جلد 16، شماره 3 - ( پاییز 1398 )
جلد 16 شماره 3 صفحات 185-172 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Shams M, Halabian R, Karimi M, Ghollasi M, Salimi A. Stem Cell Bone Differentiation on Polyol Lactic Acid Composite Nanoparticles Containing 45S5 Bioactive Glass Nanoparticles. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2019; 16 (3) :172-185
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1261-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1261-fa.html
شمس مهدی، حلبیان راحله، کریمی محمد، قلاسی مرضیه، سلیمی علی. تمایز استخوانی سلول بنیادی بر روی نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسیدحاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال 45S5. فصلنامه پژوهشی خون. 1398; 16 (3) :172-185
مهدی شمس 
، راحله حلبیان 
، محمد کریمی ، مرضیه قلاسی ، علی سلیمی*
، راحله حلبیان ، محمد کریمی ، مرضیه قلاسی ، علی سلیمی*
استادیار مرکز تحقیقات نانوبیوتکنولوژی ـ دانشگاه علوم پزشکی بقیه اله(عج)
متن کامل [PDF 881 kb]
(1949 دریافت)
| چکیده (HTML) (3283 مشاهده)
مقدمه
در سال‌های اخیر، کامپوزیت‌های پلیمری/سرامیکی بیولوژیکی، به عنوان داربست‌های زیست سازگار و زیست تخریب‌پذیر برای ترمیم و بازسازی استخوان توسعه داده شدهاند(1). هنگامی که دو یا چند ماده بیولوژیکی به فرم کامپوزیت ساخته می‌شوند، هر جزء آن، نه تنها استقلال و خواص نصبی خود را حفظ می‌کند، بلکه مکمل نقاط قوت و ضعف یکدیگر می‌شوند، بنابراین تا حد زیادی نقایض و کاستی‌های یکدیگر را برطرف می‌کنند(2). از میان کامپوزیت‌های پلیمری، پلی‌هیدروکسی اسید مثل پلیاللاکتیک اسید(PLLA) به دلیل خاصیت زیست سازگاری و زیست تخریب‌پذیری ذاتی از جمله پلیمرهای سنتزی می‌باشد که امروزه کاربرد گسترده‌ای در این حوزه دارد و از طرف اداره کل غذا و دارو(FDA: Food And Drug Administration) مورد تائید قرار گرفته است(3). با این که این گونه پلیمرها دارای خواص زیست سازگاری و هدایت استخوانی مناسبی هستند، از نظر القاء یا تحریک استخوان‌سازی محدود می‌باشند و قدرت کافی جهت ترمیم ضایعات استخوانی را ندارند لذا نمی‌توانند تمام الزامات داربست ایده‌آل را برآورده سازند(5، 4). بنابراین می‌توان به کمک مواد سرامیکی زیست فعال، خواص آن‌ها را بهبود بخشید.
یکی از انواع شیشه‌هایی که توانایی ایجاد پیوند با استخوان را دارند شیشه‌های بر پایه Cao-P2O5-Sio2 هستند(7، 6). شیشه‌هـای زیـستی هنگامی که در بدن قرار می‌گیرند به راحتی با سیال‌های فیزیولوژیکی واکنش داده و یک لایه هیدروکسی آپاتیت کربنات بر روی سطح خود تشکیل می‌دهند(8). علاوه بر آن یون‌های کلسیم، فسفر و سیلیسیم آزاد شده می‌توانند تکثیر و تمایز سلول‌های استئوبلاستی را افزایش داده و منجر به بهبود استخوان‌سازی شود(11-9). دو روش کلی برای ساخت شیشه‌های زیست فعال(BGn) وجود دارد: روش ذوبی و سل ژل(15-12). در تحقیقات اخیر، شیشه زیست فعال (BGn) را در ترکیب پلیاللاکتیک اسید(PLLA) قرار داده و به صورت کامپوزیت ساخته‌اند. نتایج آزمایش‌های سلولی این گونه تحقیقات ثابت کرد که افزودن شیشه، تاثیر مثبتی در تکثیر و رشد سلول‌ها بر روی کامپوزیت دارد(18-16). هم‌چنین در مطالعه‌هایی نانوالیاف شیشه و نانوذرات هیدروکسی آپاتیت را در بستر نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید اضافه نموده و به صورت داربست کامپوزیتی مورد بررسی قرار داده‌اند. نتایج این تحقیقات، تاثیر به سزای این نانو ذرات در رشد و تمایز سلول‌ها بر روی داربست کامپوزیتی بود(19، 3). اما هنوز هم داربست‌های کامپوزیتی اشاره شده در درمان ضایعات استخوانی ناتوان هستند.
هدف از این پژوهش، ساخت نانوداربست کامپوزیتی (پلیمری/سرامیکی) زیست سازگار و زیست فعال مناسب برای ترمیم و بازسازی عیوب استخوانی بود به طوری که قابلیت القای بافت استخوان‌ساز جهت استخوان‌سازی را داشته در عین حال که سمیت و عوارض جانبی دیگری نداشته باشد. در این پژوهش، برای اولین بار از ذرات شیشه فعال از نوع 5S45(BGn) که با آسیاب سیاره‌ای به ساختاری در مقیاس نانو تبدیل شده، در ترکیب پلیاللاکتیک اسید استفاده شد. سپس جهت اثبات عدم سمیت و هم‌چنین قابلیت استخوان‌سازی، آزمایش‌های سلولی با استفاده از سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان صورت گرفت.
استفاده از این نوع نانو ذرات شیشه به واسطه افزایش نسبت سطح به حجم، سبب واکنش‌پذیری بهتر این نوع فاز در ماتریس پلیمری پلیاللاکتیک اسید که آن هم دارای ساختار نانو است، می‌گردد. تمامی این پارامترها در کنار ترکیب زیست فعال شیشه می‌تواند سبب افزایش کارآیی تکثیر و تمایز سلول‌های بنیادی بر روی نانو داربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال شود.
مواد و روش‌ها
ساخت نانو الیاف پلیاللاکتیک اسید(PLLA):
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. برای ساختن نانو الیاف پلیاللاکتیک اسید، 43/0 گرم پلیمر پلیاللاکتیک اسید(آلمان، مِرک) با وزن مولکولی 60 کیلو دالتون در 6 میلی‌لیتر کلروفرم با غلظت 7% وزن به حجم بر روی همزن مغناطیسی همزده شده و 1 میلی‌لیتر دی‌متیل فرمالدهید اضافه گردید. پس از همگن شدن و پایداری کامل، محلول فوق در یک سرنگ پلاستیکی10 میلی‌لیتر مخصوص دستگاه با سر سوزنی از جنس فولاد زنگ نزن با قطر خارجی 18 گیج(معادل 270/1 میلی‌متر) انتقال داده شد. تنظیمات دستگاه به صورت زیر درنظر گرفته شد: ولتاژ 18 کیلو ولت، نرخ تغذیه 6/0 میلی‌لیتر بر ساعت، فاصله نازل تا جمع‌کننده(جمع‌کننده متحرک) 15 سانتی‌متر، سرعت حرکت جمع‌کننده 300 دور بر دقیقه و سرعت حرکت رفت و برگشتی کلکتور 50 میلی‌متر در دقیقه. به منظور آبدوست کردن و تغییر ویژگی‌های سطحی جهت چسبندگی و اتصال بهتر سلول‌ها، عملیات پلاسما(آلمان، Diener-NNO) با گاز اکسیژن تحت فشار 4/0 بار و به مدت 4 دقیقه انجام شد.
ساخت نانوذرات شیشه زیست فعال 5S45 (BGn):
برای ساخت شیشه زیست فعال 5S45 ، 07/22 گرم Sio2 و 88/5 گرم P2O5 ، 45/21 گرم CaCo3 (آلمان، مِرک) و 6/20 گرم NaCO3 (آلمان، مِرک) با هم مخلوط و سپس توسط هاون عقیق، آسیاب گردید. در ادامه با استفاده از ظرف پلی‌اتیلنی درب‌دار با چند عدد گلوله پلی‌اتیلنی مجدداً مخلوط کردن مواد کامل‌تر انجام شد. مواد فوق با استفاده از دستگاه پرس(ایران، تأسیسات صارم، T-35) به شکل قرص‌های دایره‌ای با قطر 10 میلی‌متر، پرس گردید. قرص‌های حاصل درون کوره(ایران، تأسیسات صارم، T-35) قرار داده شد. تغییرات دمایی کوره بدین صورت انجام شد: ابتدا افزایش دما تا 800 درجه سانتی‌گراد با سرعت 10 درجه در دقیقه و ماندن در دمای فوق به مدت 5/2 ساعت و مجدداً افزایش دما از 900 به 1400 درجه سانتی‌گراد با نرخ 10 درجه در دقیقه و قرار دادن در دمای 1400 درجه سانتی‌گراد به مدت 3 ساعت. پس از عملیات مذاب، مواد ذوب شده حاصل از کوره خارج و درون آب مقطر کوینچ شدند. شیشه حاصل در دمای 80 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 ساعت با آون خشک گردید.
در ادامه، شیشه ساخته شده طی چند مرحله و در مجموع به مدت 100 ساعت با استفاده از آسیاب سیاره‌ای با کاپ زیرکونیا(Petch PM400) به ساختار در مقیاس نانو تبدیل گردید. به منظور اطمینان از سایز اندازه ذرات در مقیاس نانو، از DLS استفاده شد، نتایج آن نیز ساختار نانویی، کمتر از 700 نانومتر را تایید کرد.
ساخت نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید/نانو ذرات شیشه زیست فعال آسیاب شده(PLLA/BGn):
در این مرحله، نانو الیاف پلیاللاکتیک اسید به شکل دایره پانچ و درون پلیت کشت سلول قرار داده شد. نانو ذرات شیشه زیست فعال در آب مقطر(با غلظت 2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) غوطه‌ور و با دستگاه اولترا سونیک (آلمان، hielscher ، UP400S) و فرکانس 90 مگا هرتز به مدت 20 دقیقه سونیکیت شد. نانوذرات سونیکیت شده به مقدار 100 میکرولیتر به آرامی بر روی تمامی قسمت‌های نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید به طور یکنواخت پوشش داده و خشک گردید.
آزمون میکروسکوپ الکترونی روبشی:
به منظور مطالعه مورفولوژی نانوداربست کامپوزیتی، آزمون میکروسکوپ الکترونی روبشی(کره جنوبی، سرون تکنولوژیس) با ولتاژ 20 کیلوولت، انجام شد. نمونه‌ها قبل از انجام آزمایش پوشش طلا داده شدند.
آزمون پراش پرتو ایکس:
برای بررسی ساختار فازی، آزمـون پـراش پرتـو ایکس (آلمان، Unisantis-Xmd 300)(XRD) در محـدوده زاویه بین 10 الی 90 درجه سانتی‌گراد با ولتاژ 45 کیلو ولت و جریـان 1میلی‌آمپر با کاتد مس صورت گرفت.
کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی:
قبل از انجام کشت سلول، نمونه‌ها در اتانول 70% به مدت 24 ساعت قرار داده شد و پس از آن با محلول فسفات بافر سالین شستشو داده به مدت ۲۰ دقیقه نیز تحت اشعه فرابنفش قرار گرفتند. جهت اطمینان از عدم وجود آلودگی میکروبی، تمامی چاهک‌ها و نمونه‌های استریل شده به مدت 24 ساعت درون محیط کشت غنی شده از سرم جنین گاوی قرار گرفتند تا آلودگی احتمالی مشخص گردد. جهت انجام آزمایش‌های سلولی، 104×3 هزار سلول بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان انسان بر روی تمامی چاهک‌های حاوی نمونه ریخته و 300 میکرولیتر محیط کشت اضافه گردید. محیط کشت حاوی 45 میلی‌لیتر محیط با گلوگز بالا(DMEM-h)، 10 میلی‌لیتر محلول سرم جنین گاوی (FBS) و 500 میکرولیتر پنی‌سیلین/استرپتومایسین(آلمان، جیبکو) 1% بود و هر روز یک بار تعویض گردید. برای نمونه کنترل، سلول‌ها در کف پلیت کشت سلول کشت شدند.
آزمون MTT :
این آزمون در بازه‌های زمانی 1، 3 ، 5 و 7 روز ارزیابی گردید. پس از اتمام هر دوره، چاهک‌ها با فسفات بافر سالین شستشو داده و 50 میکرولیتر محلولMTT (آمریکا، سیگما آلدریچ)(5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در محیط کشت پایه) به هر چاهک اضافه و به مدت3 ساعت درون انکوباتور قرار داده شد. پس از تشکیل بلورهای فارمازان، 100 میکرولیتر دی‌متیل سولفوکساید(DMSO)(آمریکا، سیگما آلدریچ) جهت حل کردن بلورهای فارمازان اضافه شد. بعد از حل شدن کامل بلورها، میزان جذب محلول بنفش رنگ به دست آمده در طول موج 570 نانومتر، به وسیله دستگاه الایزا ریدر(اتریش، Sunrise-basic) اندازه‌گیری شد.
آزمون آکریدین اورنج:
قابلیت زنده ماندن سلول‌ها بعد از 1، 3 و 5 روز کشت با استفاده از رنگ‌آمیزی آکریدین اورنج سلول مورد ارزیابی قرار گرفت. در این آزمایش، محلول رنگ‌آمیزی فلورسنت به مقدار 1 میکرولیتر اتیدیوم بروماید(آمریکا، سیگما آلدریچ) حاوی 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر محلول آکریدین اورنج(آمریکا، سیگما آلدریچ) به هر چاهک اضافه و بعد از 20 دقیقه با محلول فسفات بافر سالین شستشو داده شد. با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت (Leica ، آلمان) از سلول‌های رنگ شده با بزرگ‌نمایی 100
میکرومتر تصویربرداری شد.
تمایز استخوانی:
جهت بررسی تمایز استخوانی، محیط کشت پایه با محیط تمایزی حاوی فاکتورهای تمایز استخوانی تعویض شد. محیط تمایزی حاوی 45 میلی‌لیتر محیط کشت ((DMEM-h، 10 میلی‌لیتر سرم جنین گاوی(FBS) و 500 میکرولیتر بتاگلیسرول، 500 میکرولیتر آسکوربیک اسید و 50 میکرولیتر دگزامتازون(آمریکا، سیگما آلدریچ) بود و هر 2 روز تعویض گردید.
ارزیابی فعالیت آلکالین فسفاتاز(ALP):
فعالیت آلکالین فسفاتاز در فواصل زمانی 7 و14 روز مورد بررسی قرار گرفت. ابتدا کل پروتئین سلول‌ها با استفاده از 300 میکرولیتر محلول ریپا استخراج و به مدت 20 دقیقه ورتکس گردید. برای جدا کردن پروتئین‌ها از بقایای سلول‌ها، این محلول به مدت 15 دقیقه با 15000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، سانتریفیوژ شد. سپس 150 میکرولیتر کیت آلکالین فسفاتاز(ایران، پارس آزمون) با نسبت محلول
به 50 میکرولیتر هر نمونه اضافه و در طول موج 450 نانومتر، مقدار فعالیت آلکالین فسفاتاز آن‌ها اندازه‌گیری شد.
بررسی مورفولوژی سلول‌های تمایز یافته:
مورفولوژی و اتصال سلول‌ها بر روی سطح نمونه فیبری نانوداربست کامپوزیتی پس از 14 روز تمایز مورد بررسی قرار گرفت. پس از اتمام دوره، 100 میکرولیتر محلول 5/2% وزنیگلوتارآلدهید افزوده و به مدت 3 ساعت در دمای محیط انکوبه شد. سپس با بافر فسفات سالین شستشو و پس از تثبیت سلولی، در محلول آبی اتانول با غلظت‌های 70، 80، 90 و 100 درصد هر کدام به مدت 10 دقیقه قرار گرفته و دهیدراته شدند. در نهایت، نمونه‌ها کاملاً خشک شدند و با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبـشی، مـورفولوژی و رفتـار آن‌هـا مشاهده شد.
آنالیز آماری:
در ایـن پـژوهش، تمامی آزمایش‌ها برای هر نمونه، 4 بـار تکـرار گـردید و میانگیـن نتایج به صورت ± انحراف
معیار گزارش شد. نرم‌افزار SPSS نسخه 17 برای تجزیه و تحلیل واریانس یک طرفه جهت تعیین میزان معنادار بودن مورد استفاده قرار گرفت. 05/0 p< مرز معنادار بودن تغییرات در نظر گرفته شد. برای رسم نمودارها از نرم‌افزار اکسل مایکروسافت آفیس 2010 استفاده شد.
یافته‌ها
بررسی تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی:
مورفولوژی نانوداربست کامپوزیتی قبل کشت سلول و پس از 14روز تمایز استخوانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی در شکل 1 نشان داده شده است.
در شکل 1 (a) نانو ذرات شیشه به خوبی بر روی نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید پوشش داده شده است و شباهت بالای ساختار کامپوزیت به ماتریس خارج سلولی طبیعی نمایان بود. شکل 1 (b)پس از 14 روز تمایز استخوانی، سلول‌ها دارای تراکم مناسب و شکل سه بعدی داشته و علاوه بر آن هم از چسبندگی مناسبی با ماتریکس نانوداربست کامپوزیتی برخوردار بودند. نتایج حاکی از آن بود که نانوداربست کامپوزیتی رفتار سلولی مناسب داشته و با توجه به شباهت ماتریس خارج سلولی طبیعی، این انتظار هم وجود داشت.
شکل 1: تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی :(a نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید/شیشه زیست فعال 5S45(PLLA/BGn) قبل از کشت سلول، (b مورفولوژی سلول‌های بنیادی مزانشیمی تمایز یافته پس از 14 روز بر روی نانوداربست کامپوزیتی
شکل 2: الگوی پراش پرتو ایکس نانوداربست. نتیجه حاصل از بررسی پرتو ایکس نانو داربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال 5S45 (PLLA/BGn) قبل از کشت سلول و پس از 14 روز تمایز استخوانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی
پراش پرتو ایکس:
الگوی پراش پرتوایکس نانوداربست کامپوزیتی ساخته شده قبل از کشت سلول و پس از 14روز تمایز استخوانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی در شکل نشان داده شده است (شکل 2). طبق الگوی نانوداربست کامپوزیتی قبل از کشت سلول، ساختاری فازی کاملاً آمورف و غیر بلورین بود و پیک‌های مربوط به شیشه زیست فعال و پلیاللاکتیک اسید، باهم همپوشانی داده‌اند. لازم به ذکر است پیک‌ها در محدوده زاویه 35-20 درجه، از شدت بیشتری برخوردارند که می‌توان گفت این مربوط به پلیاللاکتیک اسید و شیشه زیست فعال است. اما در الگو نانوداربست کامپوزیتی پس از تمایز استخوانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی، شدت پیک‌ها در زاویه 50 -20 درجه افزایش پیدا کرد.
ارزیابی اندازه ذرات شیشه زیست فعال ساخته شده:
میانگین اندازه ذرات شیشه زیست فعال 5S45 ، کمتر از 700 نانومتر بوده و ساختار کاملاً در مقیاس نانو بود(نمودار 1). پودر نانومتری شیشه به دلیل نسبت سطح به حجم بالا و انرژی سطحی بالا باعث تسریع برهمکنش بافت با پودر شده و خواص زیست سازگاری و انحلال‌پذیری بهینه‌ای دارد.
ارزیابی MTT :
طبق نتایج این آزمون، بیشترین حیات سلول‌های بنیادی مزانشیمی در همه بازه‌های زمانی مربوط به نمونه نانوداربست کامپوزیتی بود که این از عدم سمیت نمونه نانوداربست کامپوزیتی حکایت دارد(نمودار 2). میزان حیات سلولی نانوداربست کامپوزیتی در فواصل زمانی 1، 3، 5 و 7 به ترتیب(06/0± 356/0) (1/0±73/0) (16/0±35/1) و (2/0±96/1) بیان شد که روند افزایشی داشت. در نمونه کنترل نیز به ترتیب فواصل زمانی مقدار آن(04/0±25/0)(05/0±32/0)(07/0±54/0)و(08/0±76/0) بیان شد. با توجه به نتایج، تفاوت معناداری وجود داشت(05/0 p<). نتایج بیان کرد که رشد سلول‌ها هرگز شبیه سلول‌های توموری نبوده است زیرا نرخ رشد سلول‌ها پس از آن که تجمع سلولی به بیشترین مقدار خود رسید، متعادل و نزدیک به هم شد.
نمودار 1: بررسی قطر نانو ذرات به روش DLS: تصویر نشانگر اندازه دانه‌های نانو ذرات شیشه زیست فعال ساخته شده با آسیاب سیاره‌ای به روش DLS را نمایش می‌دهد. میانگین اندازه ذرات کمتر از 700 نانومتر بوده و ساختار کاملاً در مقیاس نانو است.
نمودار 2: ارزیابی زنده‌مانی و تکثیر سلول‌ها بر روی نانوداربست: نتایج آزمایش MTT پس از 1، 3، 5، 7 روز کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی بر روی نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه(PLLA/BGn) و نمونه کنترل. میزان زنده‌مانی و تکثیر سلول‌ها بر روی داربست حاوی نانو ذرات شیشه(PLLA/BGn) به صورت معنادار بالاتر از کنترل می‌باشد(001/0 p< *** و 01/0 p< **).
شکل 3: ارزیابی بقای سلول‌ها بر روی داربست با استفاده از آزمایش آکریدین اورنج: تصاویر آزمایش آکریدین اورنج از سلول‌های بنیادی مزانشیمی بر روی نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه(PLLA/BGn) و نمونه کنترل پس از 1، 3 و 5 روز کشت سلول
شکل 4: آزمایش آلکالین فسفاتاز: فعالیت آلکالین فسفاتاز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان پس از 7 و 14 روز تمایز استخوانی بر روی نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه(PLLA/BGn) و نمونه کنترل(001/0 p<*** و 01/0 p<**(.
بررسی تصاویر آکریدین اورنج:
در آزمون آکریدین اورنج، سلول‌هایی که مرده‌اند رنگ آکریدین اورنج را از خود عبور داده و دارای هسته و سیتوپلاسم قرمز یا نارنجی هستند و اما در صورتی که هسته و سیتوپلاسم کاملاً سبز باشند، سلول‌ها زنده‌اند (شکل 3). مطابق تصاویر، مرگ سلولی رخ نداده و هسته و سیتوپلاسم سلول‌ها کاملاً سبز بود. تصاویر تایید کرد که رشد و تکثیر سلول‌ها در نانوداربست کامپوزیتی نسبت به دیگر چاهک‌های فاقد آن رشد بیشتری داشته است. نانوداربست کامپوزیتی با ایجاد فضای سه بعدی مناسب و زبری سطح بیشتر نسبت به نمونه کنترل، باعث افزایش قابل ملاحظه رشد سلول‌ها شد. این تکثیر و رشد در تمام دوره‌ها به همین ترتیب بود.
بررسی فعالیت آلکالین فسفاتاز:
فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز به عنوان یک مارکر اولیه فنوتیپ سلول‌های استخوانی در شکل نشان داده شده است(شکل 4). مقدار فعالیت آلکالین فسفاتاز نانوداربست کامپوزیتی و نمونه کنترل به ترتیب در روز 7 تمایز استخوانی، 01/0 ± 22/0 و 007/0 ± 14/0 اندازه‌گیری شد که این مقدار نشان‌دهنده تمایز بیشتر سلول‌ها بر روی نانوداربست کامپوزیتی بود. علاوه بر آن در روز 14 تمایز، نانوداربست کامپوزیتی از سطح بالاتری برخوردار است، به طوری که مقدار فعالیت آن 03/0 ± 68/0 ولی نمونه کنترل 01/0 ± 34/0 بود.
بحث
در این پژوهش، نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید با استفاده از روش الکتروریسی ساخته و سپس نانوذرات شیشه زیست فعال 5S45(BGn) بر روی آن پوشش داده شد. نانو ذرات شیشه زیست فعال به روش ذوبی و با آسیاب سیاره‌ای ساخته شد. تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی و الگو پراش پرتو ایکس به ترتیب: مورفولوژی و ساختار فلزی مربوط به نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال 5S45 (PLLA/BGn)، را تایید کرد. نتایج آزمایش‌های سلولی صورت گرفته از قیبل: MTT ، آکریدین اورنج، آلکالین فسفاتاز و میکروسکوپ الکترونی رویشی، حاکی از عدم سمیت و تاثیر بالقوه این نانوداربست کامپوزیتـی در
رشد و تمایز استخوانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی بود.
تاکنون تحقیقات زیادی بر روی داربست‌های پلیمری تقویت شده با شیشه زیست فعال(BG) توسط محققان صورت گرفته است. لیو و همکاران، نانوکامپوزیت پلیاللاکتیک اسید/ شیشه زیست فعال(wt 20% PLIA/BG) را سنتز کردند. در این بررسی شیشه زیست فعال (BG) به روش سل- ژل ساخته شد و اندازه ذرات حدود 40 نانومتر بود. بر اساس نتایج به دست آمده، نانوکامپوزیت ساخته شده نسبت به پلیاللاکتیک اسید خالص، بسیار زیست سازگارتر است و بر پیوستگی و رشد سلول‌ها تاثیر مثبت گذاشته است(20). یو و همکاران، داربست پلی لاکتیک کوگلیکولیک اسید حاوی 30% وزنی شیشه زیست فعال(BG 30% PLGA-) با ساختار میکرو و متخلخل را ساختند. کامپوزیت ساخته شده به عنوان یک ماده جایگزین استخوان، توانایی بالقوه‌ای برای رشد سلول‌های استرومائیدی مغز استخوان به سلول‌های استئوبلاست را به وجود آورده است(21). سلیمی و همکاران داربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید تقویت شده با الیاف شیشه زیست فعال تهیه شده(PLLA/BGf) به روش سل ژل و الکتروریسی ساخته‌اند. نتایج این تحقیق نشان داد که پوشش الیاف شیشه زیست فعال در بستر پلیاللاکتیک اسید، اثر بالقوه‌ای بر رشد و تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی دارد(3). فرناندز و همکاران، از شیشه زیست فعال استرونیوم بروسیلیکات جهت تقویت غشاء پلیمر پلیاللاکتیک اسید الکتروریسی شده(PLLA-BBG-Sr) استفاده کردند. نتایج این پژوهش نشان داد که شیشه زیست فعال استرونیوم بروسیلیکات(BBG-Sr) در ماتریس پلیمری، باعث بهبود خواص مکانیکی و افزایش رشد سلول‌های بنیادی مزانشیمی می‌شود(22). در تحقیقاتی دیگر، نانوالیاف کامپوزیت پلی‌لاکتیک اسید با پُر کننده شیشه زیست فعال(BG) ساخته شد. نتایج نشان داد که نانوکامپوزیت فوق باعث تشکیل بیشتر هیدروکسی آپاتیت در مایع شبیه‌سازی شده بدن می‌شود، علاوه بر آن رشد سلول‌های استئوبلاست افزایش قابل ملاحظه‌ای داشته است(23).
از این جهـت، بـا تـوجه بـه مطالعه‌های قبلی، نانوذارت
شیشه زیست فعال جهت افزایش قابلیت استخوان‌سازی بر روی بستر فیبری نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید پوشش داده و رفتار سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان بر روی نانوداربست کامپوزیتی ساخته شده مورد بررسی قرار گرفت. سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان ظرفیت، تمایز استخوانی بالقوه دارند، بنابراین یک مدل منحصر به فرد برای درک بهتر درمان بالینی مرتبط با استخوان ارائه می‌دهد(24).
نتایج پژوهش حاضر نشان داد که ساختار نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید، حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال سنتز شده(PLLA/BGn)، کاملاً در مقیاس نانو است. هم چنین نانو ذرات شیشه زیست فعال ساخته شده به خوبی و به طور یکنواخت بر روی نانو الیاف پلیاللاکتیک اسید توزیع شده و از پیوند مناسبی برخوردار است. باید به این نکته اشاره کرد که هر چه توزیع یکنواخت‌تر باشد، چسبندگی سلول‌ها و زیست فعالی بهتر خواهد بود و از طرفی هر چه قدر ساختار داربست به شبکه نانوفیبری ماتریس خارج سلولی طبیعی نزدیک‌تر باشد، در ایجاد رفتار مناسب از سلول موفق‌تر است. اندازه دانه‌های شیشه زیست فعال ساخته شده به علت این که در مقیاس نانو می‌باشد، می‌تواند تعداد محل‌های اتصال سلول به سطح و تعامل الکترواستاتیک بین پروتئین‌ها را افزایش دهد. در نتیجه افزایش جذب پروتئین، نسبت بالای سطح به حجم نانو ذرات شیشه زیست فعال (BGn)، می‌تواند دلایل اولیه رشد سلول را بهبود بخشد، از طرفی چسبندگی مولکول‌های کلاژن سریع‌تر صورت می‌گیرد و باعث رشد بلورهای هیدروکسی آپاتیت می‌شود. نانو ذرات شیشه زیست فعال به دلیل آن که سطح ویژه و واکنش‌پذیری بالایی دارد، منجر به انتشار سریع یون‌های زیست فعال از قبیل کلسیم و سیلیسیم می‌شود که باعث جذب، تکثیر، تمایز و کانی‌سازی سلول‌ها می‌گردند(26، 25). نانو داربست کامپوزیتی فوق، با ایجاد محیطی زبر و با ساختارهای نانو و تخلخل‌های متصل به هم، برای تحریک سلول‌ها و سازماندهی مناسب مجدد آن‌ها به عنوان الگویی برای چسبندگی و رشد سلول‌ها عمل می‌کند، علاوه بر آن سبب تسهیل در انتقال مواد غذایی و متابولیسم سلولی می‌گردد. چرا که هر چه سطح زبرتر باشد، چسبندگی، مهاجرت سلولی، تکثیر و تمایز سلول افزایش می‌یابد(28، 27). یافته‌های ما و دیگر محققین نشان داد که با وجود این که اندازه سلول حدود چند میکرومتر است، اما قادر به حس ساختار نانویی سطح است. به همین علت، سلول‌های بنیادی مزانشیمی بر روی سطح متخلخل نانوداربست کامپوزیتی بر روی شیارهای نانو مقیاس، رشد کرده‌اند(30، 29).
الگوی پراش پرتو ایکس نانوداربست کامپوزیتی ساخته شده، ساختاری فازی کاملاً آمورف و غیر بلورین را نشان داد که حاکی از آمورف بودن نانو ذرات شیشه زیست فعال و هم چنین پلیاللاکتیک اسید بود که در الگو، با هم همپوشانی رخ داده است. این مطلب با تحقیقات صورت گرفته بر روی پیک‌های شیشه زیست فعال و پلیاللاکتیک اسید هم‌خوانی داشت(32، 31). ساختار آمورف عموماً محلول‌تر و واکنش‌پذیرتر از ساختار کریستالی است، در نتیجه سرعت فرآیند تشکیل آپاتیت و افزایش قابلیت زیست فعالی و زیست سازگاری را افزایش می‌دهد(35-33). تصاویر میکروسکوپی و نتایج آزمون DLS تایید کرد که تبدیل ساختار میکرو شیشه زیست فعال به ساختاری در مقیاس نانو با استفاده از فرآیند آسیاب سیاره‌ای امکان‌پذیر است. استفاده از این نوع نانو ذرات شیشه به واسطه افزایش نسبت سطح به حجم و یون‌های زیست فعال، سبب واکنش‌پذیری بهتر این نوع فاز در تکثیر و تمایز سلول‌ها خواهد شد. نتایج مطالعه‌ها ثابت کرده که هر چه اندازه ذرات شیشه زیست فعال ریزتر باشد، تاثیر به‌سزایی در رشد و تمایز سلول‌ها خواهد داشت(36).
نتایج آزمون‌های آکریدین اورنج و MTT نیز حاکی از آن بود که سلول‌ها بر روی نانوداربست کامپوزیتی به طور معناداری رشد پیدا کرده بودند و هیچ گونه سمیتی ندارد(05/0 p<). فراهم شدن یک بستر مناسب جهت رشد و تکثیر سلول‌ها، مهم‌ترین و مؤثرترین دلیل افزایش رشد سلول‌ها بر روی نانو کامپوزیت بود. پاسخ‌های سلولی به ماده زیست فعال نه تنها به مورفولوژی سطح بلکه به ترکیب شیمیایی ماده نیز بستگی دارد که این عوامل نقش به سزایی در تعیین برهم کنش سلول- ماده به واسطه رهایش میزان یون‌های موجود در ماده دارد(38، 37). نانو ذرات شیشه در بستر پلیاللاکتیک اسید در عرض چند ثانیه پس از غوطه‌ور شدن درون محیط کشت، تبادل یونی انجام می‌دهند و زوائدی بر روی سطح تشکیل می‌شود. سپس انحلال شبکه شیشه و رسوب دوباره و رشد لایه سیلیس ژل بر روی سطح رخ می‌دهد و به مرور لایه بلوری هیدروکسی آپاتیت کربنات بر روی سطح شیشه تشکیل می‌شود. هم‌زمان با رشد این لایه‌ها، پروتئین‌های خارج سلولی در این لایه گیر می‌افتند و واکنش‌های بعدی سلولی را باعث می‌شوند که شامل چسبندگی، تکثیر و تمایز سلولی می‌باشد(39).
بررسی تمایز استخوانی نیز نشان داد که فعالیت آلکالین فسفاتاز نانو داربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال نسبت به نمونه کنترل افزایش پیدا کرد. بالاتر بودن این مقدار در نانوکامپوزیت، نشان‌دهنده اثر تحریکی نانوذرات شیشه موجود در بستر پلیاللاکتیک اسید، در تمایز استخوانی سلول های بنیادی مزانشیمی است. افزایش فعالیت را می‌توان به حضور اکسید سیلیسیم در شیشه زیست فعال(که به عنوان عامل ایجادکننده شبکه و هم‌چنین پیکربندی سه بعدی داربست کامپوزیتی PLLA/BGn عمل می‌کند) نسبت داد. گروه‌های سیلانول(Si-OH) منجر به مبادله یونی بین یون کلسیم(Ca2) آزاد شده از BG زیست فعال و هیدرومون(H3O) در محلول‌ها می‌شوند که حساسیت زیادی برای جوانه زنی فسفات کلسیم دارند (41، 40). حضور سیلیسیم آزاد شده توسط ترکیب شیشه به محیط کشت سلولی می‌تواند فعالیت سلولی را افزایش دهد. اکسید فسفر هم‌چنین جوانه زنی فسفر کلسیم فسفات را در سطح شیشه‌ای کمک می‌کند. علاوه بر این، افزایش جذب سلولی از کلسیم ناشی از افزایش حساسیت کانال باعث ایجاد کلسیم داخل سلولی است، الگوی پراش پرتو ایکس نیز وجود سلول‌های استخوانی را در بستر نانوداربست کامپوزیتی تایید کرد. این آزمایش ثابت کرد که سلول‌های تمایز یافته کاملاً استخوانی بوده و سلول‌های توموری نیستند. تصویر میکروسکوپی مورفولوژی سلول‌ها نیز، چسبندگی مناسب سلول بر روی نانو کامپوزیت را نشان داد. مطابق تصاویر، سلول‌ها به خوبی به سطح چسبیده و پخش شدهاند و توانستهاند پاهای دروغین با مورفولوژی چند وجهی ایجاد نمایند. بنابراین هر چه اتصال و چسبندگی سلول‌ها بالا باشد می‌توان گفت که قابلیت زیست سازگاری، هدایت و رشد استخوان از کیفیت مطلوبتری برخوردار خواهد بود. همان طور که دیده شد، سلول‌ها رد پاهایی از ماتریس خارج سلولی از خود به جا گذاشتهاند. اصولاً جهت بررسی درجه زیست سازگاری، برای تکثیر سلولی و اتصال، چهار مرحله درنظر گرفته می‌شود که عبارتند از: مرحله چسبیدن یا اتصال، مرحله ظاهر شدن پاهای دروغین، مرحله شبکهای شدن و مرحله پهن شدن سلول. مطابق با مشاهدات، نانوکامپوزیت حاضر از نقطه نظر زیست سازگاری در وضعیت درجه چهارم است(38، 37).
نتیجه‌گیری
در این پژوهش نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال 5S45 (PLLA/BGn) ساخته شد. نتایج این پژوهش نشان داد که داربست کامپوزیتی فوق، کاملاً در مقیاس نانو بوده و ساختار آمورف دارد. بررسی‌ها مشخص کرد که نانو ذرات
شیشه(BGn) به طور یکنواخت بر روی نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید توزیع شده بود. آزمایش‌های سلولی صورت گرفته از رشد و تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی بر روی نانوداربست کامپوزیتی اشاره داشت. علاوه بر آن، تمایز سلول‌های مزانشیمی به سلول‌های استخوانی بر روی بستر ساخته شده، به طور معناداری نسبت به نمونه کنترل بالاتر بود. بنابراین نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال ساخته شده(PLLA/BGn)، علاوه بر آن که هیچ‌گونه سمیتی نداشته، بلکه باعث تحریک و القای رشد سلول‌ها و هم چنین باعث افزایش تمایز استخوانی نیز می‌شود. با انجام تحقیقات بیشتر بر روی این نانوداربست کامپوزیتی ساخته شده در محیط درون تنی(In Vivo)، می‌توان مسیر استفاده از این بستر را در ترمیم طب ترمیمی هموارتر ساخت و در کاربردهای مربوط به بازسازی بافت استخوان استفاده نمود.
تشکر و قدردانی
این پروژه در مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و میکروبیولوژی کاربردی دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌اله(عج) به انجام رسیده است. از صندوق حمایت از پژوهشگران کشور و ستاد نانوتکنولوژی جهت حمایت در انجام پروژه نهایت قدردانی و تشکر به عمل می‌آید.
متن کامل: (1996 مشاهده)
تمایز استخوانی سلول بنیادی بر روی نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید
حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال 45S5
مهدی شمس1، راحله حلبیان2، محمد کریمی3، مرضیه قلاسی4، علی سلیمی5
چکیده
سابقه و هدف
امروزه استفاده از سلول‌های بنیادی و نانو داربست‌ها در تمایز سلول‌های بنیادی، به عنوان یک راه‌کار درمانی مطرح می‌باشد. هدف از این پژوهش، ساخت و مشخصه‌یابی نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانوذرات شیشه زیست فعال 5S45 آسیاب شده و سپس بررسی دقیق‌تر تاثیر این کامپوزیت در تکثیر و رشد سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان در محیط برون‌تنی بود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، نانو ذرات شیشه زیست فعال به روش ذوبی و آسیاب سیاره‌ای ساخته و سپس بر روی نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید الکتروریسی شده پوشش داده شد. خصوصیات فیزیکوشیمیایی و بیولوژیکی نانوداربست کامپوزیتی توسط آزمون‌های پراش پرتو ایکس، میکروسکوپ الکترونی رویشی، MTT ، آکریدین اورنج و آلکالین فسفاتاز ارزیابی گردید.
یافته‌ها
بررسی خواص فیزیکوشیمیایی نشان داد، ساختار شیشه زیست فعال ساخته شده و الیاف پلیاللاکتیک اسید کاملاً در مقیاس نانو بوده و نانو ذرات به صورت یکنواخت بر روی بستر فیبری توزیع شده است. آزمایش‌های سلولی افزایش چشمگیر رشد، تکثیر و تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به سلول‌های استخوانی بر روی نانو داربست کامپوزیتی را تایید کرد. در آزمایش سنجش MTT ، میزان حیات سلول بر حسب جذب نوری (OD) نمونه نانوداربست کامپوزیتی پس از 7 روز کشت، 2/0 ± 96/1 بیان شد، در حالی که نمونه کنترل، 08/0 ± 76/0 بود.
نتیجه گیری
با توجه به نتایج، نانوداربست کامپوزیتی فوق، سمیتی نداشته و از خواص زیست سازگاری مناسبی برخوردار است. علاوه بر آن، قابلیت استخوان‌سازی عالی دارد و در طب ترمیمی، جهت بازسازی بافت استخوان مفید خواهد بود.
کلمات کلیدی: نانوکامپوزیت‌ها، سلول‌های بنیادی، شیشه، مغز استخوان
تاریخ دریافت: 21/1/98
تاریخ پذیرش: 15/4/98
1- کارشناس ارشد نانومواد ـ پژوهشکده نانوتکنولوژی و مواد پیشرفته ـ پژوهشگاه مواد و انرژی ـ کرج ـ ایران
2- دکترای بیوتکنولوژی پزشکی ـ استادیار مرکز تحقیقات علوم میکروبی(میکروبیولوژی کاربردی) ـ دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌اله(عج) ـ تهران ـ ایران
3- دکترای نانو مواد ـ پژوهشگاه مواد و انرژی ـ پژوهشکده نانوتکنولوِژی و مواد پیشرفته ـ کرج ـ ایران
4- دکترای بیوشیمی ـ استادیار دانشکده علوم زیست‌شناسی ـ دانشگاه خوارزمی ـ تهران ـ ایران
5- مؤلف مسئول: دکترای نانوتکنولوژی ـ استادیار مرکز تحقیقات نانوبیوتکنولوژی ـ دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌اله(عج) ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 44711-14359
حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال 45S5
مهدی شمس1، راحله حلبیان2، محمد کریمی3، مرضیه قلاسی4، علی سلیمی5
چکیده
سابقه و هدف
امروزه استفاده از سلول‌های بنیادی و نانو داربست‌ها در تمایز سلول‌های بنیادی، به عنوان یک راه‌کار درمانی مطرح می‌باشد. هدف از این پژوهش، ساخت و مشخصه‌یابی نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانوذرات شیشه زیست فعال 5S45 آسیاب شده و سپس بررسی دقیق‌تر تاثیر این کامپوزیت در تکثیر و رشد سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان در محیط برون‌تنی بود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، نانو ذرات شیشه زیست فعال به روش ذوبی و آسیاب سیاره‌ای ساخته و سپس بر روی نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید الکتروریسی شده پوشش داده شد. خصوصیات فیزیکوشیمیایی و بیولوژیکی نانوداربست کامپوزیتی توسط آزمون‌های پراش پرتو ایکس، میکروسکوپ الکترونی رویشی، MTT ، آکریدین اورنج و آلکالین فسفاتاز ارزیابی گردید.
یافته‌ها
بررسی خواص فیزیکوشیمیایی نشان داد، ساختار شیشه زیست فعال ساخته شده و الیاف پلیاللاکتیک اسید کاملاً در مقیاس نانو بوده و نانو ذرات به صورت یکنواخت بر روی بستر فیبری توزیع شده است. آزمایش‌های سلولی افزایش چشمگیر رشد، تکثیر و تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به سلول‌های استخوانی بر روی نانو داربست کامپوزیتی را تایید کرد. در آزمایش سنجش MTT ، میزان حیات سلول بر حسب جذب نوری (OD) نمونه نانوداربست کامپوزیتی پس از 7 روز کشت، 2/0 ± 96/1 بیان شد، در حالی که نمونه کنترل، 08/0 ± 76/0 بود.
نتیجه گیری
با توجه به نتایج، نانوداربست کامپوزیتی فوق، سمیتی نداشته و از خواص زیست سازگاری مناسبی برخوردار است. علاوه بر آن، قابلیت استخوان‌سازی عالی دارد و در طب ترمیمی، جهت بازسازی بافت استخوان مفید خواهد بود.
کلمات کلیدی: نانوکامپوزیت‌ها، سلول‌های بنیادی، شیشه، مغز استخوان
تاریخ دریافت: 21/1/98
تاریخ پذیرش: 15/4/98
1- کارشناس ارشد نانومواد ـ پژوهشکده نانوتکنولوژی و مواد پیشرفته ـ پژوهشگاه مواد و انرژی ـ کرج ـ ایران
2- دکترای بیوتکنولوژی پزشکی ـ استادیار مرکز تحقیقات علوم میکروبی(میکروبیولوژی کاربردی) ـ دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌اله(عج) ـ تهران ـ ایران
3- دکترای نانو مواد ـ پژوهشگاه مواد و انرژی ـ پژوهشکده نانوتکنولوِژی و مواد پیشرفته ـ کرج ـ ایران
4- دکترای بیوشیمی ـ استادیار دانشکده علوم زیست‌شناسی ـ دانشگاه خوارزمی ـ تهران ـ ایران
5- مؤلف مسئول: دکترای نانوتکنولوژی ـ استادیار مرکز تحقیقات نانوبیوتکنولوژی ـ دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌اله(عج) ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 44711-14359
مقدمه
در سال‌های اخیر، کامپوزیت‌های پلیمری/سرامیکی بیولوژیکی، به عنوان داربست‌های زیست سازگار و زیست تخریب‌پذیر برای ترمیم و بازسازی استخوان توسعه داده شدهاند(1). هنگامی که دو یا چند ماده بیولوژیکی به فرم کامپوزیت ساخته می‌شوند، هر جزء آن، نه تنها استقلال و خواص نصبی خود را حفظ می‌کند، بلکه مکمل نقاط قوت و ضعف یکدیگر می‌شوند، بنابراین تا حد زیادی نقایض و کاستی‌های یکدیگر را برطرف می‌کنند(2). از میان کامپوزیت‌های پلیمری، پلی‌هیدروکسی اسید مثل پلیاللاکتیک اسید(PLLA) به دلیل خاصیت زیست سازگاری و زیست تخریب‌پذیری ذاتی از جمله پلیمرهای سنتزی می‌باشد که امروزه کاربرد گسترده‌ای در این حوزه دارد و از طرف اداره کل غذا و دارو(FDA: Food And Drug Administration) مورد تائید قرار گرفته است(3). با این که این گونه پلیمرها دارای خواص زیست سازگاری و هدایت استخوانی مناسبی هستند، از نظر القاء یا تحریک استخوان‌سازی محدود می‌باشند و قدرت کافی جهت ترمیم ضایعات استخوانی را ندارند لذا نمی‌توانند تمام الزامات داربست ایده‌آل را برآورده سازند(5، 4). بنابراین می‌توان به کمک مواد سرامیکی زیست فعال، خواص آن‌ها را بهبود بخشید.
یکی از انواع شیشه‌هایی که توانایی ایجاد پیوند با استخوان را دارند شیشه‌های بر پایه Cao-P2O5-Sio2 هستند(7، 6). شیشه‌هـای زیـستی هنگامی که در بدن قرار می‌گیرند به راحتی با سیال‌های فیزیولوژیکی واکنش داده و یک لایه هیدروکسی آپاتیت کربنات بر روی سطح خود تشکیل می‌دهند(8). علاوه بر آن یون‌های کلسیم، فسفر و سیلیسیم آزاد شده می‌توانند تکثیر و تمایز سلول‌های استئوبلاستی را افزایش داده و منجر به بهبود استخوان‌سازی شود(11-9). دو روش کلی برای ساخت شیشه‌های زیست فعال(BGn) وجود دارد: روش ذوبی و سل ژل(15-12). در تحقیقات اخیر، شیشه زیست فعال (BGn) را در ترکیب پلیاللاکتیک اسید(PLLA) قرار داده و به صورت کامپوزیت ساخته‌اند. نتایج آزمایش‌های سلولی این گونه تحقیقات ثابت کرد که افزودن شیشه، تاثیر مثبتی در تکثیر و رشد سلول‌ها بر روی کامپوزیت دارد(18-16). هم‌چنین در مطالعه‌هایی نانوالیاف شیشه و نانوذرات هیدروکسی آپاتیت را در بستر نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید اضافه نموده و به صورت داربست کامپوزیتی مورد بررسی قرار داده‌اند. نتایج این تحقیقات، تاثیر به سزای این نانو ذرات در رشد و تمایز سلول‌ها بر روی داربست کامپوزیتی بود(19، 3). اما هنوز هم داربست‌های کامپوزیتی اشاره شده در درمان ضایعات استخوانی ناتوان هستند.
هدف از این پژوهش، ساخت نانوداربست کامپوزیتی (پلیمری/سرامیکی) زیست سازگار و زیست فعال مناسب برای ترمیم و بازسازی عیوب استخوانی بود به طوری که قابلیت القای بافت استخوان‌ساز جهت استخوان‌سازی را داشته در عین حال که سمیت و عوارض جانبی دیگری نداشته باشد. در این پژوهش، برای اولین بار از ذرات شیشه فعال از نوع 5S45(BGn) که با آسیاب سیاره‌ای به ساختاری در مقیاس نانو تبدیل شده، در ترکیب پلیاللاکتیک اسید استفاده شد. سپس جهت اثبات عدم سمیت و هم‌چنین قابلیت استخوان‌سازی، آزمایش‌های سلولی با استفاده از سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان صورت گرفت.
استفاده از این نوع نانو ذرات شیشه به واسطه افزایش نسبت سطح به حجم، سبب واکنش‌پذیری بهتر این نوع فاز در ماتریس پلیمری پلیاللاکتیک اسید که آن هم دارای ساختار نانو است، می‌گردد. تمامی این پارامترها در کنار ترکیب زیست فعال شیشه می‌تواند سبب افزایش کارآیی تکثیر و تمایز سلول‌های بنیادی بر روی نانو داربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال شود.
مواد و روش‌ها
ساخت نانو الیاف پلیاللاکتیک اسید(PLLA):
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. برای ساختن نانو الیاف پلیاللاکتیک اسید، 43/0 گرم پلیمر پلیاللاکتیک اسید(آلمان، مِرک) با وزن مولکولی 60 کیلو دالتون در 6 میلی‌لیتر کلروفرم با غلظت 7% وزن به حجم بر روی همزن مغناطیسی همزده شده و 1 میلی‌لیتر دی‌متیل فرمالدهید اضافه گردید. پس از همگن شدن و پایداری کامل، محلول فوق در یک سرنگ پلاستیکی10 میلی‌لیتر مخصوص دستگاه با سر سوزنی از جنس فولاد زنگ نزن با قطر خارجی 18 گیج(معادل 270/1 میلی‌متر) انتقال داده شد. تنظیمات دستگاه به صورت زیر درنظر گرفته شد: ولتاژ 18 کیلو ولت، نرخ تغذیه 6/0 میلی‌لیتر بر ساعت، فاصله نازل تا جمع‌کننده(جمع‌کننده متحرک) 15 سانتی‌متر، سرعت حرکت جمع‌کننده 300 دور بر دقیقه و سرعت حرکت رفت و برگشتی کلکتور 50 میلی‌متر در دقیقه. به منظور آبدوست کردن و تغییر ویژگی‌های سطحی جهت چسبندگی و اتصال بهتر سلول‌ها، عملیات پلاسما(آلمان، Diener-NNO) با گاز اکسیژن تحت فشار 4/0 بار و به مدت 4 دقیقه انجام شد.
ساخت نانوذرات شیشه زیست فعال 5S45 (BGn):
برای ساخت شیشه زیست فعال 5S45 ، 07/22 گرم Sio2 و 88/5 گرم P2O5 ، 45/21 گرم CaCo3 (آلمان، مِرک) و 6/20 گرم NaCO3 (آلمان، مِرک) با هم مخلوط و سپس توسط هاون عقیق، آسیاب گردید. در ادامه با استفاده از ظرف پلی‌اتیلنی درب‌دار با چند عدد گلوله پلی‌اتیلنی مجدداً مخلوط کردن مواد کامل‌تر انجام شد. مواد فوق با استفاده از دستگاه پرس(ایران، تأسیسات صارم، T-35) به شکل قرص‌های دایره‌ای با قطر 10 میلی‌متر، پرس گردید. قرص‌های حاصل درون کوره(ایران، تأسیسات صارم، T-35) قرار داده شد. تغییرات دمایی کوره بدین صورت انجام شد: ابتدا افزایش دما تا 800 درجه سانتی‌گراد با سرعت 10 درجه در دقیقه و ماندن در دمای فوق به مدت 5/2 ساعت و مجدداً افزایش دما از 900 به 1400 درجه سانتی‌گراد با نرخ 10 درجه در دقیقه و قرار دادن در دمای 1400 درجه سانتی‌گراد به مدت 3 ساعت. پس از عملیات مذاب، مواد ذوب شده حاصل از کوره خارج و درون آب مقطر کوینچ شدند. شیشه حاصل در دمای 80 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 ساعت با آون خشک گردید.
در ادامه، شیشه ساخته شده طی چند مرحله و در مجموع به مدت 100 ساعت با استفاده از آسیاب سیاره‌ای با کاپ زیرکونیا(Petch PM400) به ساختار در مقیاس نانو تبدیل گردید. به منظور اطمینان از سایز اندازه ذرات در مقیاس نانو، از DLS استفاده شد، نتایج آن نیز ساختار نانویی، کمتر از 700 نانومتر را تایید کرد.
ساخت نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید/نانو ذرات شیشه زیست فعال آسیاب شده(PLLA/BGn):
در این مرحله، نانو الیاف پلیاللاکتیک اسید به شکل دایره پانچ و درون پلیت کشت سلول قرار داده شد. نانو ذرات شیشه زیست فعال در آب مقطر(با غلظت 2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) غوطه‌ور و با دستگاه اولترا سونیک (آلمان، hielscher ، UP400S) و فرکانس 90 مگا هرتز به مدت 20 دقیقه سونیکیت شد. نانوذرات سونیکیت شده به مقدار 100 میکرولیتر به آرامی بر روی تمامی قسمت‌های نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید به طور یکنواخت پوشش داده و خشک گردید.
آزمون میکروسکوپ الکترونی روبشی:
به منظور مطالعه مورفولوژی نانوداربست کامپوزیتی، آزمون میکروسکوپ الکترونی روبشی(کره جنوبی، سرون تکنولوژیس) با ولتاژ 20 کیلوولت، انجام شد. نمونه‌ها قبل از انجام آزمایش پوشش طلا داده شدند.
آزمون پراش پرتو ایکس:
برای بررسی ساختار فازی، آزمـون پـراش پرتـو ایکس (آلمان، Unisantis-Xmd 300)(XRD) در محـدوده زاویه بین 10 الی 90 درجه سانتی‌گراد با ولتاژ 45 کیلو ولت و جریـان 1میلی‌آمپر با کاتد مس صورت گرفت.
کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی:
قبل از انجام کشت سلول، نمونه‌ها در اتانول 70% به مدت 24 ساعت قرار داده شد و پس از آن با محلول فسفات بافر سالین شستشو داده به مدت ۲۰ دقیقه نیز تحت اشعه فرابنفش قرار گرفتند. جهت اطمینان از عدم وجود آلودگی میکروبی، تمامی چاهک‌ها و نمونه‌های استریل شده به مدت 24 ساعت درون محیط کشت غنی شده از سرم جنین گاوی قرار گرفتند تا آلودگی احتمالی مشخص گردد. جهت انجام آزمایش‌های سلولی، 104×3 هزار سلول بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان انسان بر روی تمامی چاهک‌های حاوی نمونه ریخته و 300 میکرولیتر محیط کشت اضافه گردید. محیط کشت حاوی 45 میلی‌لیتر محیط با گلوگز بالا(DMEM-h)، 10 میلی‌لیتر محلول سرم جنین گاوی (FBS) و 500 میکرولیتر پنی‌سیلین/استرپتومایسین(آلمان، جیبکو) 1% بود و هر روز یک بار تعویض گردید. برای نمونه کنترل، سلول‌ها در کف پلیت کشت سلول کشت شدند.
آزمون MTT :
این آزمون در بازه‌های زمانی 1، 3 ، 5 و 7 روز ارزیابی گردید. پس از اتمام هر دوره، چاهک‌ها با فسفات بافر سالین شستشو داده و 50 میکرولیتر محلولMTT (آمریکا، سیگما آلدریچ)(5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در محیط کشت پایه) به هر چاهک اضافه و به مدت3 ساعت درون انکوباتور قرار داده شد. پس از تشکیل بلورهای فارمازان، 100 میکرولیتر دی‌متیل سولفوکساید(DMSO)(آمریکا، سیگما آلدریچ) جهت حل کردن بلورهای فارمازان اضافه شد. بعد از حل شدن کامل بلورها، میزان جذب محلول بنفش رنگ به دست آمده در طول موج 570 نانومتر، به وسیله دستگاه الایزا ریدر(اتریش، Sunrise-basic) اندازه‌گیری شد.
آزمون آکریدین اورنج:
قابلیت زنده ماندن سلول‌ها بعد از 1، 3 و 5 روز کشت با استفاده از رنگ‌آمیزی آکریدین اورنج سلول مورد ارزیابی قرار گرفت. در این آزمایش، محلول رنگ‌آمیزی فلورسنت به مقدار 1 میکرولیتر اتیدیوم بروماید(آمریکا، سیگما آلدریچ) حاوی 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر محلول آکریدین اورنج(آمریکا، سیگما آلدریچ) به هر چاهک اضافه و بعد از 20 دقیقه با محلول فسفات بافر سالین شستشو داده شد. با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت (Leica ، آلمان) از سلول‌های رنگ شده با بزرگ‌نمایی 100
میکرومتر تصویربرداری شد.
تمایز استخوانی:
جهت بررسی تمایز استخوانی، محیط کشت پایه با محیط تمایزی حاوی فاکتورهای تمایز استخوانی تعویض شد. محیط تمایزی حاوی 45 میلی‌لیتر محیط کشت ((DMEM-h، 10 میلی‌لیتر سرم جنین گاوی(FBS) و 500 میکرولیتر بتاگلیسرول، 500 میکرولیتر آسکوربیک اسید و 50 میکرولیتر دگزامتازون(آمریکا، سیگما آلدریچ) بود و هر 2 روز تعویض گردید.
ارزیابی فعالیت آلکالین فسفاتاز(ALP):
فعالیت آلکالین فسفاتاز در فواصل زمانی 7 و14 روز مورد بررسی قرار گرفت. ابتدا کل پروتئین سلول‌ها با استفاده از 300 میکرولیتر محلول ریپا استخراج و به مدت 20 دقیقه ورتکس گردید. برای جدا کردن پروتئین‌ها از بقایای سلول‌ها، این محلول به مدت 15 دقیقه با 15000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، سانتریفیوژ شد. سپس 150 میکرولیتر کیت آلکالین فسفاتاز(ایران، پارس آزمون) با نسبت محلول
به 50 میکرولیتر هر نمونه اضافه و در طول موج 450 نانومتر، مقدار فعالیت آلکالین فسفاتاز آن‌ها اندازه‌گیری شد.بررسی مورفولوژی سلول‌های تمایز یافته:
مورفولوژی و اتصال سلول‌ها بر روی سطح نمونه فیبری نانوداربست کامپوزیتی پس از 14 روز تمایز مورد بررسی قرار گرفت. پس از اتمام دوره، 100 میکرولیتر محلول 5/2% وزنیگلوتارآلدهید افزوده و به مدت 3 ساعت در دمای محیط انکوبه شد. سپس با بافر فسفات سالین شستشو و پس از تثبیت سلولی، در محلول آبی اتانول با غلظت‌های 70، 80، 90 و 100 درصد هر کدام به مدت 10 دقیقه قرار گرفته و دهیدراته شدند. در نهایت، نمونه‌ها کاملاً خشک شدند و با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبـشی، مـورفولوژی و رفتـار آن‌هـا مشاهده شد.
آنالیز آماری:
در ایـن پـژوهش، تمامی آزمایش‌ها برای هر نمونه، 4 بـار تکـرار گـردید و میانگیـن نتایج به صورت ± انحراف
معیار گزارش شد. نرم‌افزار SPSS نسخه 17 برای تجزیه و تحلیل واریانس یک طرفه جهت تعیین میزان معنادار بودن مورد استفاده قرار گرفت. 05/0 p< مرز معنادار بودن تغییرات در نظر گرفته شد. برای رسم نمودارها از نرم‌افزار اکسل مایکروسافت آفیس 2010 استفاده شد.
یافته‌ها
بررسی تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی:
مورفولوژی نانوداربست کامپوزیتی قبل کشت سلول و پس از 14روز تمایز استخوانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی در شکل 1 نشان داده شده است.
در شکل 1 (a) نانو ذرات شیشه به خوبی بر روی نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید پوشش داده شده است و شباهت بالای ساختار کامپوزیت به ماتریس خارج سلولی طبیعی نمایان بود. شکل 1 (b)پس از 14 روز تمایز استخوانی، سلول‌ها دارای تراکم مناسب و شکل سه بعدی داشته و علاوه بر آن هم از چسبندگی مناسبی با ماتریکس نانوداربست کامپوزیتی برخوردار بودند. نتایج حاکی از آن بود که نانوداربست کامپوزیتی رفتار سلولی مناسب داشته و با توجه به شباهت ماتریس خارج سلولی طبیعی، این انتظار هم وجود داشت.
شکل 1: تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی :(a نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید/شیشه زیست فعال 5S45(PLLA/BGn) قبل از کشت سلول، (b مورفولوژی سلول‌های بنیادی مزانشیمی تمایز یافته پس از 14 روز بر روی نانوداربست کامپوزیتی
شکل 2: الگوی پراش پرتو ایکس نانوداربست. نتیجه حاصل از بررسی پرتو ایکس نانو داربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال 5S45 (PLLA/BGn) قبل از کشت سلول و پس از 14 روز تمایز استخوانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی
پراش پرتو ایکس:
الگوی پراش پرتوایکس نانوداربست کامپوزیتی ساخته شده قبل از کشت سلول و پس از 14روز تمایز استخوانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی در شکل نشان داده شده است (شکل 2). طبق الگوی نانوداربست کامپوزیتی قبل از کشت سلول، ساختاری فازی کاملاً آمورف و غیر بلورین بود و پیک‌های مربوط به شیشه زیست فعال و پلیاللاکتیک اسید، باهم همپوشانی داده‌اند. لازم به ذکر است پیک‌ها در محدوده زاویه 35-20 درجه، از شدت بیشتری برخوردارند که می‌توان گفت این مربوط به پلیاللاکتیک اسید و شیشه زیست فعال است. اما در الگو نانوداربست کامپوزیتی پس از تمایز استخوانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی، شدت پیک‌ها در زاویه 50 -20 درجه افزایش پیدا کرد.
ارزیابی اندازه ذرات شیشه زیست فعال ساخته شده:
میانگین اندازه ذرات شیشه زیست فعال 5S45 ، کمتر از 700 نانومتر بوده و ساختار کاملاً در مقیاس نانو بود(نمودار 1). پودر نانومتری شیشه به دلیل نسبت سطح به حجم بالا و انرژی سطحی بالا باعث تسریع برهمکنش بافت با پودر شده و خواص زیست سازگاری و انحلال‌پذیری بهینه‌ای دارد.
ارزیابی MTT :
طبق نتایج این آزمون، بیشترین حیات سلول‌های بنیادی مزانشیمی در همه بازه‌های زمانی مربوط به نمونه نانوداربست کامپوزیتی بود که این از عدم سمیت نمونه نانوداربست کامپوزیتی حکایت دارد(نمودار 2). میزان حیات سلولی نانوداربست کامپوزیتی در فواصل زمانی 1، 3، 5 و 7 به ترتیب(06/0± 356/0) (1/0±73/0) (16/0±35/1) و (2/0±96/1) بیان شد که روند افزایشی داشت. در نمونه کنترل نیز به ترتیب فواصل زمانی مقدار آن(04/0±25/0)(05/0±32/0)(07/0±54/0)و(08/0±76/0) بیان شد. با توجه به نتایج، تفاوت معناداری وجود داشت(05/0 p<). نتایج بیان کرد که رشد سلول‌ها هرگز شبیه سلول‌های توموری نبوده است زیرا نرخ رشد سلول‌ها پس از آن که تجمع سلولی به بیشترین مقدار خود رسید، متعادل و نزدیک به هم شد.
نمودار 1: بررسی قطر نانو ذرات به روش DLS: تصویر نشانگر اندازه دانه‌های نانو ذرات شیشه زیست فعال ساخته شده با آسیاب سیاره‌ای به روش DLS را نمایش می‌دهد. میانگین اندازه ذرات کمتر از 700 نانومتر بوده و ساختار کاملاً در مقیاس نانو است.
نمودار 2: ارزیابی زنده‌مانی و تکثیر سلول‌ها بر روی نانوداربست: نتایج آزمایش MTT پس از 1، 3، 5، 7 روز کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی بر روی نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه(PLLA/BGn) و نمونه کنترل. میزان زنده‌مانی و تکثیر سلول‌ها بر روی داربست حاوی نانو ذرات شیشه(PLLA/BGn) به صورت معنادار بالاتر از کنترل می‌باشد(001/0 p< *** و 01/0 p< **).
شکل 3: ارزیابی بقای سلول‌ها بر روی داربست با استفاده از آزمایش آکریدین اورنج: تصاویر آزمایش آکریدین اورنج از سلول‌های بنیادی مزانشیمی بر روی نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه(PLLA/BGn) و نمونه کنترل پس از 1، 3 و 5 روز کشت سلول
شکل 4: آزمایش آلکالین فسفاتاز: فعالیت آلکالین فسفاتاز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان پس از 7 و 14 روز تمایز استخوانی بر روی نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه(PLLA/BGn) و نمونه کنترل(001/0 p<*** و 01/0 p<**(.
بررسی تصاویر آکریدین اورنج:
در آزمون آکریدین اورنج، سلول‌هایی که مرده‌اند رنگ آکریدین اورنج را از خود عبور داده و دارای هسته و سیتوپلاسم قرمز یا نارنجی هستند و اما در صورتی که هسته و سیتوپلاسم کاملاً سبز باشند، سلول‌ها زنده‌اند (شکل 3). مطابق تصاویر، مرگ سلولی رخ نداده و هسته و سیتوپلاسم سلول‌ها کاملاً سبز بود. تصاویر تایید کرد که رشد و تکثیر سلول‌ها در نانوداربست کامپوزیتی نسبت به دیگر چاهک‌های فاقد آن رشد بیشتری داشته است. نانوداربست کامپوزیتی با ایجاد فضای سه بعدی مناسب و زبری سطح بیشتر نسبت به نمونه کنترل، باعث افزایش قابل ملاحظه رشد سلول‌ها شد. این تکثیر و رشد در تمام دوره‌ها به همین ترتیب بود.
بررسی فعالیت آلکالین فسفاتاز:
فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز به عنوان یک مارکر اولیه فنوتیپ سلول‌های استخوانی در شکل نشان داده شده است(شکل 4). مقدار فعالیت آلکالین فسفاتاز نانوداربست کامپوزیتی و نمونه کنترل به ترتیب در روز 7 تمایز استخوانی، 01/0 ± 22/0 و 007/0 ± 14/0 اندازه‌گیری شد که این مقدار نشان‌دهنده تمایز بیشتر سلول‌ها بر روی نانوداربست کامپوزیتی بود. علاوه بر آن در روز 14 تمایز، نانوداربست کامپوزیتی از سطح بالاتری برخوردار است، به طوری که مقدار فعالیت آن 03/0 ± 68/0 ولی نمونه کنترل 01/0 ± 34/0 بود.
بحث
در این پژوهش، نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید با استفاده از روش الکتروریسی ساخته و سپس نانوذرات شیشه زیست فعال 5S45(BGn) بر روی آن پوشش داده شد. نانو ذرات شیشه زیست فعال به روش ذوبی و با آسیاب سیاره‌ای ساخته شد. تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی و الگو پراش پرتو ایکس به ترتیب: مورفولوژی و ساختار فلزی مربوط به نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال 5S45 (PLLA/BGn)، را تایید کرد. نتایج آزمایش‌های سلولی صورت گرفته از قیبل: MTT ، آکریدین اورنج، آلکالین فسفاتاز و میکروسکوپ الکترونی رویشی، حاکی از عدم سمیت و تاثیر بالقوه این نانوداربست کامپوزیتـی در
رشد و تمایز استخوانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی بود.
تاکنون تحقیقات زیادی بر روی داربست‌های پلیمری تقویت شده با شیشه زیست فعال(BG) توسط محققان صورت گرفته است. لیو و همکاران، نانوکامپوزیت پلیاللاکتیک اسید/ شیشه زیست فعال(wt 20% PLIA/BG) را سنتز کردند. در این بررسی شیشه زیست فعال (BG) به روش سل- ژل ساخته شد و اندازه ذرات حدود 40 نانومتر بود. بر اساس نتایج به دست آمده، نانوکامپوزیت ساخته شده نسبت به پلیاللاکتیک اسید خالص، بسیار زیست سازگارتر است و بر پیوستگی و رشد سلول‌ها تاثیر مثبت گذاشته است(20). یو و همکاران، داربست پلی لاکتیک کوگلیکولیک اسید حاوی 30% وزنی شیشه زیست فعال(BG 30% PLGA-) با ساختار میکرو و متخلخل را ساختند. کامپوزیت ساخته شده به عنوان یک ماده جایگزین استخوان، توانایی بالقوه‌ای برای رشد سلول‌های استرومائیدی مغز استخوان به سلول‌های استئوبلاست را به وجود آورده است(21). سلیمی و همکاران داربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید تقویت شده با الیاف شیشه زیست فعال تهیه شده(PLLA/BGf) به روش سل ژل و الکتروریسی ساخته‌اند. نتایج این تحقیق نشان داد که پوشش الیاف شیشه زیست فعال در بستر پلیاللاکتیک اسید، اثر بالقوه‌ای بر رشد و تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی دارد(3). فرناندز و همکاران، از شیشه زیست فعال استرونیوم بروسیلیکات جهت تقویت غشاء پلیمر پلیاللاکتیک اسید الکتروریسی شده(PLLA-BBG-Sr) استفاده کردند. نتایج این پژوهش نشان داد که شیشه زیست فعال استرونیوم بروسیلیکات(BBG-Sr) در ماتریس پلیمری، باعث بهبود خواص مکانیکی و افزایش رشد سلول‌های بنیادی مزانشیمی می‌شود(22). در تحقیقاتی دیگر، نانوالیاف کامپوزیت پلی‌لاکتیک اسید با پُر کننده شیشه زیست فعال(BG) ساخته شد. نتایج نشان داد که نانوکامپوزیت فوق باعث تشکیل بیشتر هیدروکسی آپاتیت در مایع شبیه‌سازی شده بدن می‌شود، علاوه بر آن رشد سلول‌های استئوبلاست افزایش قابل ملاحظه‌ای داشته است(23).
از این جهـت، بـا تـوجه بـه مطالعه‌های قبلی، نانوذارت
شیشه زیست فعال جهت افزایش قابلیت استخوان‌سازی بر روی بستر فیبری نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید پوشش داده و رفتار سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان بر روی نانوداربست کامپوزیتی ساخته شده مورد بررسی قرار گرفت. سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان ظرفیت، تمایز استخوانی بالقوه دارند، بنابراین یک مدل منحصر به فرد برای درک بهتر درمان بالینی مرتبط با استخوان ارائه می‌دهد(24).
نتایج پژوهش حاضر نشان داد که ساختار نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید، حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال سنتز شده(PLLA/BGn)، کاملاً در مقیاس نانو است. هم چنین نانو ذرات شیشه زیست فعال ساخته شده به خوبی و به طور یکنواخت بر روی نانو الیاف پلیاللاکتیک اسید توزیع شده و از پیوند مناسبی برخوردار است. باید به این نکته اشاره کرد که هر چه توزیع یکنواخت‌تر باشد، چسبندگی سلول‌ها و زیست فعالی بهتر خواهد بود و از طرفی هر چه قدر ساختار داربست به شبکه نانوفیبری ماتریس خارج سلولی طبیعی نزدیک‌تر باشد، در ایجاد رفتار مناسب از سلول موفق‌تر است. اندازه دانه‌های شیشه زیست فعال ساخته شده به علت این که در مقیاس نانو می‌باشد، می‌تواند تعداد محل‌های اتصال سلول به سطح و تعامل الکترواستاتیک بین پروتئین‌ها را افزایش دهد. در نتیجه افزایش جذب پروتئین، نسبت بالای سطح به حجم نانو ذرات شیشه زیست فعال (BGn)، می‌تواند دلایل اولیه رشد سلول را بهبود بخشد، از طرفی چسبندگی مولکول‌های کلاژن سریع‌تر صورت می‌گیرد و باعث رشد بلورهای هیدروکسی آپاتیت می‌شود. نانو ذرات شیشه زیست فعال به دلیل آن که سطح ویژه و واکنش‌پذیری بالایی دارد، منجر به انتشار سریع یون‌های زیست فعال از قبیل کلسیم و سیلیسیم می‌شود که باعث جذب، تکثیر، تمایز و کانی‌سازی سلول‌ها می‌گردند(26، 25). نانو داربست کامپوزیتی فوق، با ایجاد محیطی زبر و با ساختارهای نانو و تخلخل‌های متصل به هم، برای تحریک سلول‌ها و سازماندهی مناسب مجدد آن‌ها به عنوان الگویی برای چسبندگی و رشد سلول‌ها عمل می‌کند، علاوه بر آن سبب تسهیل در انتقال مواد غذایی و متابولیسم سلولی می‌گردد. چرا که هر چه سطح زبرتر باشد، چسبندگی، مهاجرت سلولی، تکثیر و تمایز سلول افزایش می‌یابد(28، 27). یافته‌های ما و دیگر محققین نشان داد که با وجود این که اندازه سلول حدود چند میکرومتر است، اما قادر به حس ساختار نانویی سطح است. به همین علت، سلول‌های بنیادی مزانشیمی بر روی سطح متخلخل نانوداربست کامپوزیتی بر روی شیارهای نانو مقیاس، رشد کرده‌اند(30، 29).
الگوی پراش پرتو ایکس نانوداربست کامپوزیتی ساخته شده، ساختاری فازی کاملاً آمورف و غیر بلورین را نشان داد که حاکی از آمورف بودن نانو ذرات شیشه زیست فعال و هم چنین پلیاللاکتیک اسید بود که در الگو، با هم همپوشانی رخ داده است. این مطلب با تحقیقات صورت گرفته بر روی پیک‌های شیشه زیست فعال و پلیاللاکتیک اسید هم‌خوانی داشت(32، 31). ساختار آمورف عموماً محلول‌تر و واکنش‌پذیرتر از ساختار کریستالی است، در نتیجه سرعت فرآیند تشکیل آپاتیت و افزایش قابلیت زیست فعالی و زیست سازگاری را افزایش می‌دهد(35-33). تصاویر میکروسکوپی و نتایج آزمون DLS تایید کرد که تبدیل ساختار میکرو شیشه زیست فعال به ساختاری در مقیاس نانو با استفاده از فرآیند آسیاب سیاره‌ای امکان‌پذیر است. استفاده از این نوع نانو ذرات شیشه به واسطه افزایش نسبت سطح به حجم و یون‌های زیست فعال، سبب واکنش‌پذیری بهتر این نوع فاز در تکثیر و تمایز سلول‌ها خواهد شد. نتایج مطالعه‌ها ثابت کرده که هر چه اندازه ذرات شیشه زیست فعال ریزتر باشد، تاثیر به‌سزایی در رشد و تمایز سلول‌ها خواهد داشت(36).
نتایج آزمون‌های آکریدین اورنج و MTT نیز حاکی از آن بود که سلول‌ها بر روی نانوداربست کامپوزیتی به طور معناداری رشد پیدا کرده بودند و هیچ گونه سمیتی ندارد(05/0 p<). فراهم شدن یک بستر مناسب جهت رشد و تکثیر سلول‌ها، مهم‌ترین و مؤثرترین دلیل افزایش رشد سلول‌ها بر روی نانو کامپوزیت بود. پاسخ‌های سلولی به ماده زیست فعال نه تنها به مورفولوژی سطح بلکه به ترکیب شیمیایی ماده نیز بستگی دارد که این عوامل نقش به سزایی در تعیین برهم کنش سلول- ماده به واسطه رهایش میزان یون‌های موجود در ماده دارد(38، 37). نانو ذرات شیشه در بستر پلیاللاکتیک اسید در عرض چند ثانیه پس از غوطه‌ور شدن درون محیط کشت، تبادل یونی انجام می‌دهند و زوائدی بر روی سطح تشکیل می‌شود. سپس انحلال شبکه شیشه و رسوب دوباره و رشد لایه سیلیس ژل بر روی سطح رخ می‌دهد و به مرور لایه بلوری هیدروکسی آپاتیت کربنات بر روی سطح شیشه تشکیل می‌شود. هم‌زمان با رشد این لایه‌ها، پروتئین‌های خارج سلولی در این لایه گیر می‌افتند و واکنش‌های بعدی سلولی را باعث می‌شوند که شامل چسبندگی، تکثیر و تمایز سلولی می‌باشد(39).
بررسی تمایز استخوانی نیز نشان داد که فعالیت آلکالین فسفاتاز نانو داربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال نسبت به نمونه کنترل افزایش پیدا کرد. بالاتر بودن این مقدار در نانوکامپوزیت، نشان‌دهنده اثر تحریکی نانوذرات شیشه موجود در بستر پلیاللاکتیک اسید، در تمایز استخوانی سلول های بنیادی مزانشیمی است. افزایش فعالیت را می‌توان به حضور اکسید سیلیسیم در شیشه زیست فعال(که به عنوان عامل ایجادکننده شبکه و هم‌چنین پیکربندی سه بعدی داربست کامپوزیتی PLLA/BGn عمل می‌کند) نسبت داد. گروه‌های سیلانول(Si-OH) منجر به مبادله یونی بین یون کلسیم(Ca2) آزاد شده از BG زیست فعال و هیدرومون(H3O) در محلول‌ها می‌شوند که حساسیت زیادی برای جوانه زنی فسفات کلسیم دارند (41، 40). حضور سیلیسیم آزاد شده توسط ترکیب شیشه به محیط کشت سلولی می‌تواند فعالیت سلولی را افزایش دهد. اکسید فسفر هم‌چنین جوانه زنی فسفر کلسیم فسفات را در سطح شیشه‌ای کمک می‌کند. علاوه بر این، افزایش جذب سلولی از کلسیم ناشی از افزایش حساسیت کانال باعث ایجاد کلسیم داخل سلولی است، الگوی پراش پرتو ایکس نیز وجود سلول‌های استخوانی را در بستر نانوداربست کامپوزیتی تایید کرد. این آزمایش ثابت کرد که سلول‌های تمایز یافته کاملاً استخوانی بوده و سلول‌های توموری نیستند. تصویر میکروسکوپی مورفولوژی سلول‌ها نیز، چسبندگی مناسب سلول بر روی نانو کامپوزیت را نشان داد. مطابق تصاویر، سلول‌ها به خوبی به سطح چسبیده و پخش شدهاند و توانستهاند پاهای دروغین با مورفولوژی چند وجهی ایجاد نمایند. بنابراین هر چه اتصال و چسبندگی سلول‌ها بالا باشد می‌توان گفت که قابلیت زیست سازگاری، هدایت و رشد استخوان از کیفیت مطلوبتری برخوردار خواهد بود. همان طور که دیده شد، سلول‌ها رد پاهایی از ماتریس خارج سلولی از خود به جا گذاشتهاند. اصولاً جهت بررسی درجه زیست سازگاری، برای تکثیر سلولی و اتصال، چهار مرحله درنظر گرفته می‌شود که عبارتند از: مرحله چسبیدن یا اتصال، مرحله ظاهر شدن پاهای دروغین، مرحله شبکهای شدن و مرحله پهن شدن سلول. مطابق با مشاهدات، نانوکامپوزیت حاضر از نقطه نظر زیست سازگاری در وضعیت درجه چهارم است(38، 37).
نتیجه‌گیری
در این پژوهش نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال 5S45 (PLLA/BGn) ساخته شد. نتایج این پژوهش نشان داد که داربست کامپوزیتی فوق، کاملاً در مقیاس نانو بوده و ساختار آمورف دارد. بررسی‌ها مشخص کرد که نانو ذرات
شیشه(BGn) به طور یکنواخت بر روی نانوالیاف پلیاللاکتیک اسید توزیع شده بود. آزمایش‌های سلولی صورت گرفته از رشد و تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی بر روی نانوداربست کامپوزیتی اشاره داشت. علاوه بر آن، تمایز سلول‌های مزانشیمی به سلول‌های استخوانی بر روی بستر ساخته شده، به طور معناداری نسبت به نمونه کنترل بالاتر بود. بنابراین نانوداربست کامپوزیتی پلیاللاکتیک اسید حاوی نانو ذرات شیشه زیست فعال ساخته شده(PLLA/BGn)، علاوه بر آن که هیچ‌گونه سمیتی نداشته، بلکه باعث تحریک و القای رشد سلول‌ها و هم چنین باعث افزایش تمایز استخوانی نیز می‌شود. با انجام تحقیقات بیشتر بر روی این نانوداربست کامپوزیتی ساخته شده در محیط درون تنی(In Vivo)، می‌توان مسیر استفاده از این بستر را در ترمیم طب ترمیمی هموارتر ساخت و در کاربردهای مربوط به بازسازی بافت استخوان استفاده نمود.
تشکر و قدردانی
این پروژه در مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و میکروبیولوژی کاربردی دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌اله(عج) به انجام رسیده است. از صندوق حمایت از پژوهشگران کشور و ستاد نانوتکنولوژی جهت حمایت در انجام پروژه نهایت قدردانی و تشکر به عمل می‌آید.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
