بررسی ژنوتیپ سیستم گروه خونی Kell در بیماران تالاسمی دارای آلوآنتیبادی
ریحانه صریحی1، ناصر امیری‌زاده2، آرزو اودی3
چکیده سابقه و هدف آلوایمیونیزاسیون، برجستهترین عارضه بالینی در بیماران تالاسمی محسوب میگردد و Anti-K فراوانترین آنتیبادی در این بیماران میباشد. لذا ارزیابی دقیق این آنتیژن میتواند سبب کاهش چشمگیر موارد آلو- ایمیونیزاسیون گردد. روشهای ژنوتیپ با غلبه بر محدودیتهای روش سرولوژیک، سبب تسهیل تعیین گروه در این بیماران شده و میتواند راهنمای خوبی جهت شناسایی واحدهای خون سازگار باشد. در این بررسی آنتیژنهای K و k با روشهای سرولوژیک و مولکولی بررسی شده و نتایج مورد مقایسه قرار گرفتند. مواد و روشها در این مطالعه توصیفی، تعداد 200 نمونه خون کامل به صورت تصادفی از بیماران تالاسمی دارای آلوآنتیبادی درمانگاه تالاسمی بزرگسالان ظفر جمعآوری و فنوتیپ آنتیژنهای K و k برای تمامی نمونههاتعیین گردید. PCR-SSP برای تمامی نمونهها انجام شد. در موارد عدم تطابق نتایج ژنوتیپ و سرولوژی، نتایج به وسیله PCR-RFLP و تعیین توالی DNA تایید شدند. یافته‌ها در این مطالعه Anti-K (28%) شایعترین آنتیبادی شناخته شد. نتایج ژنوتیپ نشان داد که از 200 نمونه مورد بررسی، 192 بیمار(96%) دارای ژنوتیپ KEL*02/KEL*02 و 8 بیمار(4%) KEL*01/KEL*02 بودند. با مقایسه نتایج ژنوتیپ و فنوتیپ، 8 مورد ناسازگاری مشاهده شد که در تمامی موارد صحت نتایج ژنوتیپ با تعیین توالی DNA تایید گردید. نتیجه گیری این مطالعه نشان داد که آنتیبادیها علیه آنتیژن K هم چنان در بیماران تالاسمی به میزان بالایی پیدا میشود. یافته‌ها بیان نمود که ژنوتیپ مولکولی RBC نسبت به فنوتیپ سرولوژیک برتری دارد و به خصوص در بیمارانی مانند بیماران تالاسمی که دفعات زیادی خون می‌گیرند، جایگزین مناسب و روش قابل اعتمادتری است. کلمات کلیدی:ژنوتیپ، سیستم گروه خونی Kell، تالاسمی
تاریخ دریافت: 1 /3/98 تاریخ پذیرش: 27/5/98
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه بیماری تالاسمی به عنوان یکی از شایعترین بیماریهای ژنتیکی در جهان، تقریباً در تمامی نژادها و در حدود 60 کشور جهان دیده میشود(1). طبق گزارش‌های سازمان جهانی بهداشت، حدوداً 2 تا 3 میلیون نفر در داخل کشور ناقل این بیماری بوده و بیش از 18 هزار بیمار، مبتلا به انواع شدید آن میباشند که نیازمند تزریق خون مکرر بوده و بیشترین دریافت‌کنندگان سالیانه فرآوردههای خونی را در کشور تشکیل میدهند(3، 2). آلوایمیونیزاسیون برجستهترین عارضه بالینی ناشی از تزریق خون مکرر در بیماران تالاسمی است، چرا که آلوایمیونیزاسیون در این بیماران سبب افزایش نیاز به تزریق خون شده و شناسایی واحدهای خونی سازگار جهت تزریق خونهای بعدی را نیز با مشکل مواجه میسازد(6-4). هم چنین افرادی که یک آلوآنتیبادی در آنها ایجاد میشود دارای خطر بالاتری برای تولید اتوآنتیبادیها و آلوآنتیبادیهای بیشتر به دنبال تزریق خونهای بعدی هستند که این امر میتواند فرآیند شناسایی خون سازگار را در این بیماران با مشکل مواجه ساخته، سبب تاخیر در فرآیند تأمین و تزریق خون سازگار گردد و مدیریت درمان را به یک چالش جدی تبدیل کند(9-7، 4). هم چنین تولید آلوآنتیبادیها در بیماران مؤنثی که در سن باروری هستند میتواند فرآیند بارداری را در این بیماران با مشکل مواجه سازد(10). کلیدیترین راه‌کار در کاهش میزان آلوایمیونیزاسیون، پیشگیری از وقوع آن با استفاده از فرآورده با سازگاری بیشتر است که این امر مستلزم تعیین دقیق گروههای خونی در بیماران میباشد(11، 9، 6). سیستم گروه خونی Kell پس از ABO و Rh مهمترین سیستم گروه خونی در زمینه انتقال خون محسوب میگردد(12). آنتیژنهای موجود در این سیستم گروه خونی به شدت ایمونوژن بوده و سبب برانگیختن شدیدترین واکنشها به دنبال انتقال خون ناسازگار میشوند(13). در میان تمامی آنتیژنهای موجود در سیستم گروه خونی Kell ، دو آنتیژن متضاد K و k دارای بیشترین اهمیت بالینی میباشند. آنتیژن K به عنوان ایمونوژنترین آنتیژن در این سیستم گروه خونی شناخته شده و در بین سایر گروههای خونی نیز پس از آنتیژن RhD بیشترین ایمونوژنیسیته را دارا میباشد(14، 12). این آنتیژن جفت متضاد آنتیژن k بوده و یکی از شایعترین علل ساخت آلوآنتیبادی به دنبال تزریق خون ناسازگار است(15، 12). لذا تعیین دقیق این آنتیژنها در بیماران تالاسمی میتواند موارد آلوایمیونیزاسیون را به صورت چشمگیری کاهش داده و سبب بهبود و ارتقای فرآیندهای درمانی در این بیماران گردد(16). روشهای سرولوژی، روش‌هایی ساده و نسبتاً ارزان جهت تعیین گروههای خونی هستند. این روشها در صورتی که به درستی انجام شوند در بسیاری از موارد بالینی کمک‌کننده خواهند بود(17). با این وجود این روشها دارای محدودیتهای بسیاری به ویژه در تعیین گروه برای بیماران دارای تزریق خون مکرر هستند(18). روشهای سرولوژیک در تعیین گروه خونی افرادی که به تازگی خون دریافت نمودهاند به دلیل حضور گلبولهای قرمز دهنده در گردش خون گیرنده ناکارآمد هستند و یا در مواردی که گلبولهای قرمز به صورت متصل به آلوآنتی بادی و یا DAT مثبت در گردش خون بیمار حضور دارند، به دلیل تداخلات گسترده آنتیبادیها این روشها قادر به تعییـن صحیـح فنوتیـپ در بیمـاران نمیباشند(19، 18، 4). روشهای ژنوتایپینگ با استفاده از تجزیه و تحلیل DNA ژنومی قادر هستند با غلبه بر محدودیتهای روشهای سرولوژیک، گروههای خونی را در بیماران دارای انتقال خون اخیر، بیماران با تداخلات گسترده آنتیبادیها و یا در موارد عدم دسترسی به آنتیسرمها با دقت بالایی تعیین نمایند و موارد عدم انطباق را در آزمایش‌های سرولوژیک حل کنند(20). هم چنین این روشها قادر به شناسایی واریانتهای گروههای خونی، آنتیژنهای با بیان ضعیف و فنوتیپهای Null میباشند که با استفاده از روشهای سرولوژیک ممکن نبود(21). به این منظور در این مطالعه دو آنتیژن K و k (آللهای KEL*01 و KEL*02) از سیستم گروه خونی Kell در بیماران تالاسمی دارای آلوآنتیبادی از طریق تجزیه و تحلیل مولکولی با روشهای PCR-SSP، PCR-RFLP و تعیین توالی DNA بررسی گردید. مواد و روشها جمعآوری نمونه: در یک مطالعه توصیفی، با استفاده از اطلاعات موجود در پرونده بیماران تالاسمی مراجعه کننده به درمانگاه تالاسمی بزرگسالان ظفر، تعداد 200 بیمار تالاسمی دارای آلوآنتیبادی انتخاب گردید. سپس از هر بیمار مقدار 5 میلیلیتر نمونه خون کامل EDTA دار جمعآوری شد.
آزمایش‌های سرولوژیک: ابتدا سوسپانسیون 5%-3% (در سرم فیزیولوژی) گلبولهای قرمز بیماران تهیه و سپس کلیه نمونهها با استفاده از آنتی-K و آنتی-k (GmbH ایمونودیاگنوستیکا) تعیین فنوتیپ شدند. ابتدا مطابق دستورالعمل شرکت سازنده، آنتیسرم را به هر لوله آزمایش افزوده و لولهها به مدت 15 الی 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. سپس هر لوله سه مرتبه با استفاده از سالین سرد شسته شده و دو قطره AHG (ایران، IBRF) به هریک از لولهها اضافه شد. پس از سانتریفوژ، وجود یا عدم وجود آگلوتیناسیون و درجه‌بندی واکنشها با استفاده از آینه مقعر ارزیابی و ثبت گردید. غربالگری و تعیین هویت آنتیبادیها بر اساس استانداردهای مرجع سازمان انتقال خون ایران و با استفاده از کیتهای ارسالی از این مرکز انجام شد و نتایج ثبت گردید.
استخراج DNA: به منظور استخراج DNA از خون کامل یا بافی کوت، از Nucleic Acid purification kit (ایران، یکتا تجهیز آزما) استفاده شد. جهت اطمینان از کیفیت نمونههای استخراج شده، غلظت DNA استخراج شده با قرائت جذب نوری توسط دستگاه نانو دراپ مورد بررسی قرار گرفت و نمونهها در فریزر 21- درجه سانتی‌گراد ذخیره شد.
روش PCR-SSP جهت تعیین آللهای KEL*01 و KEL*02 : بر روی کلیه نمونهها پس از استخراج DNA با استفاده از آغازگرهای به دست آمده از مقاله ژانگ بوئر و همکارانش در سال 2012 ، آزمایش مولکولی(Sequence specific primer) PCR-SSP انجام شد(جدول 1). جهت کنترل از هورمون رشد انسانی استفاده گردید. حجم کلی واکنش PCR ، μL 25 و شامل: μL 5/12 از Master Mix 2X PCR (ایران، یکتا تجهیز آزما)، غلظت 60 نانوگرم DNA و آغازگر جلو برنده و معکوس 035/0 میکرومولار بود. سپس طبق برنامه دمایی زیر در دستگاه ترمال سایکلر مراحل تکثیر انجام شد: 1 چرخه در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 4 دقیقه و 30 چرخه(در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه در 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه) و 1 چرخه در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 3 دقیقه. پس از انجام واکنش PCR ، محصولات به دست آمده با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگارز 2 درصد بررسی شدند.
روش PCR-RFLP جهت تعیین آللهای KEL*01 و KEL*02 : جهت تایید ژنوتیپ بیمارانی که دارای تناقض در بین نتایج فنوتیپ و ژنوتیپ بودند،(Restriction fragment length polymorphism)PCR-RFLP با استفاده از آغازگرهای به دست آمده از مقاله آرونی و همکارانش در سال 2013و آنزیم محدودالاثر Bsm I(Thermo scientific, US) انجام شد(جدول 1). حجم کلی واکنش PCR، μL 25 و شامل: μL 5/12 از Master Mix 2X PCR( (یکتا تجهیز آرما، ایران) غلظت 100 نانوگرم DNA و آغازگر جلوبرنده و معکوس 04/0 میکرومولار بود. سپس طبق برنامه دمایی زیر در دستگاه ترمال سایکلر مراحل تکثیر انجام شد: 1 چرخه در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه و 32 چرخه (در 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه در 65 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه) و 1 چرخه در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 8 دقیقه. پس از انجام واکنش PCR ، محصولات به دست آمده طبق دستورالعمل آنزیم Bsm I تحت تاثیر آنزیم قرار داده شد. سپس نمونهها به مدت 8 ساعت در دمای37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند تا آنزیـم
جدول 1: توالی آغازگرهای مورد استفاده جهت بررسی مولکولی آللهای KEL*01 و KEL*02
محصول مورد نظر را به طور کامل برش دهد. سپس محصولات برش خورده با استفاده از ژل آگارز 4 درصد تفکیک شدند. محصول اولیه حاصل از PCR در افراد دارای آلل شایع k فاقد جایگاه برش برای آنزیم میباشد اما در افراد حامل آلل K ، جایگزینی نوکلئوتیدی سبب ایجاد یک جایگاه برش آنزیم در این ناحیه شده و سبب میشود تا محصول اولیه حاصل از تکثیر به طول bp 156 تحت تاثیر آنزیم به دو قطعهی 100 و bp 56 برش داده شود. در حقیقت وجود قطعات 100 و bp 56 پس از اثر آنزیم، نمایانگر وجود آلل K در بیمار میباشد. در افرادی که هر دو آلل را به صورت هتروزیگوت دارا میباشند شاهد حضور هم زمان قطعات برش نخورده به طول bp 156 و قطعات bp 100 و bp 56 حاصل از برش آنزیم خواهیم بود.
تعیین توالی DNA (DNA Sequencing): به منظور تایید آزمایش‌های مولکولی PCR-SSP و PCR-RFLP و تایید وجود موتاسیون در ناحیه مربوطه، در مواردی که در بین نتایج فنوتیپ و ژنوتیپ تناقض وجود داشت و هم چنین در 50 نمونه به عنوان کنترل، اگزون شماره 6 از لکوس ژنی Kell که حاوی SNP مرتبط با آنتیژنهای K و k میباشد تکثیر، و جهت تعیین توالی ارسال گردید. آغازگرهای تکثیر اگزون از مقاله لی و همکارانش در سال 1995 برداشت شد و طبق برنامه دمایی زیر در دستگاه ترمال سایکلر مراحل تکثیر انجام گردید: 1 چرخه(در 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 3 دقیقه در 65 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه) و 27 چرخه (در 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه در 64 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه) و 1 چرخه در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه (جدول 1). حجم کلی واکنش PCR، μL 50 و شامل: μL 25 از Master Mix 2X PCR (ایران، یکتا تجهیز آزما)، غلظت ng 200 DNA و آغازگر جلوبرنده و معکوس 02/0 میکرومولار بود. نتیجه تعیین توالی با برنامه کروماس بررسی شد و با مشاهده موتاسیون و مکان‌یابی آن، نوع آلل در بیماران تعیین گردید.
یافته‌ها مشخصات بیماران: در این مطالعه 200 بیمار تالاسمی دارای آلوآنتیبادی شامل 81 (5/40%) بیمار مذکر و 119 (5/59%) بیمار مؤنث با میانگین سنی 9/10± 30 سال(رنج سنی 65-4 سال) مورد بررسی قرار گرفتند که از این بین 108(54%) بیمار تالاسمی ماژور، 90 (45%) بیمار اینترمدیا و 2 (1%) بیمار مبتلا به سیکل/ بتاتالاسمی بودند.
نتایج مربوط به تعیین نوع آلوآنتیبادیها در جمعیت مورد بررسی: در این بررسی انواعی از آلوآنتیبادیها در سرم بیماران شناسایی گردید(نمودار 1).
نمودار1: درصد فراوانی آلوآنتیبادیها در بیماران مورد مطالعه
شکل1: نمونهایاز نتایج PCR-SSP در 2 بیمار دارای ژنوتیپ KEL*01/KEL*02 و KEL*02/KEL*02: ناحیه باند در ارتباط با آللهای KEL*01 و KEL*02bp360 است.از آغازگر هورمون رشد انسانی به عنوان کنترل داخلی استفاده گردید که باند آن bp434 میباشد. ستونهای 1و 2 به ترتیب مربوط به آللهای KEL*01 و KEL*02 برای بیمار شماره 1 و ستونهای 3 و 4 نیز به ترتیب مربوط به همین آنتیژنها برای بیمار شماره 2 میباشند و لذا ژنوتیپ بیمار 1، KEL*01/KEL*02 (هتروزیگوت) و ژنوتیپ بیمار 2 به صورت KEL*02/KEL*02 (هموزیگوت) است.
شکل2: نمونهای از نتایج PCR-RFLP در دو بیمار دارای ژنوتیپ KEL*01/KEL*02 و KEL*02/KEL*02: ستون 1باند اولیه حاصل از PCR را پیش از تاثیر آنزیم به طول bp 156 نمایش میدهد. ستونهای 2 و 3 باندهای حاصل از الکتروفورز محصولات PCR را پس از اثر آنزیم به ترتیب در افراد دارای ژنوتیپ هتروزیگوت KEL*01/KEL*02 و هموزیگوت KEL*02/KEL*02 نشان میدهند.
شایعترین آنتیبادیها به ترتیب شامل Anti-Kell (28%)، Anti-E (22%)، Anti-D (9%) و Anti-Kpa (7%) میباشند. هم چنین در جمعیت مورد مطالعه 5% از بیماران علاوه بر آلوآنتیبادی دارای اتوآنتی‌بادی(Warm & Cold auto antibody) بودند.
نتایج تعیین فنوتیپ برای آنتیژنهای K و k : در ارتباط با آنتیژنهای K و k ، فنوتیپ K- k+ با 36/96% دارای بیشترین فراوانی بوده و پس از آن فنوتیپ K+ k+ با 82/1% قرار میگیرد. هم چنین فنوتیپهایK+ k- و K- k- نیز هریک در 6/0% از جمعیت دیده شدند. آنتیژن K در 5/1% از جمعیت و آنتیژن k در 5/98% از جمعیت مشاهده گردید.
نتایج مربوط به آزمایش مولکولی PCR-SSP : از میان 200 بیمار مورد بررسی96% بیماران دارای ژنوتیپ KEL*02/KEL*02 و 4% از بیماران دارای ژنوتیپ KEL*01/KEL*02 بودند. آلل KEL*01در 8 بیمار(4%)، و آلل KEL*02 در تمامی بیماران(100%) دیده شد(شکل 1). نتایج مربوط به آزمایش مولکولی PCR-RFLP : روش PCR-RFLP بر روی نمونههای دارای تناقض بین نتایج به دست آمده از روشهای سرولوژیک و ژنوتیپ انجام شد تا به این وسیله نتایج به دست آمده از PCR-SSP تأیید گردند. افراد دارای آلل k فاقد جایگاه برش برای آنزیم Bsm I میباشند اما در افراد حامل آلل K جایگزینی نوکلئوتیدی سبب ایجاد یک جایگاه برش آنزیم شده و سبب میشود تا محصول اولیه حاصل از تکثیر به طول bp 156 تحت تاثیر آنزیم به دو قطعه bp 100 و bp 56 برش داده شود. در افرادی که هر دو آلل را به صورت هتروزیگوت دارا میباشند، شاهد حضور هم‌زمان قطعات برش نخورده بـه طـول bp 156 و قطعات bp 100 و bp 56 حاصل از برش آنزیم خواهیم بود(شکل 2).
نتایج مربوط به تعیین توالی اگزون 6 از لکوس ژنی Kell : بـه منظـور تأییـد نتایـج بـه دست آمده از آزمایش‌های مولکولی PCR-SSP و PCR-RFLP و تأیید وجود SNP مربوطه، تعیین توالی برای اگزون 6از نمونه‌هایی که دارای ناسازگاری بین نتایج فنوتیپ و ژنوتیپ بودند و هم چنین تعداد 50 نمونه به عنوان کنترل انجام شد. سپس نتایج حاصل از تعیین توالی با استفاده از نرم‌افزار کروماس بررسی شدند. در این مطالعه هیچ گونه عدم انطباقی در بین نتایج به دست آمده از روشهای PCR-SSP ، PCR-RFLP و DNA Sequencing دیده نشد و تمامی آزمایش‌های مولکولی مؤید یکدیگر بودند.
نتایج حاصل از مقایسه نتایج آزمایش‌های سرولوژی و روش مولکولی: در بین نتایج به دست آمده از ژنوتیپ و روشهای سرولوژی در 8 مورد عدم انطباق مشاهده شد(جدول 2). بیشترین موارد عدم انطباق در این بررسی مربوط به ژنوتیپ KEL*01/KEL*02 و فنوتیپ K-k+ با 6 مورد ناسازگاری بود.
جدول 2: موارد عدم انطباق نتایج سرولوژی و ژنوتیپ
بحث نتایج به دست آمده از آزمایش تعیین هویت آنتیبادیها در این مطالعه نشان داد که شایعترین آلوآنتیبادیها در این بررسی به ترتیب شامل Anti-Kell (28%)، Anti-E (22%)، Anti-D (9%) و Anti-Kpa (7%) میباشند. هم چنین نتایج ژنوتیپ در این مطالعه نشان داد که از میان 200 نمونه مورد بررسی، 96% بیماران دارای ژنوتیپ KEL*02/KEL*02 و 4% از بیماران دارای ژنوتیپ KEL*01/KEL*02 بودند و هیچ موردی از سایر ژنوتیپ‌های محتمل در جمعیت مورد بررسی دیده نشد. با مقایسه نتایج به دست آمده از ژنوتیپ و فنوتیپ، 8 مورد ناسازگاری در بین نتایج مشاهده شد که از این بین 6 بیمار دارای ژنوتیپ KEL*01/KEL*02 و فنوتیپ K-k+ بودند. مطالعه‌های متعددی در ارتباط با شیوع آلوآنتیبادیها در کشورهای مختلف اروپایی و آسیایی صورت گرفته است که در غالب این مطالعه‌ها Anti-K و Anti-E فراوانترین آنتیبادیها هستند(28-25). در داخل کشور نیز مطالعه‌های بسیاری به صورت منطقهای و یا چند مرکزی صورت گرفته است که در اغلب این مطالعه‌ها همانند نتایج به دست آمده در این تحقیق، Anti-K به عنوان فراوانترین آنتیبادی در جمعیت بیماران تالاسمی شناخته شده است. در سال 2007 کریمی و همکاران در مطالعهای میزان آلوایمیونیزاسیون را در جنوب ایران مورد مطالعه قرار دادند که در این بررسی شایعترین آلوآنتیبادیها به ترتیب (50%)Anti-Kell ، (15%)Anti-D و (10%)Anti-E عنوان شد(29). هم چنین در سال 2011 آذرکیوان و همکاران در مطالعهای چند مرکزی میزان آلوایمیونیزاسیون را مورد مطالعه قرار دادند که در این بررسی نیز Anti-K با 7/33% شایعترین آنتیبادی شناخته شد(30). در سال 2016 نیز داوری و همکارانش به بررسی میزان آلوایمیونیزاسیون در استان زنجان پرداختند که در این مطالعه نیز Anti-K و Anti-E به ترتیب شایعترین آلوآنتیبادیها در بیماران تالاسمی این استان بودند(31). تعدادی از مطالعه‌ها نیز شیوع بیشتر سایر آنتیبادیها را گزارش نمودهاند. به عنوان مثال صادقیان و همکاراندر سال 2009 میزان آلوایمیونیزاسیون را در شمال شرق ایران مورد بررسی قرار دادند که در این مطالعه بیشترین شیوع آلوآنتیبادی مربوط به(88%) Anti-D و سپس Anti-C و Anti-E بوده است(32). هم چنین در مطالعهای دیگر در سال 2013، میرزائیان و همکاران میزان آلوایمیونیزاسیون را در جنوب شرق ایران مورد بررسی قرار دادند که در این بررسی نیز آلوآنتیبادیهای ضد آنتیژنهای سیستم Rh و سپس آنتی‌بادیهای ضد آنتیژنهای سیستم گروه خونی Kell شایعترین آلوآنتیبادیها بودند(33). اما به طور کلی میتوان گفت در اغلب نقاط ایران آنتیبادی ضد آنتیژن K شایعترین آنتیبادی در بیماران تالاسمی میباشد و لذا ارزیابی دقیق این آنتیژن و بررسی سازگاری آن پیش از تزریق خون در بیماران تالاسمی میتواند موارد آلوایمیونیزاسیون را در این بیماران کاهش داده و سبب بهبود فرآیندهای درمانی در این بیماران گردد. نتایـج ژنـوتیپ در این مطالعه نشان داد که از میان 200 نمونه مورد بررسی، 96% بیماران دارای ژنوتیپ KEL*02/KEL*02 و 4% از بیماران دارای ژنوتیپ KEL*01/KEL*02 بودند و هیچ موردی از سایر ژنوتیپ‌های محتمل در جمعیت مورد بررسی ما دیده نشد. این نتایج اگر چه متفاوت از نتایج به دست آمده با روشهای سرولوژی میباشد اما به عدد به دست آمده برای شیوع آنتیژن K در مطالعه آذرکیوان و همکارانش در سال 2016 که بر روی 11557 اهداکننده انجام گردید، (8/3%) بسیار نزدیک میباشد(34). این امر میتواند تأییدی بر صحت نتایج به دست آمده از روش ژنوتایپ در مقابل روشهای سرولوژی باشد. در مطالعه مشابهی که در سال 2010 توسط گوئل‌سین و همکارانش در بیماران با تزریق خون مکرر در جنوب برزیل انجام شد، درصد شیوع ژنوتیپ KEL*02/KEL*02 75/94% ، KEL*01/KEL*02 5% وKEL*01/KEL*01 25/0% گزارش گردید(11). در مطالعه دیگری که در سال 2013 توسط باکانی و همکارانش در بیماران با تزریق خون مکرر انجام شد نیز اعداد مشابهی به دست آمد و 87/94% از بیماران دارای ژنوتیپ KEL*02/KEL*02 و 12/5% دارای ژنوتیپ KEL*01/KEL*02 بودند(17). در سال 2016 نیز عثمان و همکارانش بررسی مشابهی را در بیماران تالاسمی با تزریق خون مکرر انجام دادند که در آن بر خلاف آن چه در مطالعه ما به دست آمده بود، 100% بیماران دارای ژنوتیپ KEL*02/KEL*02 بودند (35). با مقایسه نتایج به دست آمده از ژنوتیپ و فنوتیپ در بیماران مورد مطالعه ما، 8 مورد ناسازگاری در بین نتایج مشاهده گردید که برای تمامی این موارد به منظور تأیید نتایج به دست آمده، PCR-RFLP و Sequencing انجام شد. از میان موارد عدم انطباق؛ 6 بیمار دارای ژنوتیپ KEL*01/KEL*02 و فنوتیپ K-k+ ، 1 بیمار دارای ژنوتیپ KEL*01/KEL*02 و فنوتیپ K-k- و 1 بیمار نیز دارای ژنوتیپ KEL*02/KEL*02 و فنوتیپ K+k- بودند. در این بررسی هیچ گونه عدم انطباقی در بین نتایج به دست آمده از روشهای PCR-SSP، PCR-RFLP و DNASequencing دیده نشد و نتایج به دست آمده از تمامی روشهای مولکولی کاملاً با یکدیگر مطابقت داشتند. مطالعه‌های مشابه بسیاری در این زمینه صورت گرفته است. در مطالعهای که در سال 2010 توسط گوئل‌سین و همکارانش در بیماران با تزریق خون مکرر در جنوب برزیل انجام شد و هم چنین در مطالعهای که در سال 2013 توسط باکانی و همکارانش در بیماران دارای تزریق خون مکرر صورت گرفت، با مقایسه نتایج به دست آمده از فنوتیپ و ژنوتیپ به ترتیب 1 و 2 مورد ناسازگاری در نتایج دیده شد که در ارتباط با هر دو مطالعه موارد ناسازگاری دارای ژنوتیپ KEL*01/KEL*02 و فنوتیپ K-k+ بودند(17، 11). در مطالعه ما نیز بیشترین موارد ناسازگاری را همین موارد تشکیل میدادند. در مطالعهای که در سال 2016 توسط ژان و همکارانش صورت گرفت نیز یک مورد ناسازگاری مرتبط با سیستم گروه خونی Kell مشاهده شد که در این مورد بیمار دارای ژنوتیپ KEL*02/KEL*02 و فنوتیپ K+k+ بود(6). در مطالعه ما ناسازگاری مشابهی دیده نشد. بر خلاف مطالعه ما و مطالعه‌هایی که اشاره شد، در بررسی که عثمان و همکارانش در سال 2016 در بیماران تالاسمی دارای تزریق خون مکرر انجام دادند، هیچ موردی از ناسازگاری بین نتایج ژنوتیپ و فنوتیپ در ارتباط با گروه خونی Kell دیده نشد(35). لذا با توجه به نتایج به دست آمده از مطالعه ما و سایر مطالعه‌های مشابه، غالب موارد عدم انطباق مربوط به بیماران با ژنوتیپ KEL*01/KEL*02 و فنوتیپ K-k+ میباشد. به نظر میرسد در این بیماران با توجه به دریافت مکرر خون منفی از نظر آنتیژن K ، این آنتیژن با استفاده از روشهای سرولوژیک قابل شناسایی نبوده است. این در حالی است که شناسایی این افراد میتواند سبب صرفه‌جویی در استفاده از واحدهای خونی K منفی شود که در حال حاضر به تعداد محدود در کشور ما قابل دسترسی میباشد.
نتیجه‌گیری بـا توجـه به نتایج این مطالعه و سایر مطالعه‌های مشابه انجام شده در این زمینه، میتوان نتیجه گرفت که استفاده از روشهای مولکولی به منظور بررسی ژنوتیپ آنتیژنهای K و k از سیستم گروه خونی Kell، همراه با بررسیهای سرولوژیک با رفع نواقص این روشها و شناسایی واریانتها و آللهایی که روشهای سرولوژیک قادر به شناسایی آنها نمیباشند، میتواند نقش مؤثری در بهبود مدیریت تزریق خون و انتخاب فرآوردههای خونی مناسب برای تزریق به بیماران تالاسمی دارای آلوآنتیبادی، ایفا کند.
تشکر و قدردانی از زحمـات همکـاران بخـــش ایمونوهمـاتولوژی سـتاد مرکـزی سـازمان انتقـال خـون و پرسنل درمانگاه تالاسمی بزرگسالان ظفر که در این پژوهش مـا را یاری کردند، صمیمانه سپاسـگزاریم. این مقاله ماحصل طرح مصوب در مؤسسه ملی توسعه تحقیقات علوم پزشکی ایران با کد طرح 942644 مصوب سال 1395بوده و هزینه‌های آن از محل این مؤسسه تامین گردیده است.
Sarihi R, Amirizadeh N, Oodi A. Study of Kell blood group genotype in alloimmiunized thalassemia patients. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2019; 16 (4) :259-269 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1275-fa.html
صریحی ریحانه، امیری زاده ناصر، اودی آرزو. بررسی ژنوتیپ سیستم گروه خونی Kell در بیماران تالاسمی دارای آلوآنتیبادی. فصلنامه پژوهشی خون. 1398; 16 (4) :259-269
