جلد 17، شماره 1 - ( بهار 1399 )
جلد 17 شماره 1 صفحات 11-1 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Ranjbar Kermani F, Amini Kafi Abad S, Mousavi Hosseini K, Maghsudlu M, Sharifi Z. Update on HCV genotypes among Iranian blood donors. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2020; 17 (1) :1-11
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1299-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1299-fa.html
رنجبرکرمانی فهیمه، امینی کافی آباد صدیقه، موسوی حسینی کامران، مقصودلو مهتاب، شریفی زهره. به روز رسانی ژنوتیپ‌های شایع ویروس هپاتیت C در اهداکنندگان خون ایران. فصلنامه پژوهشی خون. 1399; 17 (1) :1-11
دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
متن کامل [PDF 509 kb]
(1225 دریافت)
| چکیده (HTML) (3589 مشاهده)
مقدمه
عفونت با ویروس هپاتیت C (HCV) مشکل سلامت عمومی و یکی از عوامل اصلی بیماری مزمن کبدی در سراسر جهان و به طور خاص یکی از عوامل مهم ناخوشی و مرگ و میر در کشورهای در حال توسعه است. شایع‌ترین راه انتقال ویروس، تماس با خون آلوده است که از راه‌های مختلفی نظیر استفاده تزریقی مواد مخدر(Intravenous drug use: IDU)، مراقبت‌های درمانی غیر بهداشتی و دریافت خون و فرآورده‌های خونی غربالگری نشده امکان‌پذیر می‌باشد(2، 1). در کشورهای پیشرفته، IDU و در کشورهای در حال توسعه، قبل از به کارگیری روش‌های غربالگری ویروسHCV در اهداکنندگان، انتقال خون هم‌چنان یکی از راه‌های اصلی انتقال عفونت است. در کشورهای در حال توسعه که از غربالگری اهداکنندگان استفاده می‌کنند، عوامل مرتبط با اقدامات بیمارستانی، مراقبت‌های بهداشتی(Nosocomial) نظیر بستری شدن در بیمارستان و تزریق وریدی- عضلانی-زیرپوستی دارو، از راه های اصلی انتقال عفونت شناخته شده‌اند(4، 3، 1). در ایران IDU ، استفاده غیر تزریقی مواد مخدر، مجروحیت جنگی، زندگی با فرد IDU، داشتن سابقه زندان، استفاده از تیغ مشترک، اقدامات پزشکی و دندانپزشکی، اهدای بار اول، سطح پایین تحصیلات، جنسیت مرد و متأهل بودن از جمله عوامل خطرساز در انتقال عفونت و ساب تیپ‌های 1a، 3a و 1b شایع‌ترین ژنوتیپ‌های HCV گزارش شده‌اند(9-5).
انباشت جهش‌های ایجاد شده در ویروس، منجر به ایجاد زیر گروه‌ها یا ساب‌تیپ‌ها و در نهایت تنوع در ژنوم یا ژنوتیپ ویروس می‌شود. در حال حاضر، با استفاده از تحلیل فیلوژنتیکی ویروس HCV ، 7 ژنوتیپ اصلی با تفاوت توالی بیش از 30% و 86 ساب‌تیپ با تفاوت توالی 30%-15% شناسایی شده است(11، 10). شیوع ژنوتیپ‌های مختلف و توزیع آن‌ها با منطقه جغرافیایی مرتبط می‌باشد. بررسی‌های متعدد درخصوص توزیع جهانی ژنوتیپ، حاکی از این است که به طور کلی ترتیب شیوع ژنوتیپ‌ها به صورت ژنوتیپ‌های 1 ، 3 ، 4 ، 2 ، 6 و 5 می‌باشند. ژنوتیپ‌های 1، 2 و 3 در آمریکـا، اروپـا، ژاپـن، استرالیـا و
نیوزیلند، ژنوتیپ 4 در آفریقای شمالی و خاورمیانه، ژنوتیپ 5 در آفریقای جنوبی و ژنوتیپ 6 در آسیای جنوب شرقی شایع می‌باشند(13، 12). بررسی‌های انجام شده در ایران بیانگر شایع بودن ساب‌تیپ‌های 1a ، 3a و 1bدر نقاط مختلف کشور و با فراوانی‌های متفاوت است(16-14). تعیین ژنوتیپ برای شناسایی ژنوتیپ/ ساب‌تیپ‌های جدید اهمیت فراوانی دارد(17). به نظر می‌رسد هر گونه تغییر در توزیع ژنوتیپ می‌تواند بیانگر تغییر احتمالی در عواملی نظیر راه انتقال عفونت، تغییر در وضعیت بهداشت جامعه و سبک زندگی آن جامعه باشد که در مناطق جغرافیایی مختلف با یکدیگر تفاوت دارد.
روش‌های مولکولی رایج جهت تعیین ژنوتیپ به طور کلی شامل روش تشخیص چند شکلی طول قطعات حاصل از برش (RFLP: Restriction fragment length polymorphism)، تکثیر با آغازگرهای اختصاصی(Primer specific) هر ژنوتیپ، دو رگه‌سازی محصول تکثیر با پروب اختصاصی(Hybridization with specific probes)، تجزیه و تحلیل منحنی ذوب(Melting curve analysis) و توالی‌یابی(Sequencing) نواحی مختلف ژنوم ویروس است(18). روش استاندارد طلایی(Gold standard) برای تعیین ژنوتیپ ویروس، روش توالی‌یابی ژنوم در نواحی Core/E و NS5B ژنوم ویروس است(19). در حال حاضر با توجه به اهمیت تعیین ژنوتیپ با روش توالی‌یابی ژنوم ویروس در بررسی‌های اپیدمیولوژی و بالینی عفونت، این روش‌ها به سرعت در حال پیشرفت می‌باشند(20). انتخاب ناحیه مناسب برای تعیین توالی بر اساس هدف مورد نظر است. ناحیه NS5B با داشتن یک جایگاه (Motif) مخصوص ساب تیپ بهترین ناحیه ژنوم ویروس برای توالی‌یابی در مطالعه‌های اپیدمیولوژی معرفی شده است(22، 21).
امروزه سلامت خون از نظر عفونت HCV با به کارگیری رویکرد چند لایه‌ای از جمله غربالگری خون‌های اهدایی با انجام آزمایش‌های تشخیص عفونت HCV با استفاده از کیت‌های دارای حساسیت مناسب افزایش یافته است(24, 23). تعیین ژنوتیپ‌های شایعHCV و اطلاع از چگونگی الگو، توزیع و تنوع ژنوتیپ ویروس و شناسایی موارد جدید ژنوتیپ/ساب‌تیپ آن، نقش مهمی را در روند انتخاب کیت‌های مناسب غربالگری اهداکنندگان جهت عفونت HCV ایفا می‌نماید. این پژوهش با هدف بررسی تغییر در الگوی ژنوتیپ‌های HCV از نظر نوع ژنوتیپ و فراوانی آن‌ها در اهداکنندگان ایرانی انجام پذیرفت.
مواد و روش‌ها
برابر استانداردهای سازمان انتقال خون ایران، اهداکنندگانی که نتیجه آزمایش تأییدی آن‌ها در آزمایش غربالگری جهت ویروس HCV مثبت باشد، جهت مشاوره و بررسی مجدد به مرکز خونگیری مربوطه فراخوان می‌شوند و علاوه بر مشاوره، از هر نفر یک نمونه خون دریافت می‌گردد.
در این مطالعه مقطعی، 239 اهداکننده دارای نتیجه مثبت در آزمایش تأییدی جهت ویروسHCV ، که از آذر ماه سال 1394 تا خرداد ماه 1396 به فراخوان و شرکت در پژوهش پاسخ مثبت داده و به مراکز انتقال خون برگشته بودند، مورد بررسی قرارگرفتند. لازم به ذکر است که این اهداکنندگان در سایر آزمایش‌های غربالگری دارای نتیجه منفی بودند. هم‌زمان با مراجعه اهداکنندگان به مراکز انتقال خون در سراسر کشور، از افراد مایل به شرکت در این پژوهش، هنگام خونگیری یک نمونه خون اضافی جهت اجرای این طرح در لوله ژل‌دار دریافت گردید. نمونه ها پس ازجمع آوری در فاصله زمانی30 دقیقه تا 2 ساعت در 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه، سانتریفوژ وپس از آن به مدت دو ساعت در یخچال 8-2 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد و سپس در فریزر 70- درجه سانتی‌گراد ذخیره گردید. نمونه‌های خون در شرایط انجماد و اطلاعات دموگرافیک جمع‌آوری شده همراه با نامه رسمی از پایگاه‌های سراسر کشور، به محل استقرار تیم تحقیقاتی ارسال گردید. پس از دریافت نمونه‌ها، نمونه‌هایی که واجد شرایط انجام آزمایش‌های مولکولی بودند (نظیر عدم همولیز، لخته نبودن، انجام سانتریفوژ پس از دریافت خون، نمونه‌گیری در لوله ژل‌دار، حجم نمونه مناسب و یا مخدوش نبودن اطلاعات ثبت شده روی لوله)، تا قبل از جداسـازی سـرم آن‌هـا در فریـزر 70- درجــه سانتی‌گراد
نگهداری شدند.
استخراج RNA و تکثیر HCV RNA :
این واکنش با استفاده از محلول Rnasol و سایر محلول‌های آماده شده در سازمان انتقال خون ایران، مطابق دستورالعمل سازنده انجام شد. به طور کلی همان گونه که قبلاً ذکر شد، روش استاندارد و مرجع در مطالعه‌های همه‌گیر شناسی برای تعیین ژنوتیپ HCV ، تعیین توالی ناحیه NS5B و به دنبال آن آنالیز فیلوژنتیک است (25، 19). تهیه نمونه جهت تعیین توالی، با روش Semi-nested PCR و با استفاده از محلول‌های تهیه شده در سازمان انتقال خون ایران انجام پذیرفت. برای انجام روشSemi-nested PCR ، ابتدا از RNA استخراج شده با استفاده از آغازگر رفت، cDNA ساخته و سپس آزمایش Semi-nested PCR انجام شد. در مرحله اول Semi-nested PCR با استفاده از cDNA ساخته شده و آغازگرهای رفت و برگشت، یک قطعه 388 جفت بازی و در مرحله دوم Semi-nested PCR با استفاده از محصول واکنش مرحله اول Semi-nested PCR و آغازگرهای رفت و برگشت، یک قطعه 380 جفت بازی مربوط به بازهای 8636-8256 ژنوم ویروس HCV تکثیر شد (26).
تعیین ژنوتیپ HCV :
الف ـ تعیین توالی:
محصول واکنش مرحله دوم Semi-nested PCR به همراه آغازگرهای همان مرحله، جهت تعیین توالی دو طرفه ارسال و نتایج بعد از چند روز دریافت و توسط نرم‌افزار کروماس استخراج و در فرمتFASTA ذخیره گردید.
ب ـ بررسی توالی‌ها در سایت :NCBI
یکی از بزرگترین سایت‌های مورد استفاده در مطالعه‌های بیوانفورماتیک، سایت NCBI به آدرس اینترنتی http://ncbi-nlm.nih.gov می‌باشد. تمامی داده‌های حاصل از تعیین توالی برای هر دو طرف با استفاده از نرم افزار Blast جهت تعیین ژنوتیپ اولیه مورد بررسی قرار گرفت.
ج ـ ویرایش توالی‌ها:
برای ویرایش توالی‌ها از نرم‌افزارBeckman Coulter CEQ 8000 DNA Sequencer استفاده شد و توالی‌های ویرایش شده در فرمت seq ذخیره شدند.
د- هم‌تراز کردن توالی‌ها:
جهت تشخیص و تأیید دقیق ژنوتیپ نمونه‌ها، توالی‌های ویرایش شده نمونه‌های به دست آمده در این مطالعه با قسمتی از ناحیه NS5B ژنوم HCV (بازهای ناحیه 8636 – 8256) توالی‌های مرجع از 7 ژنوتیپ و 86 ساب‌تیپ مربوطه که به صورت کامل از مارس 2018 در سایت http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp قابل دسترسی و استخراج بود، با استفاده از نرم‌افزار Clustal W مقایسه و هم‌تراز شدند(جدول 1).
جدول 1: ژنوتیپ و ساب‌تیپ‌های مرجع از 7 ژنوتیپ و 86 ساب‌تیپ مربوطه
.jpg)
هـ- رسم درخت فیلوژنتیکی:
با استفاده از نرم‌افزار 7 Mega و روش Maximumlikelihood مدل Jukes-Cantor از توالی‌های هم‌تراز شده برای رسم درخت فیلوژنتیکی و تعیین نهایی ساب‌تیپ‌های HCV استفاده شد(27).
و- ثبت ژن‌های تعیین توالی شده در بانک جهانی:
توالی‌های به دست آمده که طول آن‌ها حداقل bp 200 بود، از طریق نرم‌افزارSequin به بانک جهانی ژن در آمریکا ارسال شد و پس از تأیید آن مرکز، به آن‌ها شماره‌های دسترسی MG704794- MG704694اختصاص داده شد.
تجزیه و تحلیل آماری:
برای تجزیه و تحلیل داده‌های حاصل از پژوهش از نرم‌افزار آماری(College Station TX ، STATA Crop ، STATA 13) استفاده شد. اطلاعات توصیفی به صورت میانگین ± انحراف معیار در متغیرهای کمی و یا فراوانی (درصد) در متغیرهای کیفی بیان شد.
رعایت نکات اخلاقی:
این مطالعه توسط کمیته اخلاق مؤسسه علمی- پژوهشی طب انتقال خون با کد IR.TMI.REC.1394.1800 مورد تصویب قرار گرفت.
یافته‌ها
239 اهداکننده در این مطالعه شرکت کردند. میانگین سنی آن‌ها 74/8 ± 58/37 سال بود. اکثریت شرکت‌کنندگان را مردان تشکیل می‌دادند (233، 49/98%). متأهلین بیشتربن فراوانی را داشتند(179، 75%). بیشتر شرکت‌کنندگان دارای تحصیلات زیر دیپلم بودند (67/60%). از 239 نمونه خون جمع‌آوری شده، 106 نمونه (3/6% ± 35/44%) دارای نتیجه مثبت(باند 380 جفت بازی) در آزمایش Semi nested PCR و نمونه مورد نیاز برای تعیین ژنوتیپ با روش توالی‌یابی بودند(شکل‌های 1 و 2).
شکل 1: نتیجه الکتروفورز مرحله دوم آزمایش Semi nested PCR چند نمونه اهداکننده و کنترل‌ها.
در این شکل کنترل منفی مرحله اول آزمایش Semi Semi nested PCR به صورت NC1 ، کنترل منفی مرحله دوم آزمایش Semi Semi nested PCR به صورت NC2 کنترل مثبت به صورت PC و نمونه‌ها با علامت S و شماره نشان داده شده است.
ژنوتیپ HCV در تمامی 106 نمونه تعیین شد. درخت فیلوژنتیکی 121 توالی مرجع از 86 ساب تیپ HCV و نمونه‌های اهداکنندگان این مطالعه در شکل داده شده است(شکل 3). تمامی نمونه‌های اهداکنندگان در سه گروه ژنوتیپa 3،a 1 و b1 قرار گرفتند. به منظور وضوح بیشتر، درخت فیلوژنتیکی توالی‌های مرجع این سه ژنوتیپ و نمونه‌های اهداکنندگان این مطالعه، با روش ذکر شده در بالا رسم شده است(شکل 4).
همان طور که در دو شکل 2 و 3 نمایش داده شده است، تمامی توالی‌های مربوط به ژنوتیپ‌هـای 1a،1b و 3a کـه در این مطالعه به دست آمد، در کلاسترهای جداگانه مربوط به هر ژنوتیپ قرار گرفتند. ژنوتیپ a 3 در 65 نمونه(6/9% ± 3/61%) دارای بیشترین فراوانی بود و پس از آن ژنوتیپ a 1 در 31 نمونه (1/9% ± 3/29%) و ژنوتیپ b 1 در 10 نمونه (1/6% ± 4/9%) گزارش شد.
شکل 2: نتیجه الکتروفورز آزمایش مرحله دوم Semi nested PCR یک نمونه به عنوان کنترل مثبت به همراه شاخص تعیین اندازه DNA. در این شکل باند 380 جفت بازی مربوط به بازهای شماره 8636 – 8256 منطقه ژنوم ویروس نشان داده شده است.
شکل 3 درخت فیلوژنتیکی نمونه‌های اهداکنندگان و 121 توالی مرجع ژنوتیپ HCV . روی دندروگرام توالی‌های بررسی شده در این مطالعه به صورت FR و ژنوتیپ 1a با علامت دایره توپر ژنوتیپ 1b با علامت مربع توپر و ژنوتیپ 3a با علامت مثلث توپر، توالی‌های مرجع این سه ژنوتیپ‌ها با علامت لوزی توپر و شماره دسترسی و سایر ژنوتیپ‌ها با شماره دسترسی مشخص شده است.
شکل 4 : درخت فیلوژنتیکی نمونه‌های اهداکنندگان و توالی‌های مرجع سه ژنوتیپ HCV . روی دندروگرام، توالی‌های بررسی شده در این مطالعه به صورت FR و ژنوتیپ 1a با علامت دایره توپر ژنوتیپ 1b با علامت مربع توپر، ژنوتیپ 3a با علامت مثلث توپر و توالی‌های مرجع ژنوتیپ‌ها با علامت مرتبط و شماره دسترسی مشخص شده است.
بحث
مطالعه‌های تعیین ژنوتیپ با فواصل زمانی مشخص بر روی اهداکنندگان توصیه می‌شود تا ورود ژنوتیپ/ ساب‌تیپ جدید و یا هرگونه تغییر در توزیع ژنوتیپ‌ها در جامعه را مشخص نماید(17, 13). بر اساس آنالیز فیلوژنتیک انجام شده، ساب‌تیپ‌های رایج در بین اهداکنندگان ایران شامل a3 ، a1 و b1 بود که در سه کلاستر بزرگ مربوط به هر ساب‌تیپ قرار گرفتند. ساب‌تیپ a3 با فراوانی 32/61% ساب‌تیپ غالب بود و پس از آن ساب تیپ‌های a1 با فراوانی 25/29% و b1 با فراوانی43/9% قرار داشتند. سه ساب‌تیپ a1، b1 و a3 که در این مطالعه به عنوان ساب‌تیپ‌های رایج در اهداکنندگان ایران شناخته شدند، در بررسی یک دهه قبل شریفی و همکاران روی 103 اهداکننده خون از سراسر کشور با تفاوت در فراوانی از ساب‌تیپ‌های رایج در اهداکنندگان گـزارش شدنـد، بـه گونه‌ای که ساب‌تیـپ a1 بـا فـراوانی
5/51% ساب‌تیپ غالب بود و پس از آن ساب‌تیپ‌های a3 با فراوانی 9/37% و b 1 با فراوانی 9/3% قرار داشتند(28). به نظر می‌رسد در الگوی ژنوتیپ(نوع ژنوتیپ) تغییری نسبت به دهه قبل به وجود نیامده است. در مقایسه بین نتایج این دو مطالعه، کاهش در فراوانی ژنوتیپ a 1 و افزایش در فراوانی ژنوتیپ‌های a3 و b 1 به چشم می‌خورد. روند تغییر در ژنوتیپ غالب در جمعیت بیماران در ایران در مطالعه‌های قبلی نشان داده شده است. مطالعه جهان بخش سفیدی و همکاران در سال 2013 روی 1561 بیمار هپاتیت مزمن که طی سال‌های 2013-2011 به بیمارستان‌های وابسته به دانشگاه علوم پزشکی تهران و مرکز تحقیقات بقیه‌اله مراجعه کرده و با روش RFLP تعیین ژنوتیپ شده بودند، بیانگر شایع بودن ژنوتیپ a1 با فراوانی6/44%، a3 با فراوانی6/39% و b1 با فراوانی 5/2% بود. در این مطالعه در حال تغییر بودن توزیع ژنوتیپ‌ها در بیماران با افزایش در فراوانی ژنوتیپ‌های a3 و 4 و کاهش در فراوانی ژنوتیپ‌های a1 وb1 گزارش شد(29). مرور سازمان یافته و فراتحلیل انجام شده توسط خدابنده‌لو و همکاران در سال 2014 بر روی 53 مقاله منتشر شده در سال‌های 2014-1999 درخصوص وضعیت ژنوتیپ HCV
در ایران نشان داد که به طور کلی ژنوتیپ‌های a 1 با فراوانی 39%، a 3 با فراوانی32% و b 1 با فراوانی 13%، شایع ترین ژنوتیپ‌ها در ایران بودند که در استان‌های مختلف فراوانی آن‌ها تفاوت داشت. این مطالعه هم‌چنین نشان داد که فراوانی ژنوتیپ‌ها در طول زمان دستخوش تغییر بوده و افزایش در فراوانی ژنوتیپ a3 و رسیدن آن به بالاترین میزان آن نسبت به قبل مشاهده شده است(14). در مرور سازمان یافته و فراتحلیل انجام شده اخیر در سال 2018 توسط محمود و همکاران در کشورهای حوزه خاورمیانه و شمال آفریقا، ژنوتیپ 1 ژنوتیپ غالب در اکثر کشورهای مورد بررسی از جمله ایران و ژنوتیپ 3 ژنوتیپ غالب در کشورهای افغانستان و پاکستان بود. بر طبق این بررسی اگر چه ژنوتیپ 3 در افغانستان و پاکستان ژنوتیپ غالب بود ولی در بعضی مناطق در ایران نیز ژنوتیپ غالب ژنوتیپ 3 اعلام شد و به طور کلی وجود تغییر در توزیع ژنوتیپ‌ها در ایران به سمت غالب بودن ژنوتیپ 3 مورد تأیید قرار گرفت(30). در مطالعه حاضر الگوی ژنوتیپ شبیه کشورهای همسایه شرقی(پاکستان و افغانستان) و کشورهای آسیای دور مانند نپال است و با الگوی رایج در کشورهای غربی و حتی خاورمیانه که در آن‌ها ژنوتیپ غالب 1 می‌باشد تفاوت دارد. تداخل توالی‌های ویروس بین ایران وکشورهای همسایه شرقی می‌تواند یکی از دلایل تغییر در الگوی ژنوتیپ(فراوانی ژنوتیپ) به سمت غالب بودن ژنوتیپ a3 که ژنوتیپ غالب در آن کشورها است، به حساب آید. از طرفی تغییر در توزیع ژنوتیپ‌ها می‌تواند بیانگر تغییر در همه‌گیرشناسی HCV به دلیل عوامل خطرساز عفونت HCV در جمعیت باشد. به نظر می‌رسد به دلیل افزایش در سلامت خون و توسعه بهداشت در مداخلات پزشکی و جایگزین شدن نقش آن‌ها توسط IDU به عنوان اصلی‌ترین عامل خطرساز عفونت، می‌تواند دلیل احتمالی دیگر تغییر در توزیع ژنوتیپ به نفع ژنوتیپ مرتبط با IDU به صورت شایع شدن ژنوتیپ‌هایی که قبلاً شایع نبوده و یا شیوع آن کم بوده است باشد. به طور کلی در بیشتر مناطق جهان و از جمله ایران ژنوتیپ 3a، ژنوتیپ مرتبط با IDU اعلام شده است(34-31، 13). تغییر در توزیع ژنوتیپ به نفع ژنوتیپ مرتبط با IDU در بسیاری از کشورها پیشنهاد شده است. این پدیده در کشورهای اروپایی مانند فرانسه، ایتالیا، اسپانیا، لهستان و هلند به صورت تغییر از ژنوتیپ b1 و 2 به ژنوتیپ a3 و در شرق آسیا در کشورهایی نظیر چین به صورت تغییر از ژنوتیپ‌هایb 1 و a2 به ژنوتیپ‌های 3 و 6 و ژاپن از b1 به b2 گزارش شده است(45-35). در پاکستان افزایش در فراوانی ژنوتیپ a3 دیده شده است(47, 46). نشان داده شده است که در ایران ساب‌تیپ a1، ساب‌تیپ غالب در میان دریافت‌کنندگان خون و فرآورده‌های آن است(50-48). افزایش سلامت خون در سال‌های اخیر می‌تواند کاهش مشاهده شده در ژنوتیپ a1 در این مطالعه را توضیح دهد.
در این پژوهش با استفاده از روش تعیین توالی قسمتی از ناحیه NS5B ژنوم HCV و رسم درخت فیلوژنتیک، در 106 اهداکننده، ژنوتیپ قابل تعیین بود. پایین بودن بار ویروس می‌تواند یکی از دلایل غیرقابل تعیین بودن ژنوتیپ در بقیه موارد باشد. علاوه بر این با توجه به این که ناحیه NS5B ژنوم HCV کاملاً حفاظت شده نیست، وجود جهش‌های فراوان در این ناحیه و عدم وجود شباهت بین توالی نمونه‌ها با آغازگرهای استفاده شده که باعث انجام نشدن واکنش Semi nested PCR با وجود بالا بودن بار ویروس می‌شود، می‌تواند دلیل دیگر غیر قابل تعیین بودن ژنوتیپ به ویژه در مواردی که بار ویروس بالا است، باشد.
نتیجه‌گیری
به نظر می‌رسد تغییر در اپیدمیولوژی مولکولی عفونت HCV در اهداکنندگان آلوده به این ویروس در ایران، به صورت کاهش در فراوانی ژنوتیپ a1 و افزایش در فراوانی ژنوتیپ‌های a3 و b1 باشد که در دهه قبل رخ داده است. با توجه به شیوع بالای ژنوتیپ a3 در اهداکنندگان، بررسی ارتباط بین ژنوتیپ ویروسHCV و عوامل خطرساز آن و نیز بررسی فیلوژنتیک HCV در اهداکنندگان برای شناسایی راه انتقال و منشأ ویروس با ژنوتیپ a3 و جهش‌های احتمالی موجود در توالی ژنوم ویروس، توصیه می‌شود. هم چنین با توجه به نیاز به بررسی مرتب و منظم تعیین ژنوتیپ در اهداکنندگان برای افزایش سلامتی خون، پیشنهاد می‌شود هنگام فراخوان اهداکنندگان و انجام مشاوره، از ایشان نمونه‌گیری به عمل آمده و ذخیره گردد تا نمونه مورد نیاز جهت بررسی‌های آزمایشگاهی نظیر تعیین ژنوتیپ در فواصل زمانی منظم در اختیار باشد.
تشکر و قدردانی
این مقاله منتج از پایان نامه دانشجویی دکترای
تخصصی- پژوهشی در مؤسسـه عـالی آموزشـی و پژوهشـی طـب انتقـال خـون می باشد. بدین وسیله از این مؤسسه به خاطر پشتیبانی‌های مادی و معنوی تقدیر و تشکر به عمل می‌آید. هم چنین نویسندگان مقاله مراتب قدردانی خود را از تمام همکاران در پایگاه‌های انتقال خون سراسر کشورکه در جمع‌آوری و ارسال نمونه و پی‌گیری‌های مربوطه از هیچ‌گونه کمکی دریغ ننمودند و نیز از همکاران بخش کیت‌سازی سازمان به دلیل پشتیبانی‌های فنی اعلام می‌دارند.
متن کامل: (2456 مشاهده)
به روز رسانی ژنوتیپ‌های شایع ویروس هپاتیت C در اهداکنندگان خون ایران
فهیمه رنجبر کرمانی1، صدیقه امینی کافی‌آباد2، کامران موسوی حسینی3، مهتاب مقصودلو4،
زهره شریفی5
چکیده
سابقه و هدف
عفونت با ویروس هپاتیتC (HCV)، یکی از عوامل اصلی بیماری مزمن کبدی در سراسر جهان است.HCV یک ویروس انتقال یابنده از طریق خون و در نتیجه تهدیدی جدی برای سلامت عمومی است. تعیین ژنوتیپ‌های HCV نقش مهمی را در بررسی راه‌های انتقال عفونت ایفا می‌نماید. این پژوهش با هدف بررسی وجود تغییر در الگوی ژنوتیپ‌هایHCV در اهداکنندگان ایرانی انجام پذیرفت.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه مقطعی از آذر ماه سال 1394 تا خرداد ماه 1396، 239 اهداکننده از سراسر کشور که دارای نتیجه مثبت در آزمایش تأییدی ویروسHCV بودند، مورد بررسی قرارگرفتند. از روش Semi nested PCR جهت تکثیر قسمتی از ناحیه NS5B ژنوم ویروس استفاده شد. محصول PCR، توالی‌یابی و ژنوتیپ HCVبا استفاده از نرم‌افزار(BLAST) Basic Local Alignment Search Tool تعیین شد. با استفاده از رسم درخت فیلوژنتیک، ژنوتیپ‌ها تأیید شدند. برای تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم‌افزار آماری 13 STATA استفاده شد.
یافته‌ها
از 239 شرکت‌کننده، در 106 فرد(3/6% ± 35/44%) ژنوتیپ تعیین و تأیید شد. در درخت فیلوژنتیک، تمامی توالی‌های مورد مطالعه، 3 کلاستر جداگانه تشکیل دادند. سه ژنوتیپ 3a ، 1a و 1b به ترتیب ژنوتیپ‌های رایج در اهداکنندگان ایران بودند.
نتیجه گیری
به نظر می‌رسد طی دهه گذشته، اپیدمیولوژی مولکولی عفونت HCV در اهداکنندگان ایران از نظر تنوع ژنوتیپ تغییری نداشته است ولی تغییر در فراوانی ژنوتیپ‌ها و در نتیجه جابه‌جایی ژنوتیپ شایع 1a توسط ژنوتیپ 3a رخ داده است.
کلمات کلیدی: هپاتیت C ، ژنوتیپ، اهداکنندگان خون
تاریخ دریافت: 3/6/98
تاریخ پذیرش: 2/9/98
1- دکترای تخصصی خون‌شناسی آزمایشگاهی و انتقال خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: متخصص آسیب‌شناسی تشریحی و بالینی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- دکترای تخصصی شیمی دارویی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4- متخصص پزشکی اجتماعی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
5- دکترای تخصصی ویروس‌شناسی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
فهیمه رنجبر کرمانی1، صدیقه امینی کافی‌آباد2، کامران موسوی حسینی3، مهتاب مقصودلو4،
زهره شریفی5
چکیده
سابقه و هدف
عفونت با ویروس هپاتیتC (HCV)، یکی از عوامل اصلی بیماری مزمن کبدی در سراسر جهان است.HCV یک ویروس انتقال یابنده از طریق خون و در نتیجه تهدیدی جدی برای سلامت عمومی است. تعیین ژنوتیپ‌های HCV نقش مهمی را در بررسی راه‌های انتقال عفونت ایفا می‌نماید. این پژوهش با هدف بررسی وجود تغییر در الگوی ژنوتیپ‌هایHCV در اهداکنندگان ایرانی انجام پذیرفت.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه مقطعی از آذر ماه سال 1394 تا خرداد ماه 1396، 239 اهداکننده از سراسر کشور که دارای نتیجه مثبت در آزمایش تأییدی ویروسHCV بودند، مورد بررسی قرارگرفتند. از روش Semi nested PCR جهت تکثیر قسمتی از ناحیه NS5B ژنوم ویروس استفاده شد. محصول PCR، توالی‌یابی و ژنوتیپ HCVبا استفاده از نرم‌افزار(BLAST) Basic Local Alignment Search Tool تعیین شد. با استفاده از رسم درخت فیلوژنتیک، ژنوتیپ‌ها تأیید شدند. برای تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم‌افزار آماری 13 STATA استفاده شد.
یافته‌ها
از 239 شرکت‌کننده، در 106 فرد(3/6% ± 35/44%) ژنوتیپ تعیین و تأیید شد. در درخت فیلوژنتیک، تمامی توالی‌های مورد مطالعه، 3 کلاستر جداگانه تشکیل دادند. سه ژنوتیپ 3a ، 1a و 1b به ترتیب ژنوتیپ‌های رایج در اهداکنندگان ایران بودند.
نتیجه گیری
به نظر می‌رسد طی دهه گذشته، اپیدمیولوژی مولکولی عفونت HCV در اهداکنندگان ایران از نظر تنوع ژنوتیپ تغییری نداشته است ولی تغییر در فراوانی ژنوتیپ‌ها و در نتیجه جابه‌جایی ژنوتیپ شایع 1a توسط ژنوتیپ 3a رخ داده است.
کلمات کلیدی: هپاتیت C ، ژنوتیپ، اهداکنندگان خون
تاریخ دریافت: 3/6/98
تاریخ پذیرش: 2/9/98
1- دکترای تخصصی خون‌شناسی آزمایشگاهی و انتقال خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: متخصص آسیب‌شناسی تشریحی و بالینی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- دکترای تخصصی شیمی دارویی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4- متخصص پزشکی اجتماعی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
5- دکترای تخصصی ویروس‌شناسی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه
عفونت با ویروس هپاتیت C (HCV) مشکل سلامت عمومی و یکی از عوامل اصلی بیماری مزمن کبدی در سراسر جهان و به طور خاص یکی از عوامل مهم ناخوشی و مرگ و میر در کشورهای در حال توسعه است. شایع‌ترین راه انتقال ویروس، تماس با خون آلوده است که از راه‌های مختلفی نظیر استفاده تزریقی مواد مخدر(Intravenous drug use: IDU)، مراقبت‌های درمانی غیر بهداشتی و دریافت خون و فرآورده‌های خونی غربالگری نشده امکان‌پذیر می‌باشد(2، 1). در کشورهای پیشرفته، IDU و در کشورهای در حال توسعه، قبل از به کارگیری روش‌های غربالگری ویروسHCV در اهداکنندگان، انتقال خون هم‌چنان یکی از راه‌های اصلی انتقال عفونت است. در کشورهای در حال توسعه که از غربالگری اهداکنندگان استفاده می‌کنند، عوامل مرتبط با اقدامات بیمارستانی، مراقبت‌های بهداشتی(Nosocomial) نظیر بستری شدن در بیمارستان و تزریق وریدی- عضلانی-زیرپوستی دارو، از راه های اصلی انتقال عفونت شناخته شده‌اند(4، 3، 1). در ایران IDU ، استفاده غیر تزریقی مواد مخدر، مجروحیت جنگی، زندگی با فرد IDU، داشتن سابقه زندان، استفاده از تیغ مشترک، اقدامات پزشکی و دندانپزشکی، اهدای بار اول، سطح پایین تحصیلات، جنسیت مرد و متأهل بودن از جمله عوامل خطرساز در انتقال عفونت و ساب تیپ‌های 1a، 3a و 1b شایع‌ترین ژنوتیپ‌های HCV گزارش شده‌اند(9-5).
انباشت جهش‌های ایجاد شده در ویروس، منجر به ایجاد زیر گروه‌ها یا ساب‌تیپ‌ها و در نهایت تنوع در ژنوم یا ژنوتیپ ویروس می‌شود. در حال حاضر، با استفاده از تحلیل فیلوژنتیکی ویروس HCV ، 7 ژنوتیپ اصلی با تفاوت توالی بیش از 30% و 86 ساب‌تیپ با تفاوت توالی 30%-15% شناسایی شده است(11، 10). شیوع ژنوتیپ‌های مختلف و توزیع آن‌ها با منطقه جغرافیایی مرتبط می‌باشد. بررسی‌های متعدد درخصوص توزیع جهانی ژنوتیپ، حاکی از این است که به طور کلی ترتیب شیوع ژنوتیپ‌ها به صورت ژنوتیپ‌های 1 ، 3 ، 4 ، 2 ، 6 و 5 می‌باشند. ژنوتیپ‌های 1، 2 و 3 در آمریکـا، اروپـا، ژاپـن، استرالیـا و
نیوزیلند، ژنوتیپ 4 در آفریقای شمالی و خاورمیانه، ژنوتیپ 5 در آفریقای جنوبی و ژنوتیپ 6 در آسیای جنوب شرقی شایع می‌باشند(13، 12). بررسی‌های انجام شده در ایران بیانگر شایع بودن ساب‌تیپ‌های 1a ، 3a و 1bدر نقاط مختلف کشور و با فراوانی‌های متفاوت است(16-14). تعیین ژنوتیپ برای شناسایی ژنوتیپ/ ساب‌تیپ‌های جدید اهمیت فراوانی دارد(17). به نظر می‌رسد هر گونه تغییر در توزیع ژنوتیپ می‌تواند بیانگر تغییر احتمالی در عواملی نظیر راه انتقال عفونت، تغییر در وضعیت بهداشت جامعه و سبک زندگی آن جامعه باشد که در مناطق جغرافیایی مختلف با یکدیگر تفاوت دارد.
روش‌های مولکولی رایج جهت تعیین ژنوتیپ به طور کلی شامل روش تشخیص چند شکلی طول قطعات حاصل از برش (RFLP: Restriction fragment length polymorphism)، تکثیر با آغازگرهای اختصاصی(Primer specific) هر ژنوتیپ، دو رگه‌سازی محصول تکثیر با پروب اختصاصی(Hybridization with specific probes)، تجزیه و تحلیل منحنی ذوب(Melting curve analysis) و توالی‌یابی(Sequencing) نواحی مختلف ژنوم ویروس است(18). روش استاندارد طلایی(Gold standard) برای تعیین ژنوتیپ ویروس، روش توالی‌یابی ژنوم در نواحی Core/E و NS5B ژنوم ویروس است(19). در حال حاضر با توجه به اهمیت تعیین ژنوتیپ با روش توالی‌یابی ژنوم ویروس در بررسی‌های اپیدمیولوژی و بالینی عفونت، این روش‌ها به سرعت در حال پیشرفت می‌باشند(20). انتخاب ناحیه مناسب برای تعیین توالی بر اساس هدف مورد نظر است. ناحیه NS5B با داشتن یک جایگاه (Motif) مخصوص ساب تیپ بهترین ناحیه ژنوم ویروس برای توالی‌یابی در مطالعه‌های اپیدمیولوژی معرفی شده است(22، 21).
امروزه سلامت خون از نظر عفونت HCV با به کارگیری رویکرد چند لایه‌ای از جمله غربالگری خون‌های اهدایی با انجام آزمایش‌های تشخیص عفونت HCV با استفاده از کیت‌های دارای حساسیت مناسب افزایش یافته است(24, 23). تعیین ژنوتیپ‌های شایعHCV و اطلاع از چگونگی الگو، توزیع و تنوع ژنوتیپ ویروس و شناسایی موارد جدید ژنوتیپ/ساب‌تیپ آن، نقش مهمی را در روند انتخاب کیت‌های مناسب غربالگری اهداکنندگان جهت عفونت HCV ایفا می‌نماید. این پژوهش با هدف بررسی تغییر در الگوی ژنوتیپ‌های HCV از نظر نوع ژنوتیپ و فراوانی آن‌ها در اهداکنندگان ایرانی انجام پذیرفت.
مواد و روش‌ها
برابر استانداردهای سازمان انتقال خون ایران، اهداکنندگانی که نتیجه آزمایش تأییدی آن‌ها در آزمایش غربالگری جهت ویروس HCV مثبت باشد، جهت مشاوره و بررسی مجدد به مرکز خونگیری مربوطه فراخوان می‌شوند و علاوه بر مشاوره، از هر نفر یک نمونه خون دریافت می‌گردد.
در این مطالعه مقطعی، 239 اهداکننده دارای نتیجه مثبت در آزمایش تأییدی جهت ویروسHCV ، که از آذر ماه سال 1394 تا خرداد ماه 1396 به فراخوان و شرکت در پژوهش پاسخ مثبت داده و به مراکز انتقال خون برگشته بودند، مورد بررسی قرارگرفتند. لازم به ذکر است که این اهداکنندگان در سایر آزمایش‌های غربالگری دارای نتیجه منفی بودند. هم‌زمان با مراجعه اهداکنندگان به مراکز انتقال خون در سراسر کشور، از افراد مایل به شرکت در این پژوهش، هنگام خونگیری یک نمونه خون اضافی جهت اجرای این طرح در لوله ژل‌دار دریافت گردید. نمونه ها پس ازجمع آوری در فاصله زمانی30 دقیقه تا 2 ساعت در 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه، سانتریفوژ وپس از آن به مدت دو ساعت در یخچال 8-2 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد و سپس در فریزر 70- درجه سانتی‌گراد ذخیره گردید. نمونه‌های خون در شرایط انجماد و اطلاعات دموگرافیک جمع‌آوری شده همراه با نامه رسمی از پایگاه‌های سراسر کشور، به محل استقرار تیم تحقیقاتی ارسال گردید. پس از دریافت نمونه‌ها، نمونه‌هایی که واجد شرایط انجام آزمایش‌های مولکولی بودند (نظیر عدم همولیز، لخته نبودن، انجام سانتریفوژ پس از دریافت خون، نمونه‌گیری در لوله ژل‌دار، حجم نمونه مناسب و یا مخدوش نبودن اطلاعات ثبت شده روی لوله)، تا قبل از جداسـازی سـرم آن‌هـا در فریـزر 70- درجــه سانتی‌گراد
نگهداری شدند.
استخراج RNA و تکثیر HCV RNA :
این واکنش با استفاده از محلول Rnasol و سایر محلول‌های آماده شده در سازمان انتقال خون ایران، مطابق دستورالعمل سازنده انجام شد. به طور کلی همان گونه که قبلاً ذکر شد، روش استاندارد و مرجع در مطالعه‌های همه‌گیر شناسی برای تعیین ژنوتیپ HCV ، تعیین توالی ناحیه NS5B و به دنبال آن آنالیز فیلوژنتیک است (25، 19). تهیه نمونه جهت تعیین توالی، با روش Semi-nested PCR و با استفاده از محلول‌های تهیه شده در سازمان انتقال خون ایران انجام پذیرفت. برای انجام روشSemi-nested PCR ، ابتدا از RNA استخراج شده با استفاده از آغازگر رفت، cDNA ساخته و سپس آزمایش Semi-nested PCR انجام شد. در مرحله اول Semi-nested PCR با استفاده از cDNA ساخته شده و آغازگرهای رفت و برگشت، یک قطعه 388 جفت بازی و در مرحله دوم Semi-nested PCR با استفاده از محصول واکنش مرحله اول Semi-nested PCR و آغازگرهای رفت و برگشت، یک قطعه 380 جفت بازی مربوط به بازهای 8636-8256 ژنوم ویروس HCV تکثیر شد (26).
تعیین ژنوتیپ HCV :
الف ـ تعیین توالی:
محصول واکنش مرحله دوم Semi-nested PCR به همراه آغازگرهای همان مرحله، جهت تعیین توالی دو طرفه ارسال و نتایج بعد از چند روز دریافت و توسط نرم‌افزار کروماس استخراج و در فرمتFASTA ذخیره گردید.
ب ـ بررسی توالی‌ها در سایت :NCBI
یکی از بزرگترین سایت‌های مورد استفاده در مطالعه‌های بیوانفورماتیک، سایت NCBI به آدرس اینترنتی http://ncbi-nlm.nih.gov می‌باشد. تمامی داده‌های حاصل از تعیین توالی برای هر دو طرف با استفاده از نرم افزار Blast جهت تعیین ژنوتیپ اولیه مورد بررسی قرار گرفت.
ج ـ ویرایش توالی‌ها:
برای ویرایش توالی‌ها از نرم‌افزارBeckman Coulter CEQ 8000 DNA Sequencer استفاده شد و توالی‌های ویرایش شده در فرمت seq ذخیره شدند.
د- هم‌تراز کردن توالی‌ها:
جهت تشخیص و تأیید دقیق ژنوتیپ نمونه‌ها، توالی‌های ویرایش شده نمونه‌های به دست آمده در این مطالعه با قسمتی از ناحیه NS5B ژنوم HCV (بازهای ناحیه 8636 – 8256) توالی‌های مرجع از 7 ژنوتیپ و 86 ساب‌تیپ مربوطه که به صورت کامل از مارس 2018 در سایت http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp قابل دسترسی و استخراج بود، با استفاده از نرم‌افزار Clustal W مقایسه و هم‌تراز شدند(جدول 1).
جدول 1: ژنوتیپ و ساب‌تیپ‌های مرجع از 7 ژنوتیپ و 86 ساب‌تیپ مربوطه
هـ- رسم درخت فیلوژنتیکی:
با استفاده از نرم‌افزار 7 Mega و روش Maximumlikelihood مدل Jukes-Cantor از توالی‌های هم‌تراز شده برای رسم درخت فیلوژنتیکی و تعیین نهایی ساب‌تیپ‌های HCV استفاده شد(27).
و- ثبت ژن‌های تعیین توالی شده در بانک جهانی:
توالی‌های به دست آمده که طول آن‌ها حداقل bp 200 بود، از طریق نرم‌افزارSequin به بانک جهانی ژن در آمریکا ارسال شد و پس از تأیید آن مرکز، به آن‌ها شماره‌های دسترسی MG704794- MG704694اختصاص داده شد.
تجزیه و تحلیل آماری:
برای تجزیه و تحلیل داده‌های حاصل از پژوهش از نرم‌افزار آماری(College Station TX ، STATA Crop ، STATA 13) استفاده شد. اطلاعات توصیفی به صورت میانگین ± انحراف معیار در متغیرهای کمی و یا فراوانی (درصد) در متغیرهای کیفی بیان شد.
رعایت نکات اخلاقی:
این مطالعه توسط کمیته اخلاق مؤسسه علمی- پژوهشی طب انتقال خون با کد IR.TMI.REC.1394.1800 مورد تصویب قرار گرفت.
یافته‌ها
239 اهداکننده در این مطالعه شرکت کردند. میانگین سنی آن‌ها 74/8 ± 58/37 سال بود. اکثریت شرکت‌کنندگان را مردان تشکیل می‌دادند (233، 49/98%). متأهلین بیشتربن فراوانی را داشتند(179، 75%). بیشتر شرکت‌کنندگان دارای تحصیلات زیر دیپلم بودند (67/60%). از 239 نمونه خون جمع‌آوری شده، 106 نمونه (3/6% ± 35/44%) دارای نتیجه مثبت(باند 380 جفت بازی) در آزمایش Semi nested PCR و نمونه مورد نیاز برای تعیین ژنوتیپ با روش توالی‌یابی بودند(شکل‌های 1 و 2).
شکل 1: نتیجه الکتروفورز مرحله دوم آزمایش Semi nested PCR چند نمونه اهداکننده و کنترل‌ها.
در این شکل کنترل منفی مرحله اول آزمایش Semi Semi nested PCR به صورت NC1 ، کنترل منفی مرحله دوم آزمایش Semi Semi nested PCR به صورت NC2 کنترل مثبت به صورت PC و نمونه‌ها با علامت S و شماره نشان داده شده است.
ژنوتیپ HCV در تمامی 106 نمونه تعیین شد. درخت فیلوژنتیکی 121 توالی مرجع از 86 ساب تیپ HCV و نمونه‌های اهداکنندگان این مطالعه در شکل داده شده است(شکل 3). تمامی نمونه‌های اهداکنندگان در سه گروه ژنوتیپa 3،a 1 و b1 قرار گرفتند. به منظور وضوح بیشتر، درخت فیلوژنتیکی توالی‌های مرجع این سه ژنوتیپ و نمونه‌های اهداکنندگان این مطالعه، با روش ذکر شده در بالا رسم شده است(شکل 4).
همان طور که در دو شکل 2 و 3 نمایش داده شده است، تمامی توالی‌های مربوط به ژنوتیپ‌هـای 1a،1b و 3a کـه در این مطالعه به دست آمد، در کلاسترهای جداگانه مربوط به هر ژنوتیپ قرار گرفتند. ژنوتیپ a 3 در 65 نمونه(6/9% ± 3/61%) دارای بیشترین فراوانی بود و پس از آن ژنوتیپ a 1 در 31 نمونه (1/9% ± 3/29%) و ژنوتیپ b 1 در 10 نمونه (1/6% ± 4/9%) گزارش شد.
شکل 2: نتیجه الکتروفورز آزمایش مرحله دوم Semi nested PCR یک نمونه به عنوان کنترل مثبت به همراه شاخص تعیین اندازه DNA. در این شکل باند 380 جفت بازی مربوط به بازهای شماره 8636 – 8256 منطقه ژنوم ویروس نشان داده شده است.
شکل 3 درخت فیلوژنتیکی نمونه‌های اهداکنندگان و 121 توالی مرجع ژنوتیپ HCV . روی دندروگرام توالی‌های بررسی شده در این مطالعه به صورت FR و ژنوتیپ 1a با علامت دایره توپر ژنوتیپ 1b با علامت مربع توپر و ژنوتیپ 3a با علامت مثلث توپر، توالی‌های مرجع این سه ژنوتیپ‌ها با علامت لوزی توپر و شماره دسترسی و سایر ژنوتیپ‌ها با شماره دسترسی مشخص شده است.
شکل 4 : درخت فیلوژنتیکی نمونه‌های اهداکنندگان و توالی‌های مرجع سه ژنوتیپ HCV . روی دندروگرام، توالی‌های بررسی شده در این مطالعه به صورت FR و ژنوتیپ 1a با علامت دایره توپر ژنوتیپ 1b با علامت مربع توپر، ژنوتیپ 3a با علامت مثلث توپر و توالی‌های مرجع ژنوتیپ‌ها با علامت مرتبط و شماره دسترسی مشخص شده است.
بحث
مطالعه‌های تعیین ژنوتیپ با فواصل زمانی مشخص بر روی اهداکنندگان توصیه می‌شود تا ورود ژنوتیپ/ ساب‌تیپ جدید و یا هرگونه تغییر در توزیع ژنوتیپ‌ها در جامعه را مشخص نماید(17, 13). بر اساس آنالیز فیلوژنتیک انجام شده، ساب‌تیپ‌های رایج در بین اهداکنندگان ایران شامل a3 ، a1 و b1 بود که در سه کلاستر بزرگ مربوط به هر ساب‌تیپ قرار گرفتند. ساب‌تیپ a3 با فراوانی 32/61% ساب‌تیپ غالب بود و پس از آن ساب تیپ‌های a1 با فراوانی 25/29% و b1 با فراوانی43/9% قرار داشتند. سه ساب‌تیپ a1، b1 و a3 که در این مطالعه به عنوان ساب‌تیپ‌های رایج در اهداکنندگان ایران شناخته شدند، در بررسی یک دهه قبل شریفی و همکاران روی 103 اهداکننده خون از سراسر کشور با تفاوت در فراوانی از ساب‌تیپ‌های رایج در اهداکنندگان گـزارش شدنـد، بـه گونه‌ای که ساب‌تیـپ a1 بـا فـراوانی
5/51% ساب‌تیپ غالب بود و پس از آن ساب‌تیپ‌های a3 با فراوانی 9/37% و b 1 با فراوانی 9/3% قرار داشتند(28). به نظر می‌رسد در الگوی ژنوتیپ(نوع ژنوتیپ) تغییری نسبت به دهه قبل به وجود نیامده است. در مقایسه بین نتایج این دو مطالعه، کاهش در فراوانی ژنوتیپ a 1 و افزایش در فراوانی ژنوتیپ‌های a3 و b 1 به چشم می‌خورد. روند تغییر در ژنوتیپ غالب در جمعیت بیماران در ایران در مطالعه‌های قبلی نشان داده شده است. مطالعه جهان بخش سفیدی و همکاران در سال 2013 روی 1561 بیمار هپاتیت مزمن که طی سال‌های 2013-2011 به بیمارستان‌های وابسته به دانشگاه علوم پزشکی تهران و مرکز تحقیقات بقیه‌اله مراجعه کرده و با روش RFLP تعیین ژنوتیپ شده بودند، بیانگر شایع بودن ژنوتیپ a1 با فراوانی6/44%، a3 با فراوانی6/39% و b1 با فراوانی 5/2% بود. در این مطالعه در حال تغییر بودن توزیع ژنوتیپ‌ها در بیماران با افزایش در فراوانی ژنوتیپ‌های a3 و 4 و کاهش در فراوانی ژنوتیپ‌های a1 وb1 گزارش شد(29). مرور سازمان یافته و فراتحلیل انجام شده توسط خدابنده‌لو و همکاران در سال 2014 بر روی 53 مقاله منتشر شده در سال‌های 2014-1999 درخصوص وضعیت ژنوتیپ HCV
در ایران نشان داد که به طور کلی ژنوتیپ‌های a 1 با فراوانی 39%، a 3 با فراوانی32% و b 1 با فراوانی 13%، شایع ترین ژنوتیپ‌ها در ایران بودند که در استان‌های مختلف فراوانی آن‌ها تفاوت داشت. این مطالعه هم‌چنین نشان داد که فراوانی ژنوتیپ‌ها در طول زمان دستخوش تغییر بوده و افزایش در فراوانی ژنوتیپ a3 و رسیدن آن به بالاترین میزان آن نسبت به قبل مشاهده شده است(14). در مرور سازمان یافته و فراتحلیل انجام شده اخیر در سال 2018 توسط محمود و همکاران در کشورهای حوزه خاورمیانه و شمال آفریقا، ژنوتیپ 1 ژنوتیپ غالب در اکثر کشورهای مورد بررسی از جمله ایران و ژنوتیپ 3 ژنوتیپ غالب در کشورهای افغانستان و پاکستان بود. بر طبق این بررسی اگر چه ژنوتیپ 3 در افغانستان و پاکستان ژنوتیپ غالب بود ولی در بعضی مناطق در ایران نیز ژنوتیپ غالب ژنوتیپ 3 اعلام شد و به طور کلی وجود تغییر در توزیع ژنوتیپ‌ها در ایران به سمت غالب بودن ژنوتیپ 3 مورد تأیید قرار گرفت(30). در مطالعه حاضر الگوی ژنوتیپ شبیه کشورهای همسایه شرقی(پاکستان و افغانستان) و کشورهای آسیای دور مانند نپال است و با الگوی رایج در کشورهای غربی و حتی خاورمیانه که در آن‌ها ژنوتیپ غالب 1 می‌باشد تفاوت دارد. تداخل توالی‌های ویروس بین ایران وکشورهای همسایه شرقی می‌تواند یکی از دلایل تغییر در الگوی ژنوتیپ(فراوانی ژنوتیپ) به سمت غالب بودن ژنوتیپ a3 که ژنوتیپ غالب در آن کشورها است، به حساب آید. از طرفی تغییر در توزیع ژنوتیپ‌ها می‌تواند بیانگر تغییر در همه‌گیرشناسی HCV به دلیل عوامل خطرساز عفونت HCV در جمعیت باشد. به نظر می‌رسد به دلیل افزایش در سلامت خون و توسعه بهداشت در مداخلات پزشکی و جایگزین شدن نقش آن‌ها توسط IDU به عنوان اصلی‌ترین عامل خطرساز عفونت، می‌تواند دلیل احتمالی دیگر تغییر در توزیع ژنوتیپ به نفع ژنوتیپ مرتبط با IDU به صورت شایع شدن ژنوتیپ‌هایی که قبلاً شایع نبوده و یا شیوع آن کم بوده است باشد. به طور کلی در بیشتر مناطق جهان و از جمله ایران ژنوتیپ 3a، ژنوتیپ مرتبط با IDU اعلام شده است(34-31، 13). تغییر در توزیع ژنوتیپ به نفع ژنوتیپ مرتبط با IDU در بسیاری از کشورها پیشنهاد شده است. این پدیده در کشورهای اروپایی مانند فرانسه، ایتالیا، اسپانیا، لهستان و هلند به صورت تغییر از ژنوتیپ b1 و 2 به ژنوتیپ a3 و در شرق آسیا در کشورهایی نظیر چین به صورت تغییر از ژنوتیپ‌هایb 1 و a2 به ژنوتیپ‌های 3 و 6 و ژاپن از b1 به b2 گزارش شده است(45-35). در پاکستان افزایش در فراوانی ژنوتیپ a3 دیده شده است(47, 46). نشان داده شده است که در ایران ساب‌تیپ a1، ساب‌تیپ غالب در میان دریافت‌کنندگان خون و فرآورده‌های آن است(50-48). افزایش سلامت خون در سال‌های اخیر می‌تواند کاهش مشاهده شده در ژنوتیپ a1 در این مطالعه را توضیح دهد.
در این پژوهش با استفاده از روش تعیین توالی قسمتی از ناحیه NS5B ژنوم HCV و رسم درخت فیلوژنتیک، در 106 اهداکننده، ژنوتیپ قابل تعیین بود. پایین بودن بار ویروس می‌تواند یکی از دلایل غیرقابل تعیین بودن ژنوتیپ در بقیه موارد باشد. علاوه بر این با توجه به این که ناحیه NS5B ژنوم HCV کاملاً حفاظت شده نیست، وجود جهش‌های فراوان در این ناحیه و عدم وجود شباهت بین توالی نمونه‌ها با آغازگرهای استفاده شده که باعث انجام نشدن واکنش Semi nested PCR با وجود بالا بودن بار ویروس می‌شود، می‌تواند دلیل دیگر غیر قابل تعیین بودن ژنوتیپ به ویژه در مواردی که بار ویروس بالا است، باشد.
نتیجه‌گیری
به نظر می‌رسد تغییر در اپیدمیولوژی مولکولی عفونت HCV در اهداکنندگان آلوده به این ویروس در ایران، به صورت کاهش در فراوانی ژنوتیپ a1 و افزایش در فراوانی ژنوتیپ‌های a3 و b1 باشد که در دهه قبل رخ داده است. با توجه به شیوع بالای ژنوتیپ a3 در اهداکنندگان، بررسی ارتباط بین ژنوتیپ ویروسHCV و عوامل خطرساز آن و نیز بررسی فیلوژنتیک HCV در اهداکنندگان برای شناسایی راه انتقال و منشأ ویروس با ژنوتیپ a3 و جهش‌های احتمالی موجود در توالی ژنوم ویروس، توصیه می‌شود. هم چنین با توجه به نیاز به بررسی مرتب و منظم تعیین ژنوتیپ در اهداکنندگان برای افزایش سلامتی خون، پیشنهاد می‌شود هنگام فراخوان اهداکنندگان و انجام مشاوره، از ایشان نمونه‌گیری به عمل آمده و ذخیره گردد تا نمونه مورد نیاز جهت بررسی‌های آزمایشگاهی نظیر تعیین ژنوتیپ در فواصل زمانی منظم در اختیار باشد.
تشکر و قدردانی
این مقاله منتج از پایان نامه دانشجویی دکترای
تخصصی- پژوهشی در مؤسسـه عـالی آموزشـی و پژوهشـی طـب انتقـال خـون می باشد. بدین وسیله از این مؤسسه به خاطر پشتیبانی‌های مادی و معنوی تقدیر و تشکر به عمل می‌آید. هم چنین نویسندگان مقاله مراتب قدردانی خود را از تمام همکاران در پایگاه‌های انتقال خون سراسر کشورکه در جمع‌آوری و ارسال نمونه و پی‌گیری‌های مربوطه از هیچ‌گونه کمکی دریغ ننمودند و نیز از همکاران بخش کیت‌سازی سازمان به دلیل پشتیبانی‌های فنی اعلام می‌دارند.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
