چکیده سابقه و هدف روش هماگلوتیناسیون به دلیل حضور گلبول‌های قرمز اهداکننده در گردش خون بیمار دارای محدودیت‌هایی است که سبب میشود در تعیین صحیح فنوتیپ بیمارانی که به تازگی خون دریافت کرده‌اند، مشکل ایجاد شود. گروه خونی Kidd از جمله گروههای خونی است که در طب انتقال خون اهمیت ویژه‌ای دارد. آنتیبادیهای این سیستم مسئول یک سوم از واکنش‌های همولیتیک تأخیری ناشی از تزریق خون هستند. در این مطالعه از روشهای مولکولی برای تعیین آللهای گروه خونی Kidd در بیماران تالاسمی استفاده شد. مواد و روشها در یک مطالعه مقطعی ـ توصیفی، تعداد 100 بیمار تالاسمی دارای آلوآنتیبادی مراجعه‌کننده به درمانگاه تالاسمی تهران در سال 1396 مورد بررسی قرار گرفتند. فنوتیپ این نمونه‌ها با استفاده از آنتی‌بادی اختصاصی تعیین شد. برای تعیین ژنوتیپ از روشهای مولکولی PCR-SSP ، PCR-RFLP و تعیین توالی استفاده شد. یافته‌ها با مقایسه فنوتیپ و ژنوتیپ، 20 مورد ناسازگاری دراین بیماران دیده شد. به طوری که(55%) 11 بیمار دارای ژنوتیپ JkA/JkA و فنوتیپJk(a+ b+) ، (35%) 7 بیمار دارای ژنوتیپ JkB/JkB و فنوتیپJk(a+ b+) ، (5%)1بیمار دارای ژنوتیپ JkA/JkB و فنوتیپJk(a+ b-) و (5%)1 بیمار دارای ژنوتیپ JkA/JkB و فنوتیپJk(a- b+) بودند. نتیجه گیری استفاده از روشهای مولکولی به عنوان یک روش مکمل همراه با نتایج روشهای سرولوژی میتواند کمک شایانی برای حل مشکلات ناشی از تزریق خون و تعیین صحیح فنوتیپ گروههای خونی به خصوص در بیماران تالاسمی فراهم کند. کلمات کلیدی:ژنوتیپ، تالاسمی، گروههای خونی، فنوتیپ
تاریخ دریافت: 18/3/98 تاریخ پذیرش: 30/4/98
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 3- فوق تخصص هماتولوژی و انکولوژی کودکان ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 4- کارشناس ارشد ایمونولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 5- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه یکی از مهمترین عوارض تزریق خون، آلوایمیونیزاسیون بر علیه آنتیژنهای گلبول قرمز است(1). تزریق خون مطمئن، مهمترین نقش را در جلوگیری از آلوایمیونیزاسیون در بیماران تالاسمی ایفا میکند(2). برای سال‌های متمادی روش سرولوژی با استفاده از آنتیبادیهای منوکلونال به عنوان روشی استاندارد برای تعیین آنتیژنهای گلبول قرمز استفاده میشد(4، 3). تعیین فنوتیپ گروههای خونی با استفاده از روش سرولوژی در بیماران تالاسمی به دلیل حضور گلبول قرمز اهداکننده در گردش خون بیمار، آزمایش آنتی‌گلبولین مثبت(DAT) و آنتیبادیهای ناخواسته با مشکل مواجه میشود. با استفاده از روشهای مولکولی میتوان بر محدودیت‌های روش سرولوژی غلبه کرد و از این روش به عنوان روش مکمل استفاده نمود(5). از میان گروههای خونی که تاکنون شناخته شده، گروههای خونی Rh، Kell، Kidd و Duffy از جمله گروههای خونی هستند که از نظر بالینی مهم می‌باشند. سیستم گروه خونی Kidd از 3 آنتی‌ژن Jka، Jkb و Jk3 تشکیل شده است. پلی‌مورفیسم JKa/JKb ناشی از جایگزینی نوکلئوتید A<G 838 در اگزون 9است که منجر به جایگزینی اسیدآمینه Asp280Asn در سطح پروتئین میشود. هنگامی که اسید آمینه اسید آسپارتیک در جایگاه 280 حضور دارد، سبب ایجاد آنتی‌ژن JKa شده و در صورت وجود آسپارژین در این جایگاه، آنتی‌ژن JKb بیان میشود. فنوتیپ‌های این گروه خونی شامل JK(a+b-) ، JK(a+b+) ، JK(a-b-) ، JK(a-b+) است که در سیاهپوستان JK(a+ b-) و در سفیدپوستان JK (a+ b+) بیشترین فراوانی را دارند(7، 6). شناسایی این آنتی‌بادی‌ها نه تنها به دلیل این که معمولاً این آنتی‌بادی‌ها در سرم همراه با ترکیبی از سایر آلوآنتیبادیها وجود دارند، بلکه به دلیل این که اغلب این آنتی‌بادی‌ها به صورت ضعیف واکنش میدهند و همواره از قوانین پیروی نمیکنند، دشوار میباشد. آنتیبادیهای سیستم گروه خونی Kidd مسئول یک سوم از واکنش‌های همولیتیک تاخیری هستند(9، 8). تعیین صحیح آنتیژنهای سیستم گروه خونی Kidd اهمیت به سزایی در تزریق خون دارد. برای اولین بار در ایران تعیین ژنوتیپ آنتیژنهای گروه خونی Kidd با استفاده از روشهای مولکولی PCR-SSP، PCR-RFLP و تعیین توالی صورت گرفت. هدف از این مطالعه، مقایسه روش سرولوژی و مولکولی برای تعیین آنتیژنهای گروه خونی Kidd در بیماران تالاسمی دارای تزریق خون متعدد بود.
مواد و روشها این مطالعه از نوع مقطعی- توصیفی بود و از روش نمونه‌گیری غیر احتمالی آسان استفاده شد. برای بیان نتایج از روشهای آماری توصیفی استفاده گردید.
بیماران: 5 میلی‌لیتر خون EDTA دار از100 بیمار تالاسمی مراجعه‌کننده به درمانگاه تالاسمی تهران در سال 1396 جمع‌آوری شد. فرم رضایت‌نامه از بیماران گرفته شد. این مطالعه مورد تایید کمیته اخلاق مؤسسه طب انتقال خون با کد اخلاق IR.TMI.REC.1396.030 میباشد.
گروه کنترل: تعداد 10 اهداکننده سالم مراجعه‌کننده به سازمان انتقال خون به عنوان کنترل در نظر گرفته شدند. فنوتیپ و ژنوتیپ این بیماران تعیین شد و برای تایید نتایج، تعیین توالی انجام شد. از نمونه‌های کنترل جهت بهینه‌سازی راه‌اندازی روشهای مولکولی و به عنوان نمونه کنترل مثبت استفاده شد.
تعیین فنوتیپ با استفاده از روش سرولوژی: تعیین فنوتیپ آنتیژنهای Jka و Jkb با استفاده از آنتی‌بادی منوکلونال مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده با روش لوله‌ای انجام شد(Anti-JKb clone MS8 ، Anti-Jka clone MS15 ، آلمان، Immundiagnostika GmbH).
روش مولکولی: استخراج DNA : DNA ژنومی از بافیکوت نمونه‌ها با استفاده از کیت ستونی استخراج شد(یکتا تجهیز آزما، ایران) به منظور ارزیابی کیفیت DNA و آگاهی از میزان خلوص آن از دستگاه نانودراپ استفاده شد.
روش PCR-SSP : ژنوتیپ تمامی بیماران با استفاده از روش PCR-SSP تعیین شد. حضور پلی‌مورفیسم(G838A) بر روی اگزون 9 ژن گروه خونی Kidd با استفاده از آغازگرها بررسی شد(10). برای انجام این روش از غلظت100-50 نانوگرم DNA ، مخلوط µM 4/0 از آغازگرهای هر آنتی‌ژن و 2xMaster Mix PCR (یکتا تجهیز آزما ـ ایران) در حجم نهایی µL 25 استفاده شد. برنامه ترمال سایکلر برای انجام PCR مورد نظر به این صورت بوده است: 1 چرخه در 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه(در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه ، در 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه) و 1 چرخه در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه. محصول حاصل از تکثیر PCR با استفاده از ژل آگارز 2% مورد بررسی قرار گرفت.
روش PCR-RFLP : برای تایید نتایج حاصل از PCR-SSP ، از روش PCR-RFLP برای بیمارانی که بین نتایج فنوتیپ و ژنوتیپ دارای ناسازگاری بودند، استفاده شد. از آغازگر پیشرو [5'-TGAGATCTTGGTTCCTAGG-3'] و آغازگر پیرو [5'-ATTGCAATGCAGGCCAGAGA-3'] برای تکثیر اگزون 9 ژن گروه خونی Kidd استفاده شد(11). برنامه ترمال سایکلر برای انجام PCR مورد نظر به این صورت بوده است: 1 چرخه در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه، 30 چرخه(در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 50 ثانیه، در 56 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه) و 1 چرخه در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه. محصول حاصل از تکثیر RFLP-PCR با استفاده از ژل آگارز 2% مورد بررسی قرار گرفت. محصول PCR تحت تاثیر آنزیم MnlI به مدت 4 ساعت برش خورده و قطعات اختصاصی آلل مورد نظر را به وجود میآورد. سپس محصولات حاصل از آنزیم به وسیله ژل پلی آکریل آمید 8% مورد بررسی قرار گرفتند.
تعیین توالی: تعیین توالی با استفاده از آغازگر پیشرو [5'-TTAGTCCTGAGTTCTGACCCCT-3'] و آغازگر پیرو [5'-GATCCTGTAGTCATGAGCAGC-3'] برای نمونه‌های کنترل و نمونه‌هایی که بین نتایج فنوتیپ و ژنوتیپ حاصل از PCR-SSP دارای ناسازگاری بودند، انجام شد.
یافته‌ها تعیین فنوتیپ: نتایج این مطالعه نشان داد که 51 نمونه(51%) دارای فنوتیپJk(a+b+) ، 17نمونه(17%) دارای فنوتیپ Jk(a+b-) و14 نمونه(14%) دارای فنوتیپJk(a-b+) هستند. هم‌چنین فنوتیپ 18 نمونه(18%) به دلیل واکنش آگلوتیناسیون زمینه مخلوط(mix-field) با استفاده از روش سرولوژی امکان‌پذیر نبود.
شیوع آلوآنتیبادی: در مطالعه حاضر 38 نمونه(38%) دارای مولتیپل آنتی‌بادی و 62 نمونه(62%) دارای تنها یک نوع آلوآنتیبادی بودند. شایع‌ترین آلوآنتیبادی Anti-Kell (28%) و سپس Anti-E (21%) و Anti-D (11%) بود.
تعیین ژنوتیپ آنتیژنهای گروه خونی Kidd : نتایج PCR-SSP : قطعه حاصل از تکثیر PCR-SSP برای آللهای Jka و Jkb ، bp528 بود. نتایج حاصل از تعیین ژنوتیپ با استفاده از این روش نشان میدهد که 47 بیمار(47%) دارای ژنوتیپ JkA/JkB ، 29 بیمار(29%) دارای ژنوتیپ JkA/JkA و 24 بیمار(24%) دارای ژنوتیپ JkB/JkBهستند(شکل 1).
مقایسه نتایج فنوتیپ و ژنوتیپ نمونه‌ها: 20 نمونه دارای ناسازگاری بین نتایج فنوتیپ و ژنوتیپ بودند(جدول 1).
شکل 1: نمونه‌ای از الکتروفورز محصول PCR-SSP Set 2 Primers: ناحیه باند JKA و JKB به ترتیب bp 301 و bp 171 قرار میگیرد. از هورمون رشد(Hgh) به عنوان کنترل داخلی استفاده شد که باند آن bp 434 است. تصویر حاصل از ژنوتیپ 3 نمونه را مشاهده می‌کنید. چاهک 1 و 2 : آلل A مثبت(1)، آلل B منفی(2) و ژنوتیپ JkA/JkA ، 4 و 5 : آلل A منفی(4)، آلل B مثبت(5) و ژنوتیپ JkB/JkB ، 6 و 7 : JkA/JkB ، 3 : کنترل منفی، M: bp 100 Ladder است.
جدول 1: نتایج ناسازگاری فنوتیپ و ژنوتیپ
نتایج PCR-RFLP و تعیین توالی: نتایج ناسازگاری نمونه‌هایی که بین فنوتیپ و ژنوتیپ دارای ناسازگاری بودند با استفاده از روش PCR-RFLP و تعیین توالی تایید شدند.
بحث در این مطالعه 100 بیمار تالاسمی دارای آلوآنتیبادی مورد بررسی قرار گرفتند که شایع‌ترین آلوآنتیبادیها Anti-Kell (28%)، Anti-E (21%) و Anti-D (11%) بوده است. نتایج ژنوتیپ در مورد مطالعه ما به صورت 47 نمونه(47%) دارای ژنوتیپ JkA/JkB ، 29 نمونه(29%) دارای ژنوتیپ JkA/JkA و 24 نمونه(24%) دارای ژنوتیپ JkB/JkB بود. هم‌چنین با مقایسه نتایج فنوتیپ و ژنوتیپ 20 مورد(20%) ناسازگاری بین این دو روش مولکولی و سرولوژی مشاهده شد. تعیین صحیح آنتیژنهای گروه خونی نقش مهمی در تزریق خون ایفا میکند. بیماران تالاسمی در طول عمرشان نیاز به تزریق خون متعدد دارند. مهمترین عارضه‌ای که در اثر تزریق خون در این بیماران ایجاد میشود، تولید آلوآنتیبادی است. به عنوان مثال حضور گلبول‌های قرمز اهداکننده در بدن بیمار، تعیین فنوتیپ را در این بیماران مشکل میکند(5). تعیین ژنوتیپ گروه خونی در بیماران تالاسمی که دارای تزریق خون متعدد هستند، سبب تسهیل در پیداکردن خون سازگار با این بیماران شده و در نهایـت سبب جلوگیری از آلوایمیونیزاسیون میشود(2). میزان آلوایمیونیزاسیون در بیماران تالاسمی بسیار متغیر است و حدود 4 تا 37 درصد گزارش شده است(13، 12). این میزان در کشورمان بین 87/2 تا 4/40 درصد گزارش شده است(16-14). مهمترین آنتیبادیهای گزارش شده در بیماران تالاسمی به ترتیب Anti-D ، Anti-E و Anti-Kاست. در مطالعه حاضر شایع‌ترین آلوآنتیبادیAnti-Kell (28%)، سپس Anti-E (21%) و Anti-D (11%) بود. مشابه این مطالعه، آذرکیوان و همکاران در سال 2011، شایع‌ترین آلوآنتیبادی را در مطالعه‌شان به ترتیبAnti-Kell (34%) و سپس Anti-D (9/10%) و Anti-E (9/9%) گزارش کردند(17). درویشی و همکاران در سال 2016، شایع‌ترین آلوآنتیبادیرا در مطالعه‌شان به ترتیبAnti-Kell (37%) و سپس Anti-D (29%) و Anti-E (20%) گزارش نمودند(14). در این مطالعه شیوع Anti-Jka و Anti-Jkb به ترتیب 4 و 2 درصد بود. در سایر مطالعه‌ها این میزان بین 3 تا 9 درصد گزارش شده است(22-18). شیوع فنوتیپ گروه خونی Kidd در جمعیت سفیدپوست به صورت 49% Jk(a+b+) ، 28% Jk(a+b-) و 23% Jk (a-b+) گزارش شده است. بنابراین با توجه به نتایج حاصل از ژنوتیپ، جمعیت مورد مطالعه ما از نظر آنتیژنهای گروه خونی Kidd مشابه جمعیت سفیدپوست است. در ایـن مطالعـه از 10 اهداکننـده سالـم به عنوان نمونه کنترل استفاده شد. فنوتیپ و ژنوتیپ این نمونه‌ها به ترتیب با استفاده از روش استاندارد سرولوژی و روشهای مولکولی تعیین شد. نتایج این نمونه‌ها کاملاً با یکدیگر تطابق داشته و میتوان گفت حساسیت و اختصاصیت روش مولکولی نسبت به روش استاندارد 100% بوده است. اما در مطالعه مورد نظر به دلیل این که بیماران تالاسمی به طور مکرر خون دریافت میکنند، در تعیین صحیح فنوتیپ این بیماران با مشکل مواجه هستیم و در این مطالعه 20 مورد ناسازگاری بین فنوتیپ و ژنوتیپ دیده شد. بنابراین برای این بیماران، نمیتوان از روش سرولوژی به عنوان روش استاندارد استفاده کرد. اگر در بین روشهای مولکولی، روش تعیین توالی را به عنوان روش استاندارد در نظر بگیریـم، خواهیـم دیـد اختصاصیت و حساسیت سایر روشهای مولکولی، نسبت به این روش 100% بوده است. در مطالعه حاضر 20 بیمار از 100 بیمار مورد مطالعه (20%) دارای ناسازگاری بین نتایج فنوتیپ و ژنوتیپ بوده‌اند. مشابه مطالعه ما، مطالعه‌های بسیاری انجام شده که با استفاده از روشهای مولکولی متفاوت، نتایج فنوتیپ و ژنوتیپ را در بیماران تالاسمی مورد ارزیابی قرار دادند. میزان ناسازگاری در این مطالعه‌ها برای گروه خونی Kidd بین 6 تا 30 درصد گزارش شده است(26-23). نتایج ناسازگاری بین روش سرولوژی و مولکولی در این مطالعه و هم چنین سایر مطالعه‌ها نشان میدهد که اگر چه روش سرولوژی به عنوان روش استاندارد برای تعیین فنوتیپ این بیماران استفاده میشود، اما محدودیت‌های این
روش به خصوص در این بیماران که دارای تزریق خون مکرر هستند سبب تولید و گسترش آلوآنتیبادی میشود. در مطالعه حاضر از روشهای مختلف برای تعیین ژنوتیپ گروه خونی Kidd استفاده شد که نتایج این روشها همان طور که ذکر شد، یکدیگر را تایید کردند. نتایج این مطالعه و سایر مطالعه‌ها نشان میدهد که روشهای مولکولی اختصاصیت بالایی داشته و میتوان از آن‌ها به عنوان روش مکمل استفاده نمود. نتیجه‌گیری نتایج این مطالعه نشان داد تعیین ناصحیح فنوتیپ گروه خونی با استفاده از روش آگلوتیناسیون در بیمارانی که دارای تزریق خون متعدد هستند، رخ میدهد. بنابراین استفاده از روشهای مولکولی برای تعیین ژنوتیپ گروه خونی میتواند به عنوان روش مکمل مورد بررسی قرار گیرد. تشکر و قدردانی از زحمـات همکـاران بخـــش ایمونوهمـاتولوژی سـتاد مرکـزی سـازمان انتقـال خـون و کارکنان درمانگاه تالاسمی بزرگسالان ظفر که در این پژوهش مـا را یاری کردند، صمیمانه سپاسـگزاریم. این مقاله ماحصل طرح مصوب در مؤسسه ملی توسعه تحقیقات علوم پزشکی ایران با کد طرح 942644 مصوب سال 1395بوده و هزینه‌های آن از محل این سازمان تامین گردیده است.
Jalali S, Oodi A, Azarkeivan A, Goudarzi ُ, Amirizadeh N. kidd blood group genotyping in alloimmunized thallasemia patients. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2019; 16 (3) :201-207 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1280-fa.html
جلالی سیده فرزانه، اودی آرزو، آذرکیوان آزیتا، گودرزی سمیرا، امیری زاده ناصر. تعیین ژنوتیپ گروه خونی Kidd در بیماران تالاسمی دارای آلوآنتیبادی. فصلنامه پژوهشی خون. 1398; 16 (3) :201-207
