. پس از اتمام PCR مرحله دوم محصول مورد نظر بر روی ژل آگارز 5/1% الکتروفورز گردید و پس از اطمینان از تکثیر صحیح قطعه مورد نظر، محصول PCR جهت تعیین توالی ارسال شد. جهت تعیین موتاسیون‌های ویروس، فایل‌های توالی‌یابی توسط نرم‌افزارهایChromas ،DNA Baser ، NCBI BLAST و سرور آنلاین Genafor مورد بررسی قرار گرفت.
جدول 2: مواد مورد نیاز جهت انجام مرحله اول Nested-PCR با حجم نهایی µL 25
یافته‌ها
جمعیت مورد مطالعه شامل ۱۸ نفر مرد(90%) و 2 نفر زن(10%) بود که همگی در محدوده سنی 7 ± 5/36 سال قرار داشتند و از نظر آنتی‌ژن سطحی ویروس، HBsAg مثبت بودند. با استفاده از آغازگرهای اختصاصی بر روی ژن pres آزمایش Nested-PCR بر روی آن‌ها انجام شد. محصول نهایی Nested-PCRبا طول قطعه 531 جفت باز بود و سپس تعیین توالی صورت گرفت(شکل‌های 1 و 2).
پس از آنالیز توالی‌ها توسط نرم‌افزار، تمامی ۲۰ ایزوله با استفاده از نرم‌افزار BLAST در بانـک ژن مـورد بــررسی قرار گرفتند. با استفاده از بیشترین امتیاز بر اساس جفت شدن(matching) بازها، تـوالی ایزولـه‌‌هـای HBV اهداکنندگان با ایزوله‌هـایی از کشـورهای بـلاروس، قزاقستان، ازبکستان، هند و چـین بـه طـور نزدیکـی یعنـی حدود 88%-87% از نظر توالی نوکلئوتیدها شباهت داشـتند و در گروه ژنوتیپ D ، ساپ‌ژنوتیپ D1 قرار گرفتند.
شکل 1 : الکتروفورز محصول نهایی Nested-PCRژن pres ویروس هپاتیت B با استفاده از آغازگرهای اختصاصی که طول قطعه محصول PCR 531 جفت باز بود.
شکل 2: کروماتوگرام قسمتی از محصول PCR ژن pres ویروس هپاتیت B که تعیین توالی شده است.
بحث
تمامی نمونه‌های مورد بررسی در این مطالعه، دارای ژنوتیپ D و ساپ ژنوتیپ D1 بودند. در مطالعه‌ای که توسط نوده و همکارانش از ژنوتیپ HBV در مشهد در سال ۲۰۱۸ صورت گرفت نیز، تنها ژنوتیپ گزارش شده در این منطقه ژنوتیپ D بود که با نتایج ما هم راستا بود(5). در مطالعه دیگری که خیرآبادی و همکارانش در سال ۲۰۱۷ در بندرعباس انجام دادند، ژنوتیپ گزارش شده از HBV ژنوتیپ D و ساب ژنوتیپ D1 بود که با نتایج به دست آمده از مطالعه ما همسو می‌باشد(8). در مطالعه‌ای که پورکریم و همکارانش در سال ۲۰۱۴ بر روی اهداکنندگان مبتلا به هپاتیت B فاقد علائم در شهر تهران انجام دادند، ژنوتیپ D تنها ژنوتیپ شایع در گروه مورد مطالعه گزارش شد که با نتایج مطالعه ما، هم راستا می‌باشد(9).
ژنوتیپ ویروس هپاتیت B ، پراکندگی خاص جغرافیایی در مناطق مختلف دنیا و حتـی در یک ناحیه دارد که ابزار بسیار با ارزشـی بـرای بررسـی الگوهای انتقال این ویروس با روش‌هـای مولکـولی اسـت. مطالعه ساختار و کارکردهـای مختلـف بـین ژنوتیـپ‌هـای مختلف HBV در مورد هر یک از ژنوتیپ‌ها، بررسی شدت بیماری ایجاد شده، عوارض بیماری، پاسخ به درمان و پاسخ به واکسن را آسان‌تر می‌نماید و در کنترل بیماری می‌تواند کمک مؤثری باشد(10). توزیع جهانی خاصی از ژنوتیپ‌های HBV با حالت‌های مختلف انتقال همراه است برای مثال در ژنوتیپ C و B که شیوع بیشتری در کشورهای آسیایی دارند، انتقال مادر به کودک نقش مهمی در پراکندگی HBV دارد در حالی که سایر ژنوتیپ‌ها در مناطقی مشاهده می‌شوند که انتقال از طریق ارتباط جنسی و انتقال خون مسیر شایع انتقال عفونت هستند(11). نمای آسیب شناسی بالینی و نتیجه عفونت مزمن با ویروس هپاتیت B در ژنوتیپ‌های مختلف متفاوت است. از طرفـی گـزارش مـی شـود نوع ژنوتیپ‌ها در پیامد بالینی آن‌ها مهم است و می‌تـوان از این قبیل موارد، به مثال‌هایی مانند پاسخ بـه درمـان و سـیر بیماری به طرف مزمن شـدن اشـاره کـرد(12). تعیین ژنوتیپ، یک شاخص ژنتیکی برای ژنوم بوده که ژن‌ها بر پایه حذف شدن، اضافه شدن و جانشینی نوکلئوتیدها طبقه‌بندی می‌شوند. این اطلاعات ژنوتیپی، گونه‌های ویژه ویروسی و رفتارهای مولکولی گونه را تعیین می‌نماید و برای نتایج کلینیکی مفید و سودمند می‌باشد(13).
بانک‌های اطلاعاتی کافی از اپیدمیولوژی مولکولی HBV برای پیشگیری از عفونت و برنامه‌های درمانی بسیار مهم هستند. از یافته‌های این مطالعه می‌توان جهت تهیه کیت‌های تشخیصی و بهبود برنامه‌های غربالگری در کشور استفاده کرد. از آن جایی که نوع ژنوتیپ می‌تواند با نتایج کلینیکی متفاوتی همراه باشد، تعیین نوع ژنوتیپ ویروس می‌تواند به عنوان بیومارکر ویروسی جهت پیش‌بینی روند بیماری مورد استفاده قرار گیرد البته تعداد نمونه‌های مورد بررسی در مطالعه ما کم بوده و تنها محدود به شهر تهران می‌باشد. بدیهی است که برای به دست آوردن نتایج دقیق‌تر لازم است از جامعه آماری بزرگتری در مناطق مختلفی از کشور استفاده کرد.
نتیجه‌گیری
ژنوتیـپ تعییـن شـده در مطالعـه در تمامـی ایـزوله‌ها
ژنوتیپ D تعیین شد. با توجه به این که نوع ژنوتیپ ویروس و موتاسیون‌های رخ داده در ژنوم آن می‌توانند در نتایج بالینی و انتخاب نوع روش درمان مؤثر باشند، بنابراین نتایج این گونه مطالعه‌ها جهت تعیین ژنوتیپ شایع ویروس در جامعه ارزشمند است. به علاوه جهت تشـخیص ایمونولوژیکی و ژنتیکی ویروس هپاتیت B به منظـور تهیـه کیت‌های تشخیصی ویـروس هپاتیـت B ، هـم چنین تهیـه پانل‌های کنترل کیفی جهت ارزیابی روش‌هـای تشخیصـی ویروس، می‌توان از نتایج این مطالعه‌ها استفــاده نمود.
تشکر و قدردانی
نتایج این مطالعه از پایان‌نامه مصوب در مرکز تحقیقات انتقال خون مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ایران در مقطع کارشناسی ارشد پس از تأیید کمیته اخلاق به شماره IR.TMI.REC.1397.039 مؤسسه حاصل شده است. در نهایت از خانم پاز کارشناس آزمایشگاه ویروس‌شناسی و پرسنل پایگاه انتقال خون تهران جهـت کمـک در تهیـه نمونه‌ها تشکر به عمل می‌آید.
متن کامل: (2090 مشاهده)
تعیین ژنوتیپ ویروس هپاتیت B در اهداکنندگان خون مبتلا به هپاتیت B فاقد علائم
در شهر تهران در سال 1398-1397
مریم قنبری مطلوب1، زهره شریفی2
چکیده
سابقه و هدف
عفونت هپاتیت B ، یکی از عمده‌ترین بیماری‌های منتقل شونده از راه انتقال خون است. عفونت با این ویروس منجر به آسیب‌های گسترده کبدی می‌شود. تاکنون ۱۰ ژنوتیپ برای هپاتیت B تشخیص داده شده است. هدف از این مطالعه، تعیین ژنوتیپ ویروس هپاتیت B با روش تعیین توالی در اهداکنندگان خون بدون علامت در شهر تهران سال ۹۸-۹۷ بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه مقطعی، سرم خون ۲۰ نفر از اهداکنندگان خون که از نظر آزمایش آنتی‌ژن سطحی ویروس هپاتیت B با روش الایزا مثبت تشخیص داده شده بودند، مورد آزمایش قرار گرفتند. پس از استخراج DNA ویروسی، توالی ژن pres به وسیله روش Nested-PCR تکثیر و ژنوتیپ ویروس با روش تعیین توالی تعیین شد. توالی به دست آمده به وسیله نرم‌افزار Clustal w با توالی‌های رفرانس مرتب شد.
یافته‌ها
نمونه‌ها پس از انجام Nested-PCR تعیین توالی شدند. ژنوتیپ ویروس هپاتیت B در تمام ۲۰ نمونه اهداکننده خون مبتلا به هپاتیت B ، 100% ژنوتیپD تعیین گردید.
نتیجه گیری
شیوع ژنوتیپ D در افراد مورد مطالعه 100% بود. از این نتیجه می‌توان در تهیه کیت‌های تشخیصی هپاتیت B استفاده کرد. هم‌چنین شناسایی ژنوتیپ‌ها می‌تواند به پزشکان کمک کند که بیماران با خطر بیشتر پیشرفت بیماری را شناسایی نموده و استراتژی‌های درمانی بهتری را به کار گیرند.
کلمات کلیدی: ویروس هپاتیت B ، ژنوتیپ، اهداکنندگان خون
تاریخ دریافت: 23/2/99
تاریخ پذیرش: 22/4/99
1- کارشناس ارشد زیست فناوری پزشکی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: PhD ویروس‌شناسی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
در شهر تهران در سال 1398-1397
مریم قنبری مطلوب1، زهره شریفی2
چکیده
سابقه و هدف
عفونت هپاتیت B ، یکی از عمده‌ترین بیماری‌های منتقل شونده از راه انتقال خون است. عفونت با این ویروس منجر به آسیب‌های گسترده کبدی می‌شود. تاکنون ۱۰ ژنوتیپ برای هپاتیت B تشخیص داده شده است. هدف از این مطالعه، تعیین ژنوتیپ ویروس هپاتیت B با روش تعیین توالی در اهداکنندگان خون بدون علامت در شهر تهران سال ۹۸-۹۷ بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه مقطعی، سرم خون ۲۰ نفر از اهداکنندگان خون که از نظر آزمایش آنتی‌ژن سطحی ویروس هپاتیت B با روش الایزا مثبت تشخیص داده شده بودند، مورد آزمایش قرار گرفتند. پس از استخراج DNA ویروسی، توالی ژن pres به وسیله روش Nested-PCR تکثیر و ژنوتیپ ویروس با روش تعیین توالی تعیین شد. توالی به دست آمده به وسیله نرم‌افزار Clustal w با توالی‌های رفرانس مرتب شد.
یافته‌ها
نمونه‌ها پس از انجام Nested-PCR تعیین توالی شدند. ژنوتیپ ویروس هپاتیت B در تمام ۲۰ نمونه اهداکننده خون مبتلا به هپاتیت B ، 100% ژنوتیپD تعیین گردید.
نتیجه گیری
شیوع ژنوتیپ D در افراد مورد مطالعه 100% بود. از این نتیجه می‌توان در تهیه کیت‌های تشخیصی هپاتیت B استفاده کرد. هم‌چنین شناسایی ژنوتیپ‌ها می‌تواند به پزشکان کمک کند که بیماران با خطر بیشتر پیشرفت بیماری را شناسایی نموده و استراتژی‌های درمانی بهتری را به کار گیرند.
کلمات کلیدی: ویروس هپاتیت B ، ژنوتیپ، اهداکنندگان خون
تاریخ دریافت: 23/2/99
تاریخ پذیرش: 22/4/99
1- کارشناس ارشد زیست فناوری پزشکی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: PhD ویروس‌شناسی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه
هپاتیت B یکی از شایع‌ترین عفونت‌های ویروسی در انسان است و عامل یکی از شدیدترین عفونت‌های ویروسی کبدی در جهان می‌باشد. این ویروس عامل اصلی سرطان کبد بوده و به عنوان دهمین عامل مرگ و میر در جهان اعلام شده است. در حال حاضر این بیماری به عنوان یک معضل بهداشتی در جهان تلقی می‌شود. این بیماری بسیار مسری است و به طور عمده از طریق انتقال خون، روش‌های تزریق ناامن، تماس جنسی و انتقال مادر به کودک منتقل می‌شود(1). عفونت با هپاتیت B می‌تواند با نتایج بالینی متفاوتی از حامل بدون علامت گرفته تا سیروز کبدی و سرطان کبد(HCC) همراه باشد. به طور متوسط حدود 25 درصد از افراد مبتلا به عفونت هپاتیت B مزمن که تحت درمان قرار نمی‌گیرند، به خاطر مشکلات ناشی از سیروز کبدی یا هپاتوسلولار کارسینوما جان خود را از دست می‌دهند(2). ژنوم ویروس HBV دارای چهار قالب خوانش باز(ORF : Open reading frame)، شامل preS-S ، precore-core ، pol و x که دارای همپوشانی هستند و در مجموع ۷ پلی‌پپتید را کد می‌کنند، می‌باشد. preS-S از سه ناحیه preS2, preS1 وs تشکیل شده که پروتئین‌های پوشش ساختاری ویروس به نام‌های M ,L و S را کد می‌کنند. به طور خاص، مناطق preS1 و preS2 متغیرترین توالی ژنوم ویروسی به نظر می‌رسند. جهش‌های نقطه‌ای، حذف و اضافه در ژن‌های preS ویروس هپاتیت B در میان حامل‌های غیر فعال شناسایی شده‌اند. ناحیه preS با پلیمراز ویروس دارای همپوشانی است و موتاسیون‌هایی که در preS اتفاق می‌افتد، می‌تواند در فعالیت آنزیم پلیمراز تاثیر بگذارد(3).
نتیجه عفونت HBVبه نحوه انتقال، عوامل ژنتیکی میزبان، ژنوتیپ ویروسی و جهش‌های سازگار و هم‌چنین عوامل محیطی وابسته است. چندین مطالعه اپیدمیولوژی مولکولی ارتباط بین ژنوتیپ‌های HBV و نتایج مختلف اپیدمیولوژیکی، ویروسی و بالینی عفونت را گزارش کرده‌اند(4). HBV را می‌توان در حداقل ده ژنوتیپ طبقه‌بندی کرد، با نام‌های A–J و چهار زیرگروه اصلی ayw، ayr ، adw و adr که مربوط به توزیع جغرافیایی است. ژنوتیپ غالب HBV در بین بیماران مبتلا به عفونت HBV در آمریکای شمالی، شمال غربی اروپا و آفریقا A است، در حالی که ژنوتیپ B و C غالباً در چین و ژاپن یافت می‌شود. ژنوتیپ D مشهورترین ژنوتیپی است که به طور گسترده به ویژه در کشورهای مدیترانه، خاورمیانه و جنوب آسیا توزیع می‌شود(5). ژنوتیپ C در بیماران سیروزی شایع است. ژنوتیپ A اغلب منجر به مزمن شدن بیماری می‌شود و ژنوتیپ D معمولاً در مصرف‌کنندگان مواد مخدر تزریقی شایع است. ژنوتیپ C پاسخ به درمان کمتری به داروهای ضد ویروسی نشان می‌دهد. به نظر می‌رسد تنوع ژنوتیپی ویروس هپاتیت B بر الگوهای بالینی متفاوت از عفونت، شدت بیماری، پیشرفت بیماری و پاسخ به درمان مؤثر بوده و آگاهی از توزیع ژنوتیپ‌های HBV از اهمیت بالایی در برنامه واکسیناسیون و درمان‌های ضد ویروسی، تشخیص و پیشگیری از بیماری برخوردار می‌باشد(7، 6). برای تعیین ژنوتیپ‌های ویروس هپاتیت B از روش‌های مختلفی استفاده می‌شود مانند توالی‌یابی،PCR RFLP و PCR Probe-Assay با استفاده از آغازگرهای اختصاصی که در حال حاضر تعیین توالی، دقیق ترین روش می‌باشد. هدف از این مطالعه، تعیین ژنوتیپ ویروس هپاتیت B در اهداکنندگان مبتلا به هپاتیت B بود.
مواد و روش‌ها
مطالعه انجام گرفته یک مطالعه مقطعی بود که در آزمایشگاه ویروس‌شناسی مرکز رشد سازمان انتقال خون تهران در سال 1398-۱۳۹۷ صورت گرفت. در این مطالعه از نمونه‌های خونی که جهت انجام آزمایش‌های غربالگری اهدای خون در لوله‌های حاوی EDTA از افراد دریافت شده بود، استفاده شد. از تمامی شرکت‌کنندگان در این مطالعه رضایت‌نامه کتبی گرفته شد. نمونه‌های مورد استفاده همگی HBsAg مثبت و به صورت تصادفی ساده جهت مطالعه انتخاب شدند. پس از جداسازی بافی‌کوت و پلاسما، نمونه‌های سرم در دمای ۷۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.
۲۰ نمونه از اهداکنندگان خون پایگاه انتقال خون تهران که از لحاظ سرولوژی HBsAg مثبت بودند، جهت
جدول 1: لیست آغازگرهای مورد استفاده در روش Nested-PCR
استخراج DNA ویروسی استفاده شدند.
پس از استخراج DNA ویروسی به منظور تولید مقدار زیادی از ژنوم ویروس، از روش Nested-PCR استفاده شد. جهت انجام PCR مراحل اول و دوم به ترتیب از دو جفت آغازگر S out و S in استفاده شد(جدول 1).
واکنش PCR در حجم نهایی 25میکرولیتر صورت گرفت. به منظور انجام PCR ، مواد مورد نیاز در میکروتیوپ‌های استریل mL 2/0 ریخته شد و در دستگاه ترمال سایکلر قرار گرفت(جدول 2). پس از اتمامPCR اول، 5/1 میکرولیتر از محصول آن به عنوان الگو جهت انجام PCR دوم استفاده شد.
چرخه دمایی در مرحله اول PCR شامل دناتوراسیون اولیه در دمای ۹۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه بود. سپس واکنش طی ۳۵ چرخه شامل دناتوراسیون به مدت ۴۵ ٍثانیه در دمای ۹۴ درجه سانتی‌گراد، اتصال آغازگرها به مدت ۳۵ ثانیه در دمای ۶۳ درجه سانتی‌گراد، طویل شدن به مدت ۵۵ ثانیه در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد و در نهایت طویل شدن رشته ساخته شده به مدت ۵ دقیقه در ۷۲ درجه سانتی‌گراد ادامه یافت.
چرخه دوم در مرحله دوم Nested-PCR با همان چرخه دمایی مرحله اول انجام گرفت. پس از اتمام PCR مرحله دوم محصول مورد نظر بر روی ژل آگارز 5/1% الکتروفورز گردید و پس از اطمینان از تکثیر صحیح قطعه مورد نظر، محصول PCR جهت تعیین توالی ارسال شد. جهت تعیین موتاسیون‌های ویروس، فایل‌های توالی‌یابی توسط نرم‌افزارهایChromas ،DNA Baser ، NCBI BLAST و سرور آنلاین Genafor مورد بررسی قرار گرفت.
جدول 2: مواد مورد نیاز جهت انجام مرحله اول Nested-PCR با حجم نهایی µL 25
یافته‌ها
جمعیت مورد مطالعه شامل ۱۸ نفر مرد(90%) و 2 نفر زن(10%) بود که همگی در محدوده سنی 7 ± 5/36 سال قرار داشتند و از نظر آنتی‌ژن سطحی ویروس، HBsAg مثبت بودند. با استفاده از آغازگرهای اختصاصی بر روی ژن pres آزمایش Nested-PCR بر روی آن‌ها انجام شد. محصول نهایی Nested-PCRبا طول قطعه 531 جفت باز بود و سپس تعیین توالی صورت گرفت(شکل‌های 1 و 2).
پس از آنالیز توالی‌ها توسط نرم‌افزار، تمامی ۲۰ ایزوله با استفاده از نرم‌افزار BLAST در بانـک ژن مـورد بــررسی قرار گرفتند. با استفاده از بیشترین امتیاز بر اساس جفت شدن(matching) بازها، تـوالی ایزولـه‌‌هـای HBV اهداکنندگان با ایزوله‌هـایی از کشـورهای بـلاروس، قزاقستان، ازبکستان، هند و چـین بـه طـور نزدیکـی یعنـی حدود 88%-87% از نظر توالی نوکلئوتیدها شباهت داشـتند و در گروه ژنوتیپ D ، ساپ‌ژنوتیپ D1 قرار گرفتند.
شکل 1 : الکتروفورز محصول نهایی Nested-PCRژن pres ویروس هپاتیت B با استفاده از آغازگرهای اختصاصی که طول قطعه محصول PCR 531 جفت باز بود.
شکل 2: کروماتوگرام قسمتی از محصول PCR ژن pres ویروس هپاتیت B که تعیین توالی شده است.
بحث
تمامی نمونه‌های مورد بررسی در این مطالعه، دارای ژنوتیپ D و ساپ ژنوتیپ D1 بودند. در مطالعه‌ای که توسط نوده و همکارانش از ژنوتیپ HBV در مشهد در سال ۲۰۱۸ صورت گرفت نیز، تنها ژنوتیپ گزارش شده در این منطقه ژنوتیپ D بود که با نتایج ما هم راستا بود(5). در مطالعه دیگری که خیرآبادی و همکارانش در سال ۲۰۱۷ در بندرعباس انجام دادند، ژنوتیپ گزارش شده از HBV ژنوتیپ D و ساب ژنوتیپ D1 بود که با نتایج به دست آمده از مطالعه ما همسو می‌باشد(8). در مطالعه‌ای که پورکریم و همکارانش در سال ۲۰۱۴ بر روی اهداکنندگان مبتلا به هپاتیت B فاقد علائم در شهر تهران انجام دادند، ژنوتیپ D تنها ژنوتیپ شایع در گروه مورد مطالعه گزارش شد که با نتایج مطالعه ما، هم راستا می‌باشد(9).
ژنوتیپ ویروس هپاتیت B ، پراکندگی خاص جغرافیایی در مناطق مختلف دنیا و حتـی در یک ناحیه دارد که ابزار بسیار با ارزشـی بـرای بررسـی الگوهای انتقال این ویروس با روش‌هـای مولکـولی اسـت. مطالعه ساختار و کارکردهـای مختلـف بـین ژنوتیـپ‌هـای مختلف HBV در مورد هر یک از ژنوتیپ‌ها، بررسی شدت بیماری ایجاد شده، عوارض بیماری، پاسخ به درمان و پاسخ به واکسن را آسان‌تر می‌نماید و در کنترل بیماری می‌تواند کمک مؤثری باشد(10). توزیع جهانی خاصی از ژنوتیپ‌های HBV با حالت‌های مختلف انتقال همراه است برای مثال در ژنوتیپ C و B که شیوع بیشتری در کشورهای آسیایی دارند، انتقال مادر به کودک نقش مهمی در پراکندگی HBV دارد در حالی که سایر ژنوتیپ‌ها در مناطقی مشاهده می‌شوند که انتقال از طریق ارتباط جنسی و انتقال خون مسیر شایع انتقال عفونت هستند(11). نمای آسیب شناسی بالینی و نتیجه عفونت مزمن با ویروس هپاتیت B در ژنوتیپ‌های مختلف متفاوت است. از طرفـی گـزارش مـی شـود نوع ژنوتیپ‌ها در پیامد بالینی آن‌ها مهم است و می‌تـوان از این قبیل موارد، به مثال‌هایی مانند پاسخ بـه درمـان و سـیر بیماری به طرف مزمن شـدن اشـاره کـرد(12). تعیین ژنوتیپ، یک شاخص ژنتیکی برای ژنوم بوده که ژن‌ها بر پایه حذف شدن، اضافه شدن و جانشینی نوکلئوتیدها طبقه‌بندی می‌شوند. این اطلاعات ژنوتیپی، گونه‌های ویژه ویروسی و رفتارهای مولکولی گونه را تعیین می‌نماید و برای نتایج کلینیکی مفید و سودمند می‌باشد(13).
بانک‌های اطلاعاتی کافی از اپیدمیولوژی مولکولی HBV برای پیشگیری از عفونت و برنامه‌های درمانی بسیار مهم هستند. از یافته‌های این مطالعه می‌توان جهت تهیه کیت‌های تشخیصی و بهبود برنامه‌های غربالگری در کشور استفاده کرد. از آن جایی که نوع ژنوتیپ می‌تواند با نتایج کلینیکی متفاوتی همراه باشد، تعیین نوع ژنوتیپ ویروس می‌تواند به عنوان بیومارکر ویروسی جهت پیش‌بینی روند بیماری مورد استفاده قرار گیرد البته تعداد نمونه‌های مورد بررسی در مطالعه ما کم بوده و تنها محدود به شهر تهران می‌باشد. بدیهی است که برای به دست آوردن نتایج دقیق‌تر لازم است از جامعه آماری بزرگتری در مناطق مختلفی از کشور استفاده کرد.
نتیجه‌گیری
ژنوتیـپ تعییـن شـده در مطالعـه در تمامـی ایـزوله‌ها
ژنوتیپ D تعیین شد. با توجه به این که نوع ژنوتیپ ویروس و موتاسیون‌های رخ داده در ژنوم آن می‌توانند در نتایج بالینی و انتخاب نوع روش درمان مؤثر باشند، بنابراین نتایج این گونه مطالعه‌ها جهت تعیین ژنوتیپ شایع ویروس در جامعه ارزشمند است. به علاوه جهت تشـخیص ایمونولوژیکی و ژنتیکی ویروس هپاتیت B به منظـور تهیـه کیت‌های تشخیصی ویـروس هپاتیـت B ، هـم چنین تهیـه پانل‌های کنترل کیفی جهت ارزیابی روش‌هـای تشخیصـی ویروس، می‌توان از نتایج این مطالعه‌ها استفــاده نمود.
تشکر و قدردانی
نتایج این مطالعه از پایان‌نامه مصوب در مرکز تحقیقات انتقال خون مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ایران در مقطع کارشناسی ارشد پس از تأیید کمیته اخلاق به شماره IR.TMI.REC.1397.039 مؤسسه حاصل شده است. در نهایت از خانم پاز کارشناس آزمایشگاه ویروس‌شناسی و پرسنل پایگاه انتقال خون تهران جهـت کمـک در تهیـه نمونه‌ها تشکر به عمل می‌آید.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
