پیشرفت‌ها و چالش‌های موجود در ذخیره‌سازی، پیوند، تکثیر و لانه‌گزینی سلولهای بنیادی خونساز خون بند ناف
وحید نیازی1، سعید حیدری کشل2، معصومه شهبازی3
چکیده سابقه و هدف سلولهای بنیادی خونساز خون بند ناف،دارای توانایی‌های بالقوه زیادی جهت درمان بیماری‌های هماتولوژیکی و غیر هماتولوژیکی می‌باشند. آگاهی از بیولوژی ، خود نوسازی ، لانه‌گزینی ، تکثیر ، ذخیره‌سازی و پیوند سلولهای بنیادی خونساز خون بند ناف، می‌تواند منجر به استفاده بهینه از این سلولها گردد. مواد و روش‌ها در این مطالعه مروری، جهت بررسی پیشرفت‌ها و چالش‌های موجود در بانک‌های خون سلولهای بنیادی بند ناف، روش‌های تکثیر، ذخیره‌سازی، لانه‌گزینی و پیوند با استفاده از کلید واژه‌های خون بند ناف، سلولهای بنیادی خونساز و بانک سلولهای بنیادی به جستجوی منابع در پایگاه اطلاعاتیMed Pubدر بازه زمانی 2000 تا 2020 پرداخته شد. یافته‌ها با گذشت زمان، پیشرفت‌های زیادی در زمینه بیولوژی، تکثیر، ذخیره‌سازی و پیوند سلولهای خونساز بند ناف توسط محققان در سراسر دنیا ایجاد شده است و به موازات آن بانک‌های خون خصوصی و دولتی در سراسر دنیا گسترش و توسعه پیدا کرده‌اند. با وجود این پیشرفت‌ها، هم‌چنان چالش‌هایی جهت استفاده بهینه از این سلولها وجود دارد. نتیجه گیری افزایش آگاهی ما نسبت به دستاورد‌ها و کاستی‌های موجود در زمینه سلولهای بنیادی خونساز خون بند ناف می‌تواند منجر به شکل‌گیری راهکارهای جدید و انجام مطالعه‌های بیشتر جهت استفاده بهینه از سلولهای بنیادی خونساز خون بند ناف گردد. کلمات کلیدی: خون بند ناف، سلول بنیادی خونساز، پیوند
تاریخ دریافت: 11/10/98 تاریخ پذیرش: 29/2 /99
1- دانشجوی دکترای علوم سلولی کاربردی ـ دانشکده فناوری‌های نوین پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران 2- مؤلف مسئول: دکترای پرتئومیکس ـ استادیار گروه مهندسی بافت و علوم سلولی کاربردی ـ دانشکده فناوری‌های نوین پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ولنجک ـ خیابان اعرابی ـ بیمارستان طالقانی ـ دانشکده فناوری نوین پزشکی بخش آموزش ـ ایران ـ کدپستی: 1985711151 3- دانشجوی دکترای خون‌شناسی آزمایشگاهی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه حدود 30 سال از اولین پیوند موفقیت‌آمیز مغزاستخوان(BMT: Bone Marrow Transplantation) با سلولهای بنیادی خونساز خون بند ناف(UCB-HSCs : Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells) در سال 1988 در پسر بچه مبتلا به آنمی فانکونی در پاریس، که پیوندی موفقیت‌آمیز بود، می‌گذرد(2، 1). امروزه می‌دانیم که نمونه خون بند ناف منبعی غنی از سلولهای بنیادی خونساز می‌باشد که جهت درمان بسیاری از بیماری‌ها از جمله لوسمی‌ها، نقص‌های ایمنی، هموگلوبینوپاتی‌ها و بیماری‌های متابولیکی استفاده می‌شود. با این وجود تعداد کم سلولهای بنیادی خونساز و پروژنیتورهای آن‌ها در واحدهای خون بند ناف ذخیره شده، هم‌چنان مهمترین محدودیت جهت استفاده از این واحدها می‌باشد. محققان مختلف در سراسر دنیا به بررسی بیولوژی، روش‌های مختلف جهت تکثیر در ex vivo و یا بهبود لانه‌گزینی HSCs در مغز استخوان جهت غلبه بر محدودیت‌های استفاده از این واحدها پرداخته‌اند(3). از طرفی هم‌زمان با افزایش آگاهی از کاربرد گسترده این سلول ها در زمینه‌های مختلف و شرایط نگهداری آن‌ها از اوایل سال 1990 ، بانک‌هایی جهت ذخیره‌سازی و در اختیار قرار دادن این سلولها ایجاد شدند(4). بانک سلولهای بنیادی نوزادان تازه متولد شده شامل بانک‌های دولتی که واحدهای خون بند ناف را در اختیار گیرندگان غیر خویشاوند قرار داده و بانک سلولهای بنیادی خصوصی، این واحدها را جهت استفاده اهداکننده و یا اقوام درجه اول یا دوم قرار می‌دهد. تخمین زده می‌شود که بیش از 800 هزار واحد خون بند ناف در بانک‌های دولتی و بیش از 5 میلیون واحد در بانک‌های خصوصی ذخیره می‌باشد(5). در این مطالعه، به بررسی پیشرفت‌ها و چالش‌های اخیر در زمینه بیولوژی، ذخیره‌سازی، پیوند، روش‌های تکثیر و لانه‌گزینی UCB-HSCs پرداخته، چرا که آگاهی از این زمینه‌ها می‌تواند به استفاده بهینه از این سلولها کمک کند و زمینه‌ساز انجام مطالعه‌های بیشتر گردد. بیولوژی خون بند ناف: مطالعه‌هـای مختلفـی نشـان داده‌انـد کـــه UCB غنی از HSCs و HPCs (Hematopoietic Stem Cells) می‌باشد و قدرت بازسازی مغز استخوان و توانایی تکثیر طولانی مدت بیشتری نسبت به HSCs مغز استخوان یاخون محیطی بالغین را دارا می‌باشد(8-6). از طرفی تعداد پیشسازهای اولیه‌ای که توانایی تولید کلنی‌های اریتروئیدی و میلوئیدی را دارند، در خون بند ناف نسبت به دو منبع دیگر بیشتر می‌باشد. مطالعه‌ها نشان داده‌اند که توانایی UCB-HSCs برای بازسازی مغز استخوان در افرادی که به شدت رادیوتراپی و شیمی درمانی شده بودند، بسیار بیشتر از HSCs جدا شده از مغز استخوان(BM-HSC) بالغین بوده است(10، 9). هم‌چنین قدرت تکثیر آزمایشگاهی UCB-HSCs بیشتر از BM-HSCs بالغین می‌باشد(10).اگر چه دلایل موارد فوق به خوبی مشخص نشده است اما چندین مکانیسم پیشنهادی وجود دارد(12، 11). UCB-HSCs آنتی‌ژن CD34+ بیشتری نسبت بهBM-HSC بالغین بیان می‌کنند. تلومر که نقش ساعت میتوزی را در سلولها ایفا می‌کند، در UCB-HSCs حدود kb4 طولانی‌تر از BM-HSCs بالغین می‌باشد. UCB-HSCs در مقایسه با BM-HSCs بالغین بسیار سریع‌تر از فاز G0/G1 گذر کرده و وارد چرخه سلولی می‌شوند در نتیجه UCB-HSCs سرعت تقسیم بیشتری داشته و در شرایط محیط کشت یکسان نسبت به BM-HSCs بالغین سرعت تکثیر بالاتری دارند. برخی فاکتورهای خاص مثل NF-kB در UCB-HSCs بیشتر از BM-HSCs بالغین می‌باشد که نشان‌دهنده قدرت بالاتر خودنوسازی در UCB-HSCs است و در پایان UCB-HSCs قدرت پاراکرینی بیشتری داشته و فاکتورهای مختلفی هم‌چون اینترلوکین3 و فاکتور محرک کلونی گرانولوسیتی ـ مونوسیتی(CSF-GM) بیشتری نسبت به BM-HSCs بالغین ترشح می‌کنند. UCB-HSCs و پیشسازهای آن‌ها قادرند به واسطه تحریک توسط سایتوکاین‌های نوترکیب، شلاتور‌های فلز‌ها، دستکاری‌های اپی‌ژنتیکی و فیدرهای مزانشیمی، خودنوسازی انجام دهند (16-13). دستورالعمـل‌هـا و روش‌‌هـای مختلـف آزمـایشگاهـی، تاثیرات متفاوتی بر تکثیر UCB-HSCs و HPCs داشته و منجر به افزایش تکثیرهای متفاوتی خواهند شد(14). خونبند ناف علاوه بر UCB-HSCs، حـاوی سلولهای غیر‌خونسـاز امـا دارای قابلیـت تکثیـر و تمایـز دیگری نیز می‌باشد. این سلولها شامل سلولهای بنیادی مزانشیمی MSC (Mesenchymal Stromal Cell) و سلول بنیادی سوماتیک نا‌‌محدود USSCs (Unrestricted Somatic Stem Cells) می‌باشند. MSCs مارکر‌های ایمیونوفنوتایپی مشابه سلولهای مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوانرا نشان داده و همانند آن‌ها قابلیت تولید سلولهای چربی، غضروف و استخوان را دارا می‌باشند. USSCs نوعی از سلولهای بنیادی می‌باشند که برخی از ویژگی‌های سلولهای بنیادی جنینی را نشان می‌دهند(17). با وجود شباهت‌های فراوان بین MSCs جدا شده از بند ناف و مغز استخوان بالغین، تفاوت‌هایی نیز وجود دارد(18، 17). در ارتباط با USSCs ، برخی مطالعه‌ها نشان داده است که این سلولها قابلیت تولید سلولهای چربی، غضروف، استخوان و هم‌چنین سلولهای خونساز و سلولهای عصبی را دارا می‌باشند(19).
ذخیره و نگهداری UCB-HSCs : UCB-HSCs دارای قابلیت نگهداری در ازت مایع (C°196-( می‌باشند(3). در واقع، پنج پیوند مغز استخوان اولیه که با استفاده از UCB-HSCs خویشاوند انجام شد، همگی با استفاده از نمونه‌هایUCB-HSC نگهداری شده در بانک سلولی انجام گرفت(21، 20، 3، 1). چنانچه واحدهای خون بند ناف به شکل صحیحی پردازش شده باشند، تا 20 سال بدون تغییر قابل نگهداری هستند(22). امروزه بانک‌های خون بند ناف خصوصی و دولتی مختلفی وجود دارد. اولین بانک خون بند ناف در سال 1993 میلادی در نیویورک تأسیس شد. تا به امروز حدود 800 هزار واحد خون بند ناف در مراکز دولتی در 45 کشور و حدود 4 میلیون واحد خون بند ناف خصوصی در 100 کشور نگهداری می‌شود(23). بانک خون بند ناف، دسترسـی سریـع‌تر گیرنده‌هـای UCB-HSC بـه دهنده‌های غیرخویشاوند UCB-HSC را امکان‌پذیر کرده است(24). بانک خون‌های بند ناف دولتی برای تمامی اهداکنندگان در دسترس بوده و بعد از دریافت رضایت‌نامه از والدین، واحدهای خون بند ناف جمع‌آوری می‌شوند. موجودی این بانک‌ها ثبت شده و قابل دسترس برای عموم و ارائه به دهندگان مراقبت‌های بهداشتی می‌باشد. قبل از ثبت، این واحدها از نطر حجم، تعداد سلول و نوع بافت، سابقه سلامتی و وضعیت بیماری‌های عفونی، مورد غربالگری قرار می‌گیرند(25). موضوعات بحث برانگیز در رابطه با بانک‌های خون دولتی شامل گستردگی غربالگری اهداکننده، روش‌های جمع‌آوری، روش‌های پردازش و روش‌های ذوب کردن می‌باشد. نمونه خون می‌تواند از جفت داخل رحم قبل از زایمان، توسط پزشک زایمان یا ماما گرفته شده و یا بعد از زایمان در خارج از رحم توسط پرسنل آموزش دیده جمع‌آوری گردد. روش جمع‌آوری خارج از رحم تکنیکی غیر تهاجمی‌تر و بیشتر قابل کنترل می‌باشد اما پرهزینه‌تر بوده و نیازمند پرسنل آموزش دیده بیشتری است(26). یک مطالعه نشان داد که تفاوتی بین شمارش سلولی و یا شمارش سلولهای CD34+ در دو روش جمع‌آوری وجود ندارد(27). اخیراً نیاز به شست و شوی نمونه خون بند ناف قبل از تزریق، مورد بحث قرار گرفته است. مطالعه‌های ابتدایی گزارش نمودند شست و شوی بعد از ذوب نمونه خون بند ناف بر پایه دکستران آلبومین، برای ادامه حیات سلولهای پروژنیتور خونساز بند ناف و افزایش سرعت در پیوند مهم می‌باشد. با این وجود مطالعه‌های بالینی اخیر نشان داده‌اند رقیق شدن نمونه خون بند ناف بعد از ذوب، بدون شست و شو و حتی تزریق نمونه خون بند ناف ذوب شده به یک اندازه جهت پیوند، قابل اعتماد بوده و فاقد عوارض جانبی می‌باشد(28). در مقابل بانک‌های خون خصوصی نمونه خون بند ناف را جهت پیوند اتولوگ یا آلوژن برای نوزاد و یا اعضای خانواده وی استفاده نموده و برای عموم قابل جستجو و دسترسی نمی‌باشند. جمع‌آوری و ذخیره‌سازی نمونه‌های خون در بانک خون خصوصی بسیار هزینه‌بر است(25). هزینه ذخیره‌سازی خون بند ناف در بانک‌های خصوصی به طور معمول بین 1350 تا 2300 دلار برای جمع‌آوری، پردازش و ذخیره‌سازی اولیه بوده و متعاقب آن نیز بین 100 تا 175 دلار نیز هزینه نگهداری سالانه دریافت می‌شود در مقابل اهدای خون به بانک‌های دولتی دارای هزینه نمی‌باشد(29). مهمترین انتقـاد بـه بانک‌های خون خصوصی این است که احتمالاً هیچ وقت نوزاد به واحد خون ذخیره شده نیاز پیدا نکند و هم‌چنین این واحد خون برای عموم در دسترس نمی‌باشد. این موضوع توسط بالن و همکارانش مورد ارزیابی قرار گرفت و مشخص شد شانس استفاده از واحد خون ذخیره شده برای فرد تا سن 21 سالگی در صورت بروز بیماری قابل درمان با پیوند سلولهای خونساز واحد خون بند ناف خود، 04/0% تا 005/0% می‌باشد(30). جانسون در مطالعه خود نسبت کمتری از افراد را که ممکن است به سلول خونساز بند ناف خواهر یا برادر خود نیاز پیدا کنند، گزارش نمود (به طور مثال 2700/1 برای واحد خون بند ناف خود و 1400/ 1 برای واحد بند ناف برادر یا خواهر خود)(31). هم‌چنین این برآورد احتمالی برای بروز سیستیک فیبروزیس یک در 3000 مورد، اسپینابیفیدا یک در 800 مورد و سندروم داون 1 در 700 مورد در جمعیت عمومی می‌باشد. بنابراین محققان به ارزیابی استفاده از سلولهای خون بند ناف برای اهداف دیگر به غیر از بیماری‌های هماتولوژیکی مانند ترمیم آسیب به قلب در سکته، دیابت ملیتوس، سکته مغزی، ترومای مغز و آسیب نخاعی علاوه بر بدخیمی‌ها ادامه دادند. قابل توجه است که منشأ برخی از لوسمی‌های حاد به سلولهای پره لوسمیکی بر می‌گردند که در نمونه خون بند ناف ذخیره شده نیز یافت شده‌اند. هم‌چنین سلولها از سایر سرطان‌ها نیز ممکن است در نمونه خون بند ناف ذخیره شده یافت شود که این موضوع استفاده از این واحدها را به عنوان منبعی جهت پیوند اتولوگ مورد سؤال قرار می‌دهد. بنابراین کارکنان مراقبت‌های بهداشتی باید در مورد مزیت‌های استفاده از خون بند ناف و معایب آن به والدین توضیحات لازم را ارائه دهند(17).
چالش‌های اقتصادی: علاوه بر مقایسه بیولوژیکی و کلینیکی UCB-HSCs با منابـع مغـز استخوان و خون محیطی، مطالعه‌هایی به منظور ارزیابی هزینه‌های جداسازی و نگهداری منابع مختلف انجام شده است. چگونه BMT با استفاده از UCB-HSCs را مقرون به صرفه‌تر کنیم؟ این سؤال بسیار حائز اهمیت است زیرا به علت هزینه‌های بالای نگهداری و پیوند، کاربرد UCB-HSCs بین سال‌های 2010 تا 2018 حدود 34% کاهش داشته است(33، 32)(نمودار 1). نمودار 1: میزان استفاده از سلولهای بنیادی خونساز از منابع مختلف مغز استخوان، خون محیطی و خون بند ناف بین سال‌های 1980 تا 2016 (17) UCB: Umbilical Cord Blood MPB: Mobilized peripheral Blood BM: Bone Marrow 90% مشکلات مالی بانک‌های سلولی به خاطر عدم نیاز گیرنده‌های سلولی به این فرآورده‌ها، هزینه پردازش و نگهداری بالا و دور ریختن واحد‌هایی که شمارش سلول هسته‌دار کل(TNC: Total Nucleated Cells ) کمی داشتند، بود. تخمین زده می‌شود که در دهه گذشته تنها 3500 واحد UCB مورد استفاده قرار گرفته که این میزان تنها 5/0% واحدهای خون بند ناف موجود در کل دنیا می‌باشد. این میزان در بانک‌های خون خصوصی بسیار کمتر از مقادیر فوق است(23). هزینه معمول هر واحد خون بند ناف در کشور‌های توسعه یافته، 30 تا 60 هزار دلار می‌باشد (35، 34). با توجه به هزینه‌های فوق‌الذکر، امروزه کنترل مسائل مالی نگهداری و پیوند UCB-HSCs بسیاز حائز اهمیت می‌باشد(36). به همین دلیل آموزش به پرسنل به منظور جمع‌آوری بهتر و ارتقادادن روش‌های پردازش در بانک‌های سلولی، قادر است نقش قابل توجهی را در تعدیل هزینه‌ها ایفا نماید. استراتژی دیگر، استفاده وسیع‌تـر از UCB-HSCs در زمینه‌هـای مختلفــی هم‌چون اختلالات مغـزی، متـابولیک و ماهیچـه‌ای بـوده کـه منجر به استفاده بیشتـر و عـدم نیـاز بـه ذخیـره و نگهـداری طولانی مدت سلولها می‌گردد. پیوند UCB-HSCs : اولین مورد پیوند مغز استخوان با استفاده از UCB-HSCs جهت درمان کودک مبتلا به آنمی فانکونی که دارای نقص ارثی مغز استخوان بود، به کار برده شد(2، 1). پس از آن در سال 1990 اولین مورد پیوند در بیمار مبتلا به لوسمی(لوسمی میلومنوسیتیک جوانان) در شهر بالتیمور انجام شد و بعد از گذشت 5 سال، اولین بیمار بالغ لوسمی پیوند گردید(37، 24). تا به امروز حدود 40 هزار پیوند مغز استخوان با استفاده از UCB-HSC انجام شده است(38). درپیوند مغز استخوان کودکان، UCB-HSCs به اندازه BM-HSCs کاربرد داشته و مورد استفاده قرار می‌گیرند(39). مشخص شده است که پیوند مغز استخوان با استفاده از UCB-HSCs ، شیوع GVHD کمتری دارد و در بیماری‌های غیر بدخیم مغز استخوان نیز نتایج BMT با استفاده از UCB-HSCs خوب بوده و ریکاوری پلاکت‌ها و نوتروفیل‌ها به خوبی صورت می‌گیرد(41، 40). به طور کلی اثبات شده است که خط اول درمان درBMT در کودکان، UCB-HSCs با سازگاری 6/6 می‌باشد. در صورتی که تعداد سلولها کافی نباشد(حدود 90%) انتخاب‌های دیگر BM-HSC غیر خویشاوند با سازگاری 8/8 یا UCB-HSC غیر خویشاوند با ناسازگازی 6/5 و 6/4 مورد استفاده قرار می‌گیرد(42). به منظور BMT در بالغین، هنگامی که دهنده غیر خویشاوند با HLAسازگار در دسترس نباشد، پیوند با استفاده از UCB-HSC گزینه جایگزین مناسبی می‌باشد(43، 42). بر اساس تجربیات حاصله در طول دو دهه گذشته، پیوند ناسازگار از UCB-HSC در بیماران بالغ در مقایسه با پیوند از خون محیطی یا مغز استخوان سازگار، منجر به تاخیر در پیوند، کاهش بروز GVHD و میزان عود مشابه می‌گردد(44-42). دلیل این مسأله تعداد پایین HSCs وHPCs بندناف می‌باشد که باعث می‌شود بالغین تعداد سلولکمتری به ازای وزن بدنشان (cell/kg) دریافت نمایند. این مسأله باعث ریکاوری نوتروفیل‌ها بیش از 20 روز و ریکاوری پلاکت‌ها بیش از 40 روز می‌گردد. به طور کلی نرخ مرگ و میر در BMT با استفاده از UCB-HSCs مشابه پیوند با BM-HSCs می‌باشد(45). تا به امروز سلولهای بنیادی خونساز مغز استخوان با HLA سازگار 8/8 ، بهترین انتخاب(gold standard) برای BMT هستند. چالش‌های موجود جهت پیوند با UCB-HSCs : امروزه تعداد BMTs انجام شده با استفاده از UCB-HSCs حدود 40 هزار بوده که 80 نوع بیماری متفاوت هم‌چون لوسمی‌ها و هموگلوبینوپاتی‌ها را درمان نموده است(23). با وجود این که UCB-HSCs در دسترس بوده و احتمال وقوع GVHD کمی دارد اما تعداد پایین HSCs و HPCs باعث تأخیر در ریکاوری پلاکت‌ها و نوتروفیل‌ها و به طبع آن طولانی شدن دوره بستری در بیمارستان و افزایش هزینه‌های درمان می‌گردد. پیوندهای مغز استخوان انجام شده با استفاده از سلولهای بنیادی خونساز مغزاستخوان و خون محیطی، ریکاوری سریع‌تر پلاکت‌ها و سیستم ایمنی را در مقایسه با پیوند انجام شده با UCB-HSC نشان می‌دهند. بازسازی نوتروفیل‌ها در پیوند با استفاده از BM-HSCs ، 13 تا 18 روز بوده که این مقدار در UCB-HSCs حدود 20 روز است(42). تعداد پایین HSCs وHPCs دلیل اصلی تأخیر در ریکاوری پلاکت‌ها و نوتروفیل‌ها است. حداقل سلول لازم برای پیوند با استفاده از UCB-HSCs ، تعداد 106× 30-25 TNC به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن می‌باشد. یک کیسه خون بند ناف معمولاً قادر است این میزان سلول را برای کودکان تأمین نماید. چنانچه وزن گیرنده بیشتر از 60 کیلوگرم باشد یک کیسه قادر به تامین این میزان سلول نیست. بنابراین یکی از چالش‌های اساسی، پیدا کردن راهی جهت افزایش دادن تعداد HSCs و HPCs در نمونه خون بند ناف می‌باشد(46، 45، 32). افزایش تعداد سلولهای خونساز خون بند ناف و پیشسازهای آن: امروزه راهکارهای مختلفی جهت افزایش تعداد HSCs و HPCs به منظور انجام BMT معرفی شده است. راهکارهای مد نظر شامل: 1) مخلوط کردن دو کیسه خون بند ناف متفاوت 2) مخلوط کردن کیسه خون بند ناف با سلولهای بنیادی نیمه مشابه خون محیطی که از لنفوسیت‌هایT تهی شده‌اند 3) تکثیر آزمایشگاهی HSCs وHPCs و افزایش تعداد آن‌ها می‌باشد. 1) مخلوط کردن دو واحد خون بند ناف (Double-unit transplants): در ابتدا استراتژی مخلوط کردن یک واحد خون بند ناف معمولی به همراه یک واحد خون بندناف تکثیر یافته مطرح گردید که باعث کاهش بازه ریکاوری نوتروفیل‌ها و پلاکت‌ها می‌شود. مقایسه این دستورالعمل با روش قدیمی پیوند سلولهای HLA سازگار دستکاری نشده و مشاهده نکردن هیچ‌گونه تناقض حاد، باعث گسترش این روش درمانی در مواردی که تعداد سلول کافی وجود ندارد، گردید(48، 47). اگر چه تا به امروز عوارض خاصی برای این روش گزارش نشده است، اما هم‌چنان نگرانی‌هایی درباره واکنش دادن این سلولها(که پایه ژنتیکی متفاوتی دارند) بر علیه همدیگر وجود دارد(50، 49). بر اساس شواهد موجود، اگر چه پیوند دو واحد خون بند ناف باعث ریکاوری سلولی سریع‌تر گشته اما احتمال عود بیماری را افزایش می‌دهد. به شکل جالبی در 90% موارد یکی از واحدها پس‌زده و تنها یک واحد موفق به پیوند می‌شود. مطالعه‌های مختلف نشان داده است که تعداد سلولهای CD3+ ، سلولهای CD34+ ، سلولهای NK ، سلولهای CD4+ و سلولهای CD8+ تعیین کننده واحد غالب می‌باشد(51). اخیراً مطالعه‌ای در فرانسه انجام شده و نشان می‌دهد که مخلوط کردن دو کیسه خون بند ناف از لحاظ اقتصادی به صرفه‌تر بوده و در مجموع هزینه‌های BMT را پایین می‌آورد(52). 2)مخلوط UCB-HSCs با HSCs خون محیطی اهدا کننده نیمه مشابه (haploidentical): این دستورالعمل شامل تزریق یک واحد خون بند ناف به همراه سلولهای CD34+ جمع‌آوری شده از خون محیطی اهداکننده شخص ثالث نیمه مشابه می‌باشد. این نوع پیوند در هر دو نوع رژیم آماده سازی قبل پیوند شامل رژیم ریشه‌کن کننده(mieloablative regimens) و رژیم کم شدت(reduced-intensity conditioning( کاربرد دارد. گزارش‌های مختلف نشان‌دهنده بازسازی سلولی سریع، GVHD پایین کاهش شیوع عفونت‌های فرصت طلب، کاهش تزریق فرآورده‌های انتقال خون، کاهش دوره بستری شدن در بیمارستان و بهبودی‌‌های بادوام در این دستورالعمل می‌باشد(55-53). در بیماران تحت درمان با رژیم ریشه‌کن کننده، متوسط زمان بازسازی نوتروفیل و پلاکت به ترتیب 10 و 33 روز است. اما در بیماران تحت درمان با رژیم کم شدت، متوسط زمان بازسازی نوتروفیل و پلاکت به ترتیب 11 و 19 روز می‌باشد. اخیرا پیوند UCB-Haplo با استفاده از دو کیسه خون بند ناف صورت می‌گیرد(57، 56). پیوند UCB-Haplo جایگزین خوبی برای برخی از بیماران می‌باشد چرا که گاهاً پیدا کردن دهنده نیمه مشابه، خصوصاً بیماران با اصالت آفریقایی، کار دشواری است. در مطالعه‌ای که اخیراً انجام شد 7% بیماران فاقد اهداکننده نیمه مشابه بودند (56). 3)تکثیر آزمایشگاهی سلولهای بنیادی خونساز(Ex vivo expansion of UCB-HSC): تحقیقات اولیه در زمینه تکثیر سلولهای بنیادی نشان داد که تکثیر این سلولها شدیدا وابسته به سایتوکاین‌ها می‌باشد(58). بر این اساس، تلاش‌های اولیه با استفاده از سایتوکاین‌های نوترکیب منجر به تکثیر HSCs و HPCs گشته و تعداد سلولهای CD34+ را افزایش می‌دهد(63-59). اگر چه استفاده از سایتوکاین‌های اصلی هم‌چون FLT3 ، TPO و SCF منجر به تکثیر قابل توجه پیش‌سازهـای خونسـاز مـی‌گردد اما تکثیر و افزایش تعداد HSCs هم‌چنان به عنوان یک مسأله بحث‌برانگیز باقی مانده است(65، 64). از آن جا که HSCs و HPCs در ریز ساختارهای (microenvironment) مغز استخوان در تماس مستقیم با سلولهای استرومایی و تحت تاثیر مواد ترشحی آن‌هـا هستند، سیستم‌های کشت سلولی طراحی شد که به HSCs و HPCs اجازه کشت و تکثیر بر روی فیدر استرومایی (feeder layers) به عنوان حمایت‌کننده داده می‌شود(70، 68، 66). به این منظور سلولهای استرومایی مختلفی هم‌چون سلولهای اپیتلیال، سل لاین‌های استرومایی و MSC جداشده از بافت‌های مختلف مورد ارزیابی قرار گرفتند(72-69). مطالعه‌های فوق نشان داد که سلولهای استرومایی، خصوصاً MSCs، به واسطه تماس مستقیم (cell-to-cell-contact) با HSCs و هم چنین ترشح سایتوکاین‌های مختلف، باعث افزایش تکثیرHSCs می‌شوند. مولکول‌های مختلفی نیز اخیراً مورد آزمایش قرار گرفته‌اند که نشان دادند دارای تاثیری مثبت بوده و منجر به تکثیر و افزایش تعداد HSCs وHPCs می‌گردند. یکی از این مولکول‌ها شلاتهکنندهمس به نامتترااتیلن پنتامین Tetraethylenepentamine):TEPA ) می‌باشد(73). مولکول دیگر، لیگاند مشابه دلتا (DL1:Delta-like ligand-1)بوده که لیگاندی برای گیرنده Notch موجود در سطح HSCs است. این مولکول به صورت محلول در محیط کشت یا چسبیده به سطح سلولهای استرومایی بوده و منجر به تکثیر بیشتر HSCs می‌شود(75، 74) .از جمله دیگر مولکول‌های تأثیرگذار در تکثیر HSCs می‌توان، به نیکوتین آمید(فرم دیگری از ویتامین B3)، ماده مشتق شده از پورین به نام StemRegenin-1 (SR1) که گیرنده arylhydrocarbon راتحریک می‌نماید، UM171 (ماده مشتق شده از پیریمیدوایندول)، OAC1 (فعال‌کننده فاکتور رونویسی (Oct4، آنتاگونیست PPAR-γ که گلیکولیز را افزایش می‌دهد و مهارکننده‌های HDAC مثل والپوریک اسید را می‌توان نام برد(81-76). اولین کارآزمایی بالینیBMT با استفاده از HSCs تکثیر یافته حدود 15 سال قبل انجام شد. اگر چه تزریق سـلـول‌هـای تکثـیـر یـافتـه UCB-HSCs بـــا استفـاده از سایتوکاین‌های TPO ,FLT3 و SCF منجر به پیوند موفق سلولهای رده میلوئیدی و اریتروئیدی مغز استخوان نشد، اما این کارآزمایی بالینی، بی‌خطر و امکان پذیر بودن BMT با استفاده از این سلولها را اثبات کرد(83، 82). در ادامه BMTs نیـز بـا استفـاده از سلول‌هـای تکثیـر یافتـه توسـط TEPA، MSCs ، SR1 DL1 و نیکوتین آمید انجام شد(87- 84، 74). در بین BMTs انجام شده، HSCs که با DL1 ، SR1 ، نیکوتین آمید و MSCs تکثیر شده بودند در مقایسه با گروه کنترل، تعداد سلولهایCD34+ بیشتر و طول دوره پیوند کوتاه‌تری داشتند. تمامی سلولهای تزریق شده در پیوندهای فوق به همراه UCB-HSCs دستکاری نشده به بیمار تزریق شدند. زیرا اعتقاد بر این است که سلولهای تکثیر یافته در محیط آزمایشگاه از لحاظ بیولوژی و بیان برخی ژن‌ها با سلولهای تازه استخراج شده از بندناف متفاوت بوده و این سلولها به تنهایی قادر به تولید طولانی مدت سلولهای خونساز نمی‌باشند(88). بر همین اساس نیازمند تحقیقات بیشتری به جهت کشف مکانیسم‌های دقیق این دستورالعمل‌ها می‌باشیم. اخیراً هوروتیز و همکارانش، UCB-HSCs را با نیکوتین‌آمید تکثیر داده و کارآیی این نوع پیوند را مورد بررسی قرار دادند. آن‌ها مشاهده نمودند که این پیوند موفق‌آمیز بوده و بازسازی پلاکت و نوتروفیل به ترتیب 12 و 5/9 روز گزارش گردید (89). در پایان، دستورالعملهای تکثیر آزمایشگاهی سلولهای بنیادی خونساز خون بند ناف باید علاوه بر افزایش تعداد سلولهای CD34+و پیشسازهای آن، منجر به افزایش تعداد برخی از سلولهای ایمنی هم‌چون CD4+، CD8+ و NKcells نیز بشوند زیرا مشخص شده است که حضور این سلولها در انجام یک پیوند موفق بسیار حائز اهمیت است(46). تسریع بخشیدن لانه گزینی UCB-HSCs : به منظور انجام BMT ، HSCs و HPCs به داخل ورید تزریق می‌گردند. سلولهای فوق از دیواره اندوتلیال‌ها عبور و نهایتاً خود رابه ریز ساختارهای مغز استخوان یا همان نیچniche)) می‌رسانند(67، 66).این سلولها تکثیر و تمایز انجام داده و سلولهای بالغ را به وجود می‌آورند. مشاهده شده است که بیشتر سلولهای تزریق شده در مغز استخوان، لانه‌گزینی نمی‌کنند(90). تسریع بخشیدن به لانه‌گزینی UCB-HSCs و پیشسازهای آن‌ها، یکی دیگر از راه‌های ارتقا دادن BMT بااستفاده از UCB-HSCs می‌باشد. بـرای ایـن مهـم راه‌کارهـای مختلفـی در زیــر آورده شده است(91). تزریق داخل فمور: تزریق مستقیم سلولهای بنیادی خونساز به داخل حفره مدولاری استخوان فمور، یکی از راه‌کار‌هایی می‌باشد که تا حدودی مسأله لانه‌گزینی سلولها را حل نموده است. این سلولها بعد از تزریق مهاجرت کرده و به نیچ مورد نظر می‌چسبند. اگر چه تزریق مستقیم به داخل مغز استخوان لانه‌گزینی سلولها را ارتقاء می‌بخشد اما در خونسازی طولانی مدت مشکلاتی را به وجود می‌آورد(92). با وجودی که تزریق مستقیم سلولهای بنیادی خونساز به داخل مغز استخوان بیمار، به خوبی تحمل می‌گردد با این وجود میانگین زمان پیوند هم‌چنان بالای حدود 20 روز می‌باشد(94، 93). با این وجود مزیت‌هایی هم‌چون کاهش GVHD، کاهش زمان بازسازی پلاکت‌ها و کاهش عود مجدد بیماری در این دستورالعمل درمانی مشاهده شد که منجر به انتخاب آن به عنوان شیوه جایگزین گردید.
دستکاری SDF-1 - CXCR-4 با مهار کردنDPP4 : یـک مرحلـه کلیـدی و مهـم در لانه‌گزینی، برهـم‌کنش CXCR4 با فاکتور مشتق از سلولهای استرومایی(SDF-1: Stroma cell Derived Factor-1) که اسم دیگر آن CXCL12 است، می‌باشد. SDF-1 جاذب شیمیایی قدرتمندی بوده که توسط طیف وسیعی از سلولهای استرومایی ترشح می‌شود و لیگاند آن CXCR4 می‌باشد که توسط سلولهای مختلفی از جمله HSCs و HPCs بیان می‌گردد. SDF-1 توسط آنزیم دی پپتیدیل پپتیداز 4 (DPP4) برش خورده و فعالیت جاذب شیمیایی خود را از دست می‌دهد(95). مهار DPP4 یا حذف ژن DPP در موش‌هـا، باعـث افزایـش کمـوتاکســی HSCs و HPCs و متعاقباً تسریع لانه‌گزینی سلولهای فوق گردید(96). بر این اساس کارآزمایی بالینی داروی سیتاگلیپتین(مهارکننده DPP4) انجام و موفق به کسب تاییدیه FDA شده است. داروی فوق به صورت خوراکی در بیماران لوسمی دریافت‌کننده BMT به همراه تزریق UCB-HSCs مورد استفاده قرار گرفت(99-97). نتایج به دست آمده نشان داد که سیتاگلیپتین دارویی ارزان و بی‌خطر بوده که ریکاوری پلاکتی را به کمتر از20 روز کاهش می‌دهد(91). تحقیقات بیشتر برای بررسی نقش سیتاگلیپتین در ریکاوری پلاکتی و سلولهای ایمنی باید انجام گشته و نقش آن را در ریکاوری سلولهای فوق بعد از پیوند مشخص سازد. اضافه کردن قند فوکوزFucosylation)): اضافه شدن قند فوکوز به مولکول‌های خاصی در سطح UCB-HSCs ، نقش مهمی در لانه‌گزینی این سلولها در مغز استخوان ایفا می‌کند(91). UCB-HSCs دارای مقادیر کمی قند فوکوز بر سطح سلکتین‌های E و P می‌باشند. بر همین اساس این فرضیه مطرح شد که اضافه کردن قند فوکوز به سلکتین‌های موجود بر سطح HSCs و HPCs ، منجر به افزایش لانه‌گزینی و کوتاه شدن دوره بازسازی‌های بعد از پیوند می‌گردد(100). با انجام کارآزمایی‌های بالینی فرضیه فوق، مشخص شد که دوره بازسازی نوتروفیل‌ها از 26 به 17 روز و دوره بازسازی پلاکت ها از 45 روز به 35 روز کاهش یافت(101). پروستاگلندینE2 : پروستاگلندین E2 (PGE2) به عنوان تعدیل کننده سیستم خونساز شناخته شده و نقش آن در لانه‌گزینی و کاهش ریکاوری سلولی پس از BMT در موش‌ها مشاهده شده است(104-102). بر اساس مطالعه‌های فوق، کارآزمایی بالینی طراحی گردید که بیماران یک واحد خون بند ناف تیمار شده با PGE2 به همراه یک واحد دستکاری نشده دریافت کردند. در این مطالعه دوره ریکاوری نوتروفیل‌ها از 21 روز به 5/17 روز کاهش یافت(105). ارتقاء لانه گزینی HSCs : بـرخـی مـطالعـه‌هـا نشـان داده اسـت کـه تیمـار کردن CD34+HSCs با قطعهC3a کمپلمان و تزریق آن‌ها به همراه یک واحد خون بند ناف دستکاری نشده، منجر به ارتقاء لانه‌گزینی و کاهش دوره ریکاوری نوتروفیل و پلاکت‌ها می‌شود(105). از طـرف دیگـر مشخـص شـده اسـت که تیمار UCB- HSCs با گرما و قرار دادن آن‌ها در شرایط هایپرترمیا، منجر به ارتقا دادن لانه‌گزینی و کاهش بازه ریکاوری سلولها می‌گردد(106). یک مطالعه دیگر نشان داده است که مهار HDAC5 (هیستون د استیلاز 5) منجر به افزایش بیان CXCR4 در سطح UCB-HSCs گشتهو منجر به بیشتر شدن برهم‌کنش بین SDF-1/CXCR4 و ارتقاء لانه‌گزینی HSCs می‌گردد(107). هم‌چنین هورمون‌های گلوکوکورتیکوئیدی باعث افزایش بیان CXCR4 در سطح UCB-HSCs و UCB-HPCsمی‌گردد(108). مواد و روش‌ها جمع‌آوری اطلاعات در این مطالعه مروری از طریق جستجو در پایگاه اطلاعاتی PubMed و با استفاده از کلید واژه‌های خون بند ناف، سلولهای بنیادی خونساز و بانک سلولهای بنیادی در بازه زمانی 2000 تا 2020 صورت گرفت سپس مطالب جمع آوری شده خلاصه سازی و گردآوری شدند. یافته‌ها در سه دهه گذشته UCB-HSCs نقش پررنگی در BMT ایفا کرده و منابع سلولی را برای بیمارانی که اهداکننده HLA سازگار ندارند، فراهم نموده است. محققان مختلفی بر روی این سلولها تمرکز کرده و در حال یافتن راهی جهت کاهش دوره ریکاوری پلاکتی و نوتروفیلی و کاهش انتقال عفونت‌ها می‌باشند. این موارد منجر به کاهش هزینه‌ها و مقرون به صرفه‌تر کردن پیوند می‌شود. تا به امروز مکانیسم دقیق خودنوسازی UCB-HSCs مشخص نشده است. امروزه محققین در حال یافتن راهی ایده‌آل برای ex vivoexpansion سلولهای فوق بوده و هم‌چنین در پی بررسی بیولوژی دقیق و برهم‌کنش UCB-HSCs حین تزریق دو کیسه خون بند ناف هستند تا بتوانند راهی مؤثر جهت مقابله با غالب شدن یکـی از کیسه‌هـای خـون پیـدا کنند. اگر چه طی دهه گذشته استفاده از UCB-HSCs تکثیر یافته در BMT نقش برجسته‌ای در درمان بیمار‌های بدخیم داشته، اما امروزه تنها چند گروه محدود در کل دنیا از سلولهای فوق در BMT استفاده می‌کنند که دلیل این محدودیت علت‌های زیر می‌باشد. اولاً، همان طوری که در بالا ذکر شد، هنوز مکانیسم دقیق خودنوسازی UCB-HSCs شناخته نشده و ابهامات فراوانی برای دستکاری این سلولها وجود دارد. دوماً، تکثیر آزمایشگاهی این سلولها حیطه‌ای نو در زمینه UCB-HSCs بوده و نیازمند روش‌های مطمئن و قابل اعتمادتری می‌باشد. سوماً، تکثیر آزمایشگاهی UCB-HSCs هزینه بر بوده و استفاده گسترده از آن به صرفه نمی‌باشد. انتظار می‌رود که در آینده نزدیک راهکارهای مطمئن و مقرون به صرفه‌تری توسعه یافته و به جامعه علمی معرفی گردد. امروزه فاز II و III آزمایش‌های بالینی با UCB-HSCs تکثیر یافته آزمایشگاهی در حال انجام می‌باشد. استفاده از UCB-HSCs تکثیر یافته با روش ex vivo expansion در BMT ، روشی جدید بوده و به سرعت در حال پیشرفت است. اخیراً محققان در حال ارزیابی ریز مولکول‌ها(Small molecules) و دستورالعملهای کشت مختلفی هم چون کشت سه بعدی و استفاده از ماتریکس‌های خارج سلولی و بررسی نقش آن‌ها درex vivo expansion می‌باشند(111-109). علاوه بر نقش UCB-HSCs در BMT ، کاربردهای درمانی دیگری هم‌چون درمان اختلالات متابولیک، بیماری‌های نورولوژیک، و اوتیسم در نظر گرفته شده است (119-112). مطالعه دیگری که در مرحله فاز I آزمایش‌های بالینی می‌باشد، نشان داده است که استفاده از UCB-HSCs تاثیر مثبتی در درمان سکته مغزی دارد(120). خون بند ناف علاوه بر HSCs ، حاوی سلولهای دیگری هم‌چون MSCs و سلولهای اندوتلیال است(20-16). MSCs قبلاً در درمان بیماری‌های مختلفی چون آرتریت روماتوئید، فلج مغزی،سوختگی‌ها ، دیسپلازی‌های برونشی- ریوی و درماتیت‌های آتوپیک(atopic dermatitis) مورد استفاده قرار گرفته‌اند(128-120). اخیراً از MSCs جدا شده از UCB در درمان طیف وسیعی از بیماری‌های هماتولوژیک و غیر هماتولوژیک استفاده می‌شود. همین مسأله منجر به تمایل بیشتر در جهت ارتقا دادن بانک‌های سلولی و نگهداری بیشتر این سلولها گردیده است. قبلاً از MSCs جـدا شـده از بـافت بنـد نـاف وبـافت جفـت در مطالعه‌های کلینیکی استفاده شده است(133-129). برخی محققان در محیط آزمایشگاه، سلولهای عصبی دارای عملکردی از HSCsCD34+ و CD133+ بند ناف تولید کرده‌اند(134) .این مهم به واسطه دستکاری محیط کشت سلولها یا افزایش بیان فاکتور رونویسی SOX2 امکان پذیر می‌باشد. اگر چه تولید سلولهای غیر خونساز از HSCs هنوز در هاله‌ای از ابهام می‌باشد و به طور قطعی اثبات نشده است اما این مسأله بسیار ارزشمند بوده زیرا تولید سلولهای غیرخونساز از HSCs می‌تواند نقش برجسته‌ای در پزشکی بازساختی ایفا نماید(22). نتیجه‌گیری ذخیره و نگهداری UCB-HSCs در بانک‌های بند ناف
خصوصی و دولتی و هم‌چنین تحقیقات گسترده به منظور بررسی مکانیسم‌های مولکولی HSCs و HPCs منجر به فهم دقیق عملکرد این سلولها و تدوین استراتژی‌های جدیدی در زمینه استفاده در درمان سایر بیماری‌ها گردیده است. تحقیقات در زمینه تکثیر آزمایشگاهی HSCs بسیار موفق بوده و استفاده‌های بالینی از این سلولها را افزایش داده است. با این وجود چالش‌هایی که در این زمینه بحث شد و هم چنین موارد دیگر، نیاز به روشن شدن توسط مطالعه‌های بزرگتر بر روی بیولوژی پایه ی HSCs و HPCs و هم چنین مطالعه‌های نوین کارآزمایی بالینی بر روی بیماری‌های هماتولوژیکی و غیر هماتولوژیکی دارد و هنوز پرسش‌های بی‌شماری در زمینه ذخیره سازی، تکثیر و مکانیسم‌های مولکولی HSC و MSC های خون بندناف و کاربردهای بالینی آن‌ها در زمینه درمان بیماری‌های مختلف وجود دارد.
