چکیده سابقه و هدف استفاده از کیت‌های با حساسیت و ویژگی بالا، برای تعیین شیوع آنتی‌بادی علیه هسته ویروس هپاتیت B (anti-HBc) از اهمیت بالایی برخوردار می‌باشد. این مطالعه با هدف تعیین شیوع آنتی‌بادی علیه هسته ویروس هپاتیت B در اهداکنندگان خون HBsAg منفی، با استفاده از دو کیت ایمنواسی آنزیمی anti-HBc دیاپرو و زیمنس انجام شد. مواد و روش‌ها در یک مطالعه مقطعی، 4313 نمونه از اهداکنندگان خون HBsAg منفی جمع‌آوری گردید. همه نمونه‌ها جهت شناساییanti-HBc به روش الایزا و با استفاده از کیت‌های دو کمپانی دیاپرو و زیمنس آزمایش شدند. روی نمونه‌های واکنشی هر دو کیت، آزمایش anti-HBc به صورت دوتایی تکرار شد. آنالیز آماری داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار 22 SPSS و آزمون‌کای دو انجام شد. یافته‌ها جمعیت این مطالعه شامل(3/5%) 227 زن و (7/94%) 4086 مرد بودند. (5/11%) 498 و (9/8%) 384 نمونه به ترتیب با کیت‌های دیاپرو و زیمنس برای anti-HBc واکنش نشان دادند. 114 مورد از نمونه‌های واکنشی کیت دیاپرو، در آزمایش با کیت زیمنس، منفی شدند. بین نتایج واکنشی دو کیت، اختلاف معناداری مشاهده شد (00005/0 p=). ضریب توافق برای نتایج واکنشی دو کیت 85% بود. نتیجه گیری با توجه به اختلاف معنادار نتایج دو کیت، پیشنهاد می‌شود برای قابل مقایسه بودن نتایج مطالعه‌ها و برای تعیین شیوع anti- HBc در اهداکنندگان خون با عفونت گذشته HBV، آزمایش anti- HBc به همراه anti-HBs و یا anti-HBe انجام شود. کلمات کلیدی:هپاتیت B ، اهداکنندگان خون، ایران
تاریخ دریافت: 8 /8 /98 تاریخ پذیرش: 10/12/98
1- دانشجوی PhD میکروبیولوژی ـ گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم و فناوری‌های نوین، علوم پزشکی تهران ـ دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران 2- مؤلف مسئول: PhD ویروس‌شناسی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665 3- PhD ویروس‌شناسی ـ دانشیار گروه میکروبیولوژی دانشکده پزشکی، علوم پزشکی تهران ـ دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران 4- PhD ایمنی‌شناسی ـ استاد گروه ایمونولوژی دانشکده علوم پزشکی دانشگاه تربیت مدرس ـ تهران ـ ایران 5- PhD میکروبیولوژی ـ استادیار گروه میکروبیولوژی دانشکده علوم و فناوری‌های نوین، علوم پزشکی تهران ـ دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران
مقدمه آلودگی با ویروس هپاتیت B(HBV) از طریق انتقال خون، یکی از نگرانی‌های عمده در طب انتقال خون می‌باشد. از سال 1970 تاکنون، HBsAg اولین خط غربالگری هپاتیت B در اهداکنندگان خون است. غربالگری بر اساس HBsAg ، نیازمند روش‌های پیشرفته با حساسیت و اختصاصیت بسیار بالا است که بتواند طول دوره پنجره (Window Period)HBV را به وسیله شناسایی حداقل مقدار HBsAg در حاملین بدون علامت، تا حد ممکن کاهش دهد(1). در عفونت هپاتیت B مخفی (OBI) ، HBsAg در سرم قابل شناسایی نمی‌باشد ولی DNA ویروس در کبد و یا سرم و گاهی فقط در کبد با تعداد ویروس پایین وجود دارد(2، 1). در80% موارد هپاتیتB مخفی، anti-HBc وجود دارد(3). آنتی‌بادی‌هایی که علیه پروتئین هسته HBV(anti-HBc) تولید می‌شوند، معمولاً حدود 6 تا 12 هفته پس از مواجهه فرد با HBVظاهر شده و با طول عمر بالایی در بدن شخص قابل شناسایی هستند. حضور anti-HBc در سرم یا پلاسمای فرد، نشان‌دهنده عفونت قبلی با HBVدر هر دو فاز حاد و مزمن حتی پس از پاکسازی ویروس از بدن می‌باشد(4، 1). در کشورهای پیشرفته علاوه بر HBsAg ، آزمایش سرولوژی anti-HBc و روش مولکولی NAT (Nucleic Acid Test) ، نقش مهمی در تشخیص عفونت هپاتیت B در اهداکنندگان خون دارند (4، 1). در هر کشور، سیاست‌های غربالگری اهداکنندگان خون بر اساس شیوع عفونت ویروسی در آن منطقه تعیین می‌شود، به طوری که در کشورهای پیشرفته و با شیوع پایینHBV از قبیل آمریکا، فرانسه، آلمان و کانادا، هر دو آزمایش غربالگری HBsAg و anti-HBc انجام می‌شود. در حالی که در کشورهای در حال توسعه و با شیوع بالای HBV ، غربالگری بر مبنای HBsAg است و غربالگری بر مبنای anti-HBc ، منابع خونی را تا حدود زیادی محدود کرده و سبب از دست رفتن آن‌ها می‌شود(5، 4). طیف شیوع عفونت HBV در جمعیت عمومی ایران گسترده و حدود 7/10%-2/1% در مناطق و استان‌های مختلف می‌باشد (8-6). کمترین آمار شیوع HBV در جمعیت عمومی ایران مربوط به استان کرمانشاه با 1/1%-4/0% و بیشترین آمار مربوط به استان گلستان با 2/10%-6/7% است(9). به طور کلی کشور ایران از نظر شیوع HBV جزو کشورهای با خطر کم تا متوسط(با میانگین شیوع 2/2%) به شمار می‌رود (8، 5). شیوع HBsAg در اهداکنندگان خون ایران از 4/3% در سال 1979 به 2/0% در سال‌های اخیر کاهش یافته است(8). به طور مثال در بازه زمانی 2005 تا 2014 ، شیوع HBsAg در اهداکنندگان خون کهگیلویه و بویر احمد، 13/0% گزارش شده است(7). میزان شیوع anti-HBc در بین اهداکنندگان خون ایرانی بین 11%-1/2% گزارش شده که با استفاده از کیت‌های مختلف تجاری می‌باشد. استفاده از کیت‌های معتبر جهت شناسایی آنتی‌بادی‌های IgM و IgG علیه پروتئین هسته HBV(anti-HBc) و تعیین درصد افرادی که در معرض عفونت هپاتیت B بوده‌اند، از اهمیت بالایی برخوردار است. این مطالعه با هدف تعیین شیوع anti-HBc در اهداکنندگان خون HBsAg منفی، با استفاده از دو کیت تجاری ایمنواسی آنزیمی(الایزا) دیاپرو و زیمنس انجام شد.
مواد و روش‌ها در این مطالعه مقطعی، 4313 نمونه سرم از اهداکنندگان خون HBsAg منفی استان گلستان، در بازه زمانی دی ماه تا اسفند ماه 1396 جمع‌آوری گردید. نمونه‌های سرم با رعایت زنجیره سرما از مرکز انتقال خون گلستان به سازمان انتقال خون ستاد مرکزی در تهران منتقل گردید. نمونه‌های سرم اهداکنندگان جهت انجام آزمایش‌ها در فریزر 70- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. اطلاعات دموگرافیک این جمعیت شامل سن، جنس و نوع اهدای خون بررسی شدند. این مطالعه توسط کمیته اخلاق مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون به شماره IR.TMI.REC.1396.013 تایید گردید و از اهداکنندگان رضایت نامه طرح تحقیقاتی دریافت شد.
انجام آزمایش الایزا (ELISA) : بر روی 4313 نمونه اهداکنندگان خون استان گلستان، آزمایش(IgM & IgG)anti-HBc به روش الایزا و با استفاده
جدول 1: مشخصات کیت‌های ایمنواسی آنزیمی دو کمپانی دیاپرو و زیمنس
از دو کیت تجاری: دیاپرو(HBc-Ab DIA-PRO Diagnostic Bioprobes) و زیمنس(Anti-HBc monoclonal Enzygnost®monoclonal SIEMENS) در آزمایشگاه کنترل کیفی ستاد مرکزی سازمان انتقال خون در سال 1397 انجام شد(جدول 1). روش انجام کار و مراحل کار بر اساس دستورالعمل مخصوص هر یک از دو کیت(دیاپرو و زیمنس) و به روش دستی (غیر اتوماتیک) انجام و در نهایت خواندن نتایج آزمایش‌ها با دستگاه الایزا ریدر در طول موج 450 نانومتر و فیلتر رفرانس 620 نانومتر صورت گرفت. بر روی نمونه‌های واکنش داده با هر کیت، به صورت دوتایی با همان کیت و هم‌چنین با کیت مقابل آزمایش مجدد انجام شد. تجزیه و تحلیل آماری به وسیله نرم‌افزار 22 SPSS (آمریکا، نیویورک، SPSS IBM) و با استفاده از آزمون کای‌دو انجام و 05/0 p< معنادار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها در این مطالعه مقطعی، 4313 نمونه سرم از اهداکنندگان خون استان گلستان که از نظر HBsAg ، HIV Ag-Abو HCV Ab منفی بودند ، بررسی شدند. بازه سنی این جمعیت 22 تا 63 سال و میانگین سنی آن‌ها 22/9 ± 73/34 سال بود. این جمعیت شامل(3/5%) 227 زن و (7/94%) 4086 مرد بودند. از این جمعیت، (5/11%) 498 نمونه و (9/8%) 384 نمونه به ترتیب در نتیجه استفاده از کیت‌های دیاپرو و زیمنس برای anti- HBc (IgM & IgG) واکنش مثبت نشان دادند(نمودار 1). تمام نمونه‌های واکنش داده با هر دو کیت در آزمایش مجدد با همان کیت نیز واکنش مثبت نشان دادند(جدول 2). از 498 نمونه anti- HBc واکنشی با کیت دیاپرو که با استفاده از کیت زیمنس مورد بررسی مجدد قرار گرفتند، 114 نمونه anti-HBc غیر واکنشی(منفی) شدند در حالی که 384 نمونه با هر دو کیت زیمنس و دیاپرو واکنش نشان دادند. بنابراین در این مطالعه(9/8%) 384 نمونه واکنش داده با هر دو کیت، به عنوان نمونه‌های anti- HBc واکنشی در نظر گرفته شد. بین نتایج anti-HBc واکنشی دو کیت، اختلاف معنادار مشاهده شد(00005/0 p=). ضریب توافق(ضریب کاپا) بین نتایج دو کیت، برابر با 85/0 بود و نشان‌دهنده این مطلب است که نتایج دو کیت با هم 85% توافق و مطابقت دارند. بین فاکتورهای سن، جنس و نوع اهدای خون در این نمونه‌ها تفاوت معناداری مشاهده نشد(جدول 3).
نمودار 1 : نتایج anti-HBc دو کیت زیمنس و دیاپرو
جدول 2: نتایج آزمایش anti-HBc با استفاده از دو کیت ایمنواسی آنزیمی دیاپرو و زیمنس
جدول 3: میانگین سنی و مشخصات دموگرافیک افراد anti-HBc واکنشی
بحث در این مطالعه، تعداد نمونه‌های anti-HBc (Total, IgM & IgG) واکنشی(مثبت) با استفاده از کیت زیمنس(9/8%)، در 384 نمونه و با کیت دیاپرو، (5/11%) در 498 نمونه به دست آمد و 114 نمونه واکنشی کیت دیاپرو، با کیت زیمنس واکنش ندادند. از آن جایی که anti-HBc کل، هر دو آنتی‌بادی IgM و IgG علیه پروتئین هسته‌ای هپاتیت B را شناسایی می‌کند، هر یک از کیت‌های دیاپرو و زیمنس برای تشخیص عفونت‌های حاد و مزمن HBV قابل استفاده می‌باشند و مثبت بودن این آزمایش نشانه عفونت جاری و یا عفونت قبلی است.میزان حساسیت و ویژگی هر یک از دو کیت استفاده شده در جدول 1 آمده است. یکی از معیارهای استفاده از کیت‌های فوق، توجه به نمونه‌های استفاد شده جهت تعیین میزان ویژگی و حساسیت کیت anti-HBc توسط دو کمپانی می‌باشد. مطابق بروشور موجود در کیت زیمنس، حساسیت این کیت با استفاده از رفرانس‌های WHO بررسی و تعیین شده است. هم‌چنین در مطالعه کالوس و همکارانش کیت anti-HBc کمپانی زیمنس با سرم‌های استاندارد WHO در غلظت‌های بالا و پایین بررسی شده و نشان داده شده برای anti-HBc IgG دارای حساسیـت کافـی مـی‌باشـد. بـه طـور کلـی ویژگی آزمایش anti-HBc و واکنش‌پذیری معرف‌های محتوی کیت‌ها، بسته به شرکت‌های تولیدکننده آن متفاوت است، بنابراین مقایسه نتایج واکنشی این آزمایش‌ها بایستی با احتیاط انجام شود (14، 10). بر اساس گزارش‌های منتشر شده، میزان شیوع anti-HBc در بین اهداکنندگان خون ایرانی بین 11%-1/2% و در بین جمعیت عمومی ایران 4/16% می‌باشد(15، 8)(جدول 4). به طوری که بیشترین و کمترین شیوع anti-HBc در بین اهداکنندگان خون ایران به ترتیب متعلق به استان‌های گلستان و اراک است(22-16، 8). لازم به ذکر است که اختلاف بین نتایج مطالعه‌های گزارش شده می‌تواند ناشی از فاکتورهای مختلفی از جمله منطقه جغرافیایی، اندازه جمعیت مورد مطالعه و نتایج مثبت و منفی کاذب به دلیل عدم حساسیت و ویژگی کافی کیت‌های الایزای کمپانی‌های مختلف باشد. هم چنین مطابق مطالعه سامس، اختلاف بین نتایج در روش‌ها و مطالعه‌های مختلف به عواملی از جمله تغییرات زیاد در پاسخ ایمنی فرد به آنتی‌ژن‌های مختلف مورد استفاده در هر کیت و استفاده کمپانی‌های تولیدکننده از وکتورهای مختلف برای کلون کردن آنتی‌ژن‌های نوترکیب نیز ارتباط دارد(23).
جدول 4: میزان شیوع anti-HBc در بین اهداکنندگان خون ایران
در طی سال‌های اخیر، برخی کشورها استراتژی‌های متفاوتی در برخورد با اهداکنندگان anti-HBc مثبت به کار گرفته‌اند که از آن جمله می‌توان به کشورهایی مثل ژاپن و آلمان اشاره کرد. در کشور ژاپن از خون‌های anti-HBc مثبت با تیتر anti-HBs بالای mL/mIU 200 جهت تزریق و در صنعت پالایش پلاسما استفاده می‌شود. این در حالی است که در کشور آلمان روی نمونه‌های anti-HBc مثبت علاوه بر آزمایش anti- HBs و HBV NAT ، آزمایش anti-HBc نیز تکرار می‌شود و در صورتی که همه آزمایش‌ها منفی باشند، اهداکننده به چرخه انتقال خون باز می‌گردد (10). سازمان غذا و داروی آمریکا در سال 1991 جهت جلوگیری از، از دست دادن اهداکنندگان بر مبنای آزمایش anti-HBc ، توصیه کرد که بر روی اهداکنندگان حاوی آنتی‌بادی ضد پروتئین هسته‌ای(anti-HBc)، آزمایش تکرار شود و در صورت تکرار نتیجه واکنشی(repeatedly reactive)، اهداکننده از اهدای خون معاف گردد(13، 12). در مطالعه کنونی، جهت به حداقل رساندن نتایج مثبت کاذب، نمونه‌های واکنش داده با هر کیت را به صورت دوتایی با همان کیت و کیت دیگر تکرار نمودیم که در نهایت 114 نفر از نمونه‌های واکنش داده با کیت دیاپرو، در آزمایش با کیت زیمنس منفی شدند در حالی که تمام نمونه‌های واکنش داده با کیت زیمنس، با کیت دیاپرو نیز واکنش نشان دادند. نتایج دو کیت دارای ضریب توافق (ضریب کاپا) 85 درصد بود ونتایج مثبت هر دو آزمایش، ملاک تعیین شیوع anti-HBc ، 9/8% در نظر گرفته شد. در مطالعه حاضر، شیوع anti-HBc در نتیجه استفاده از کیت دیاپرو 5/11% به دست آمد که با مطالعه تبار و همکارانش که شیوع anti-HBc در بین اهداکنندگان خون استان گلستان را 11% (با استفاده از کیت دیاپرو) گزارش کرده‌اند، مطابقت دارد(22). به هر حال نتایج حاصل از دو کیت زیمنس و دیاپرو بر روی نمونه اهداکنندگان نشان داد که شیوع anti-HBc در بین اهداکنندگان خون استان گلستان بالای 2% می‌باشد و غربالگری anti-HBc، باعث کاهش ذخایر خون و از دست دادن اهداکنندگان خون می‌شود. اگر چه به نظر می‌آید غربالگری anti-HBc ، یک اقدام بالقوه برای بهبود بیشتر سلامت خون است، ولی به دلیل عدم ویژگی این آزمایش، انجام این مارکر جهت غربالگری خون‌های اهدایی یک موضوع بحث برانگیز است. هنوز یک دستور عمل طلایی (golden rule) برای تایید نمونه‌های واکنشی anti-HBc که نشان‌دهنده عفونت HBV باشد، وجود ندارد و نتایج anti-HBc واکنشی به همراه anti-HBs و یا anti-HBe می‌تواند نشان‌دهنده عفونت گذشتهHBV باشد. در مواردی که anti-HBc تنها وجود دارد، پی‌گیری look-back می‌تواند جهت بررسی احتمال وجود عفونت HBV در اهداکنندگان خون بسیار کمک‌کننده باشد(24، 12). نتیجه‌گیری با توجه به اختلاف معنادار نتایج دو کیت، پیشنهاد می‌شود برای قابل مقایسه بودن نتایج مطالعه‌ها و تعیین شیوع anti- HBc در اهداکنندگان خون با عفونت گذشته HBV ، آزمایش anti-HBc به همراه anti-HBs و یا anti-HBe انجام شود.
تشکر و قدردانی نویسندگان مقاله از مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران به خاطر تامین مالی این طرح، تشکر و قدردانی می‌نمایند. این مقاله حاصل پایان‌نامه دکترای تخصصی میکروبیولوژی و دارای کد اخلاق IR.TMI.REC.1396.013 می‌باشد.
Bahrami A, Sharifi Z, Parsania M, Haghighat S. Prevalence of anti-HBc in HBsAg negative blood donors using two enzyme immunoassays kits. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2020; 17 (2) :83-90 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1316-fa.html
بهرامی اسماء، شریفی زهره، پارسانیا مسعود، حقیقت ستاره. شیوع anti-HBc در اهداکنندگان خون HBsAg منفی با استفاده آنزیمی. فصلنامه پژوهشی خون. 1399; 17 (2) :83-90
