[صفحه اصلی ]   [Archive] [ English ]  
:: صفحه اصلي :: درباره نشريه :: آخرين شماره :: آرشيو مقالات :: جستجو :: ثبت نام :: ارسال مقاله :: تماس با ما ::
بخش‌های اصلی
مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون::
مأموریت و اهداف
آئین نامه
ریاست
پژوهش
آموزش
اطلاعات نشریه::
درباره نشریه
هیئت دبیران
آرشیو مقالات::
کلیه شماره‌های مجله
آخرین شماره
مقالات در دست چاپ
دسته بندی موضوعی مقالات
برای نویسندگان::
فرم ارسال مقاله
راهنمای ارسال مقاله
راهنمای نویسندگان
راهنمای نگارش مقاله
راهنمای کشوری اخلاق
فرآیند داوری
برای داوران::
راهنمای داوران
ورود به بخش داوری
ثبت نام و اشتراک::
اطلاعات ثبت نام
فرم ثبت نام
اخبار و رویدادها::
اخبار
تماس با ما::
اطلاعات تماس
فرم برقراری ارتباط
تسهیلات تارنما::
راهنمای صفحات
جستجو در تارنما
صفحه برترین‌های تارنما
اطلاع‌رسانی به دوستان
فرم تعهد نامه (الزامی)::
اخلاق و مجوزها::
::
جستجو درتارنما

جستجوی پیشرفته
..
دریافت اطلاعات تارنما
نشانی پست الکترونیک خود را برای دریافت اطلاعات و اخبار پایگاه، در کادر زیر وارد کنید.
..
بانک تخصصی مقالات پزشکی

AWT IMAGE
..
نمایه ها
https://vlibrary.emro.who.int/journals_search/?skeyword=the+scientific+journal+of+iranian+blood+transfusion+organization&country=&subject=&indexing_status=&country_group=&so
..
:: جلد 16، شماره 2 - ( تابستان 1398 ) ::
جلد 16 شماره 2 صفحات 115-103 برگشت به فهرست نسخه ها
اثر ژل پلاکتی بر روند ترمیم و میزان بیان فاکتور VEGF در زخم‌های تجربی پوست در موش صحرایی
ماهان محمدی پور ، ناصر امیری زاده ، پژمان مرتضوی ، علیرضا جهاندیده
دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
واژه‌های کلیدی: کلمات کلیدی: پلاسمای غنی از پلاکت، موش صحرایی(رت)، VEGF
متن کامل [PDF 1148 kb]   (1122 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (3361 مشاهده)
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: هماتولوژي
انتشار: 1398/4/24
متن کامل:   (3172 مشاهده)
اثر ژل پلاکتی بر روند ترمیم و میزان بیان فاکتور VEGF در زخم‌های
تجربی پوست در موش صحرایی
 
ماهان محمدی‌پور1، ناصر امیری‌زاده2، پژمان مرتضوی3، علیرضا جهاندیده4
 
چکیده
سابقه و هدف
ژل پلاکتی تهیه شده از پلاسمای غنی از پلاکت با دارا بودن فاکتورهای رشد، ­باعث تسریع بازسازی لایه­های پوست، تحریک رگ­زایی و افزایش سنتز کلاژن در روند ترمیم زخم­ها می­شود. در این مطالعه، تاثیر ژل پلاکت انسانی بر میزان بیان فاکتور رشد عروقی در زخم­های تجربی پوست در موش صحرایی بررسی شد.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، ژل پلاکتی با افزودن ترومبین به پلاسمای غنی از پلاکت تهیه شد. در 24 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار، یک زخم 5/1 در 5/1 سانتی­متری در قسمت پشتی بدن بین دو کتف ایجاد شد. موش­ها به­ طور تصادفی به دوگروه 12تایی شاهد و درمان(استفاده موضعی از ژل پلاکتی در محل زخم) تقسیم شدند. درمان از ژل پلاکتی جهت پانسمان زخم استفاده گردید. نمونه­های زخم پوستی با رنگ‌آمیزی H&E و ماسون تریکروم برای هیستوپاتولوژی و فلورسنت ایمنوهیستوشیمی جهت ارزیابی فاکتور رشد عروقی بررسی شدند.
یافته‌ها
میزان تشکیل بافت پوششی در روز پنجم در گروه درمان شده با ژل پلاکتی 3/0 ± 2 و در گروه شاهد 1/0 ± 1 بود. نتایج هیستوپاتولوژی نشان­دهنده افزایش میزان تشکیل کلاژن و افزایش نفوذ سلول­های التهابی در گروه­ درمان نسبت به گروه­ شاهد به­ ویژه در مراحل ابتدایی روند ترمیم زخم بود. هم چنین نتایج ایمنوهیستوشیمی نشان داد که میزان بیان فاکتور رشد عروقی در گروه درمان بیشتر از گروه شاهد بوده است.
نتیجه گیری
استفاده موضعی از ژل پلاکتی بر روی زخم­های پوستی، اثرات مثبتی بر روند بهبود به­ ویژه در مراحل ابتدایی ترمیم دارد.
کلمات کلیدی: پلاسمای غنی از پلاکت، موش صحرایی(رت)، VEGF
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
تاریخ دریافت: 5/12/97
تاریخ پذیرش:  9/2 /98
 

1- دکترای عمومی دامپزشکی ـ واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- متخصص آسیب‌شناسی دامپزشکی ـ واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران
4- متخصص جراحی دامپزشکی ـ واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران
 

مقدمه ‌
    زخم­های پوستی و کاهش زمان بهبود آن­ها یکی از جنبه­های مهم پزشکی محسوب می­شود. به هرگونه گسستگی در انسجام لایه­های پوست یا بافت­های زیرپوستی زخم گفته می­شود که می­تواند در اثر عوامل فیزیکی یا شیمیایی ایجاد شود. با وجود پیشرفت­های چشمگیر در درمان زخم­، همچنان تلاش در جهت توسعه روش­های موثر در درمان زخم طی کوتاه­ترین زمان و با ایجاد کمترین عارضه ادامه دارد (1). بهبود و ترمیم زخم در انسان و حیوانات تکامل­یافته، با یک مکانیسم کاملاً پیچیده صورت می­پذیرد. سرعت بهبود زخم، به عوامل بسیاری بستگی دارد از جمله: اندازه زخم، ذخیره خونی در محل زخم، وجود اجسام خارجی و میکروارگانیسم­ها، سن، وضعیت سلامت و تغذیه بیمار (2).
    یکی از پیشرفت­ها در زمینه مدیریت و مراقبت برای تسریع بهبود زخم­های پوستی، استفاده از فرآورده­های خونی و ترکیبات مشتق از آن‌ها مانند فاکتور رشد پلاکتی ((PDGF، درمان با سلول­های بنیادی حاصل از مغز استخوان و یا خون بندناف می­باشد(3).
    امروزه استفاده از پلاکت­ها به صورت ژل پلاکتی، در ترمیم هر چه سریع­تر زخم‌ها، رو به افزایش است. مزایای استفاده از ژل پلاکتی، افزایش فاکتورهای رشد مورد نیاز برای ترمیم در موضع زخم، ایجاد بستر مناسب برای ترمیم زخم، تقویت سلول‌های پیش‌ساز و بنیادی شرکت‌کننده در ترمیم زخم، بهبود روند جلوگیری از از دست دادن خون و آب بدن، خواص ضد التهابی، خواص ضد میکروبی، روش تهیه و استفاده نسبتاً ساده می­باشد(4). پلاکت‌ها علاوه بر نقش ضد­ میکروبی که دارند، باعث فعال شدن سلول‌های ایمنی دیگر می­شوند که همین امر باعث تقویت مکانیسم دفاعی و تسریع روند بهبودی می‌گردد(5).
    استفاده از فاکتورهای رشد موجود در پلاکت(PDGF: AA, AB, BB)، (TFG:b1,b2)، (bFGF)، (EGF)، (VEGF) در ترمیم هر چه سریع­تر زخم­ها خصوصا زخم‌های مزمن ایجاد شده در افراد دیابتیک که نیاز به ترمیم سریع­تر برای جلوگیـری از ایجاد عفونـت دارنـد و هم‌چنیــن برش­های
حاصـل از جراحی­هـا و یـا شکستگی­هـای استخوانــی، به
صورت ژل پلاکتی که از پلاسمای غنی از پلاکت(PRP) تهیه می­شود رو به افزایش است. ژل پلاکتی را می­توان از طریق مخلوط کردن PRP با ترومبین و کلسیم تهیه نمود که در آن غلظت پلاکت‌ها 3 تا 5 برابر غلظت پلاکت­های اولیه در خون است(8-6). ترومبین به ­کار رفته در تهیه ژل پلاکتی به عنوان فعال‌کننده، سبب تحریک تجمع پلاکت­ها و آزادسازی فاکتورهای رشد ذخیره شده در پلاکت­ها می‌شود. کلسیم باعث خنثی شدن اثر ماده ضد انعقاد خون و تسهیل در آزادسازی گرانول­های پلاکتی می­شود. بعد از افزودن ترومبین و کلسیم، ژل چسبنده و ضخیمی شکل می­گیرد(4). در سال 2014 تامبلا و همکارانش استفاده از ژل پلاکتی اتولوگ را در درمان زخم بستر در سگ مورد مطالعه قرار دادند. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که استفاده از ژل پلاکتی اتولوگ می­تواند اثر مثبتی در بهبود زخم­های مقاوم به درمان و مزمن داشته باشد(9).
    ادیلبلوت و همکارانش در سال 2015 میزان اثر بخشی ژل پلاکتی را بر میکروارگانیسم­های فرصت طلب (شامل استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا و آسینوباکتر بومانی) در زخم­های پوستی بررسی کردند. نتایج نشان ­داد که استفاده از ژل پلاکتی در درمان زخم­های پوستی علاوه بر این که باعث تسریع در روند بهبودی زخم می­شود، می‌تواند اثر ضد میکروبی موثری در زخم­های عفونی داشته باشد(10).   
    در سال 2009 امانی و همکارانش تاثیر ژل پلاکتی را بر تکثیر سلول­های بنیادی مزانشیمی در محیط کشت(In vitro) مورد ارزیابی قرار دادند. نتایج به دست آمده از مطالعه آن‌ها نشان ­داد که عوامل رشد پلاکتی را می‌توان جایگزین سرم در محیط کشت سه بعدی نمود. زیرا این عوامل، محیط مناسبی را برای رشد سلول های مزانشیمی فراهم می‌سازند(11).
    هدف کلی ما از این مطالعه، بررسی تاثیر ژل پلاکتی بر شاخص­های التیامی زخم­ پوستی القا شده در موش صحرایی و اهداف اختصاصی بررسی اثر ژل پلاکتی دارای فاکتورهای رشد بر میزان بیان فاکتور VEGF در ترمیم زخم و افزایش سرعت ترمیم زخم پوستی در بیماران در مدل حیوانی بود.
مواد و روش‌ها
    مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود و این مطالعه مطابق با مصوبه اخلاق در پژوهش به شناسه IR.IAU.SRB.REC.1397.071 در تاریخ 9/8/1397 در دانشگاه آزاد اسلامی- واحد علوم و تحقیقات تهران، مورد تصویب کمیته­ اخلاق قرار گرفت.
 
تهیه ترومبین از پلاسمای انسان:
    10 میلی‌لیتر نمونه خون سیتراته از یک فرد اهدا­کننده خون تهیه شد. به منظور جداسازی پلاسما، نمونه با دور g ×3000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ(اپندورف، آلمان) شد. محلول رویی(پلاسمای شفاف) در لوله فالکون mL 15 (Nunc، دانمارک) جداگانه جمع‌آوری شد. در نهایت، به ازای هر 2 میلی‌لیتر پلاسما، 5/1 میلی‌لیتر کلسیم گلوکونات 10% (مینو، ایران) اضافه شد و منتظر ماندیم تا در بن ماری (اپتیما، ژاپن) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد لخته ایجاد شود و سپس با سانتریفیوژ کردن لخته از محلول روئی که حاوی ترومبین بود، جدا شد.
 
طرز تهیه ژل پلاکتی:
    کیسه­ پلاکتی از خون کامل اهداکنندگان با روش استاندارد در بانک خون تهیه گردید. کیسه­ پلاکتی تهیه شده در دستگاه آژیتاتور پلاکت خون(اپتیما ، ژاپن) نگهداری شد. مطابق با روش­های ذکر شده در بالا، PRP و ترومبین به دست آمد. به منظور تهیه ژل پلاکتی، محتویات کیسه پلاکتی به 4 لوله فالکون mL 15 (Nunc، دانمارک) منتقل شد. تعداد پلاکت­های موجود در این PRP توسط دستگاه شمارش سلول­های خونی (سیس‌مکس) شمارش شد. لوله‌های فالکون حاوی  PRPبا دور g3000× به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ(اپندورف، آلمان) گردید. به منظور تغلیظ بیشتر پلاکت­ها، نیمی از محلول روئی خالی شد. دوباره تعداد پلاکت­ها توسط دستگاه شمارش سلول­های خونی (سیس‌مکس) شمارش شد که در نهایت با سمپلر (اپندورف، آلمان)، 2 میلی‌لیتر PRP تغلیظ شده با 5/0 میلی‌لیتر ترومبین در درون یک پتری دیش ریخته شد و به آرامی مخلوط گردید تا لخته ایجاد شد و ژل پلاکتی تشکیل گردید. تمام مراحل تهیه ژل پلاکتی در زیر هود و در شرایط استریل انجام شد.
 
آماده‌سازی موش­ها و ایجاد زخم تجربی و درمان:
    24 سر موش صحرایی(رت) نر بالغ نژاد ویستار با محدوده سنی 14- 15 هفته و محدوده وزنی 10 ± 200 گرم از آزمایشگاه حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه  علوم پزشکی بقیه‌اله(عج) تهیه شد. این حیوانات به محل در نظر گرفته شده جهت انجام آزمایش منتقل و در قفس­های استاندارد نگهداری موش تحت شرایط نوردهی کنترل شده 12 ساعت روشنایی و12 ساعت تاریکی و دمای ثابت 2 ±  22 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند.
    حیوانات قبل از انجام مطالعه‌ها به مدت یک هفته دوره تطابق را گذراندند تا تاثیر منفی استرس ناشی از محیط ناآشنا بر روی نتایج مطالعه مورد نظر به حداقل برسد. موش­ها با پلت تغذیه شدند و به آب و غذا (پلت) دسترسی آزاد داشتند. القای بیهوشی با ترکیب زایلازین هیدروکلراید(2%)  mg/kg/IP5 وکتامین هیدروکلراید(10%)
  mg/kg/IP50 به­صورت داخل صفاقی انجام گردید. موش‌ها به صورت شکمی بر روی میز جراحی قرار داده شدند، سپس سطح پشتی موش­ها ازناحیه کتف تا ایلئوم آماده‌سازی و اسکراب شد و یک زخم مربع شکل با ابعاد 5/1 در 5/1 سانتی‌متری در محل بین دو کتف با پانچ پوستی ایجاد شد به طوری کـه لایــه­های اپی­درم و درم به
طور کامل برداشته شد. 
     ابتدا موش­ها به طور تصادفی به دوگروه 12تایی(شاهد و درمان شده با ژل پلاکتی) تقسیم شده، سپس هر کدام از این­ها خود به 4 زیر گروه 3 تایی(گروه­های نمونه‌برداری در روزهای مختلف( تقسیم شدند. در گروه درمان شده ژل پلاکتی به صورت موضعی در محل زخم مورد استفاده قرار گرفـت و در گـروه شاهد هیچ درمانی انجام نشد(شکل 1).
    درمان زخم­های پوستی در گروه درمان شده با ژل پلاکتی به صورت زیر انجام شد:
نمونه­های درمانی که روز 3 نمونه­برداری شدند          یک بار ژل پلاکتی دریافت کردند (فقط در روز 0)
نمونه­های درمانی که روز 5 نمونه­برداری شدند           دو
بار ژل پلاکتی دریافت کردند (روزهای 0، 3)
نمونه­های درمانی که در روز 7 نمونه­برداری شدند
سه بار ژل پلاکتی دریافت کردند(روزهای 0، 3، 5)
نمونه­های درمانی که در روز 14 نمونه­برداری شدند       
چهار بـار ژل پلاکتی دریافت کردنـد(روزهای 0، 3، 5، 12)
 
 

شکل 1: زخم پوستی 5/1 در 5/1 سانتی‌متری. زخم پوستی در محل بین دو کتف رت با پانچ پوستی ایجاد شد.
 
روش نمونه‌برداری از پوست:
    در پایان روزهای 3، 5، 7 و 14 در هر گروه شاهد و درمان از 3 موش صحرایی به منظور بررسی­های هیستوپاتولوژی و ایمنوهیستوشیمی توسط اسکالپل و پنس، نمونه‌ای جهت انجام آزمایش‌های مربوطه اخذ شد. بعد از نمونه‌برداری، نمونه پوست به منظور جلوگیری از چروکیده شدن بافت بر روی تکه‌ای مقوا چسبانده شد و سپس درون یک لوله فالکون mL 50 که حاوی 45 میلی‌لیتر فرمالین 10% بود قرار داده شد.
    در پایان روزهای نمونه­برداری پوست موش­های صحرایی­ بخیه گردید و نمونه­های پوست به آزمایشگاه پاتولوژی منتقل شد و پس از آماده­سازی به روش معمول، اسلاید هیستوپاتولوژی تهیه گردید.
    نمونه­های زخم پوستی با رنگ­آمیزی H&E و ماسون تریکروم برای ارزیابی هیستوپاتولوژی و فلورسنت ایمنوهیستوشیمی به روش غیر مستقیم جهت ارزیابی فاکتور VEGF طبق دستورالعمل استاندارد انجام شد(13، 12).
 
روش کار ایمنوهیستوشیمی:
روش تهیه پارافرمالدهید 4% :
    مقدار 20 گرم پارا فرمالدهید(آلمان، مرک) به500 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد. رویHot Plate  قرار گرفت تا دمای آن به 60 درجه سانتی‌گراد برسد. بعد از آن به محلول مورد نظر، سود(NaoH) اضافه گردید تا pH محلول به 2/7 تا 4/7 برسد. در مرحله آخر یک  قرص PBS (Phosphate Buffer Salin) درون محلول قرار داده شد.
 
روش تهیه اسید کلریدریک 2 طبیعی:
    مقدار 2 میلی‌لیتر اسید کلریدریک 5/37% به 11 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه گردید.
 
روش تهیه سرم بز 10 درصد و تریتون (Triton) 3/0%:
    مقدار 100 لاندا سرم بز به 900 لاندا PBS اضافه گردید و سرم بز 10% به دست آمد.
    مقدار 3 لاندا تریتون x100 به 997 لاندا PBS اضافه شد و تریتون 3/0% به دست آمد.
 
روش انجام کار:
    نمونه با PBS در 4 مرحله و به فاصله 5 دقیقه شسته شد. به منظور بازیابی آنتی‌ژنی بر روی نمونه‌ها، اسیدکلریدریک 2 طبیعی به مدت 30 دقیقه ریخته شد. بافر بورات به منظور خنثی‌سازی اسید به مدت 5 دقیقه اضافه شد و سلول­ها با PBS  شسته شدند. تریتون 3/0% به مدت 30 دقیقه به منظور نفوذ پذیر کردن غشاء سلول­ها استفاده گردید. با PBS شستشو داده شدند. سرم بز 10% برای مدت 30 دقیقه به منظور بلوک کردن واکنش آنتی‌بادی ثانویه به صورت رنگ اضافی زمینه اضافه شد. آنتی‌بادی اولیه رقیق شده(1 به 100) با PBS  به نمونه اضافه گردید و بعد از ایجاد یک محیط مرطوب برای جلوگیری از خشک شدن بافت، به مدت یک شب درون یخچال با دمای 2 تا 8 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. روز بعد ظرف حاوی بافت از یخچال خارج شد و سپس 4 بار و هر بار به مدت 5 دقیقه با PBS شستشو داده شد. به نمونه آنتی‌بادی ثانویه با رقت 1 به 150 اضافه گردید و سپس در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 ساعت و30 دقیقه در تاریکی انکوبه شد. بعد از آن نمونه از انکوباتور به اتاق تاریک منتقل گردید و بعد از 4 بار شستشو، به آن­ها DAPI اضافه گردید، بلافاصله برداشته و روی نمونه PBS ریخته شد. در مرحله آخر نمونه توسط میکروسکوپ فلوروسنت مدل Olympus و با لنز 400 برای تایید مارکرها مشاهده شد. سپس شاخص­های التیامی مانند میزان تشکیل بافت پوششی، میزان تشکیل کلاژن، میزان نفوذ سلول­های التهابی و میزان بیان فاکتور  VEGF مورد بررسی قرار گرفت.
میزان بیان VEGF به این ­صورت ارزیابی گردید:
1: 0% (بدون واکنش ایمنی) = 0 یا منفی
2: 1% تا 10% =  1+ یا مثبت ضعیف

3: 10% تا 50% = 2+ یا مثبت متوسط
4: بیشتر از 50% = 3+ یا مثبت شدید
 
تحلیل آماری:
    برای تحلیل داده­های هیستوپاتولوژی از بسته نرم‌افزاری
SPSS ورژن 22 استفاده شد و توسط آزمون کای‌اسکوئر (Chisquare) مورد بررسی قرار گرفت. مقادیر 05/0 p< از نظر آماری معنا­دار در نظر گرفته شدند. برای مقایسه میانگین از تحلیل واریانس(ANOVA) استفاده شد.
 
یافته‌ها
شمارش تعداد پلاکت­ها:
    تعداد پلاکت­های موجود در PRP در کیسه­های پلاکتی، 103×838 در هر میکرولیتر بود که به ­منظور تغلیظ بیشتر بعد از سانتریفیوژ و خالی کردن نیمی از محلول رویی، تعداد پلاکت­ها 103×1548 در هر میکرولیتر شده بود.
 
ارزیابی شاخص­های ترمیمی بافت پوست:
میزان تشکیل بافت پوششی:
    میزان تشکیل بافت پوششی در تمامی نمونه­ها مورد ارزیابی قرار گرفت(نمودار 1).

 
نمودار 1 : میزان تشکیل بافت پوششی در زمان­های مختلف. گروه درمان با حرف T و گروه شاهد با حرف C نشان داده شده است.
(* به معنای 05/0 p< و ** به معنای 01/0 p< و اختلاف معنا­داری از نظر آماری نشان می­دهند)



نمودار 2 : میزان تشکیل کلاژن در زمان­­های مختلف. گروه درمان با حرف T و گروه شاهد با حرف C نشان داده شده است.
(* به معنای 05/0 p< و اختلاف معنا­داری از نظر آماری نشان می­دهد).
 

نمودار3 : میزان سلول­های التهابی در زمان­های مختلف. گروه درمان با حرف T و گروه شاهد با حرف C نشان داده شده است.
 
(* به معنای 05/0 p<  و اختلاف معنا­داری از نظر آماری نشان می­دهد).
 
 
    همان طور که در نمودار مربوطه مشخص است، تفاوت معنادار بین گروه­های شاهد و درمان در روزهای 3 و 5 بعد از ایجاد زخم دیده می­شود به طوری که تشکیل بافت پوششی در روز 3 بعد از ایجاد زخم در گروه درمان وجود داشته اما در گروه شاهد تشکیل بافت پوششی وجود نداشته است و در روز 5 بعد از ایجاد زخم، در گروه درمان میزان تشکیل بافت پوششی نسبت به گروه شاهد بیشتر بوده است.
میزان تشکیل کلاژن:
    میزان تشکیل کلاژن در تمامی نمونه‌ها مورد ارزیابی قرار گرفت(نمودار 2). همان طور که در نمودار مربوطه مشخص است میزان تشکیل کلاژن در روز 5 بعد از ایجاد زخم در گروه درمان با اختلاف معنا­داری نسبت به گروه شاهد بیشتر است.
 
میزان نفوذ سلول­های  التهابی: 
    میزان نفوذ سلول­های التهابی در تمامی نمونه­ها مورد ارزیابی قرار گرفت(نمودار 3). همان طور که در نمودار مربوطه مشخص است، میزان نفوذ سلول­های التهابی در گروه درمان نسبت به گروه شاهد در روز 7 بعد از ایجاد زخم بیشتر است.
 
نتایج هیستوپاتولوژی بافت پوست:
    در لام­های هیستوپاتولوژی تهیه شده از بافت پوست، شاخص­هایی مانند تشکیل بافت پوششی، نفوذ سلول­های التهابی و میزان تشکیل کلاژن مورد ارزیابی قرار گرفتند (شکل‌های 2 و 3).
 

شکل 2 : هیستوپاتولوژی مقطع زخم در گروه درمان (سمت راست) و شاهد (سمت چپ) در روزهای سوم، پنجم و هفتم(به ترتیب الف، ب و ج). در گروه درمان مهاجرت سلول­های اپیدرم (پیکان) در کنار لبه زخم و نفوذ شدید سلول­های التهابی در درم(نوک پیکان) دیده می­شود. در گروه شاهد ضخیم شدن اپیدرم (پیکان) بدون هیچ گونه مهاجرتی در کنار لبه زخم و نفوذ شدید سلول­های التهابی در درم(نوک پیکان) دیده می­شود(الف)، در شکل ب، مهاجرت اندک سلول‌های اپیدرم(پیکان) در کنار لبه زخم و نفوذ شدید سلول‌های التهابی در دُم(نوک پیکان) دیده می‌شود. در شکل ج، مهاجرت زیاد سلول‌های اپیدرم(پیکان) در کنار لبه زخم و بافت جوانه گوشتی(نوک پیکان) در گروه درمان نسبت به شاهد به وضوح دیده می‌شود.


شکل 3 : هیستوپاتولوژی مقطع زخم در گروه درمان (سمت راست) و شاهد (سمت چپ) در روز پنجم(الف) عروق خونی تازه تشکیل(پیکان) و رشته‌های کلاژن(نوک پیکان) در بافت جوانه گوشتی دیده می‌شود. در روز هفتم(ب) رشته‌های کلاژن(نوک پیکان) با ضخامت قابل توجه دیده می‌شود. در گروه شاهد اپیدرم در حال ترمیم نیز(نوک پیکان) دیده می‌شود. در روز چهاردهم(ج) رشته‌های کلاژن با ضخامت مناسب و اپیدرم نوزایش یافته(نوک پیکان) دیده می‌شود.
 
 
جدول 1: نتایج ارزیابی ایمونوهیستوشیمی بافت پوست
 
میزان بیان VEGF با استفاده از آنتی بادی فلورسنت
روز 3 روز 5 روز7 روز14
درمان 2+ درمان 3+ درمان 3+ درمان 3+
شاهد 2+ شاهد 2+ شاهد 2+ شاهد 2+
 




شکل 4 : بیان متوسط VEGF در اطراف یک رگ خونی در گروه شاهد(A, C, E) در روزهای پنجم، هفتم و چهاردهم بعد از ایجاد زخم و بیان شدید VEGF در اطراف یک رگ خونی در گروه درمان(B, D, F) در روزهای پنجم، هفتم و چهاردهم بعد از ایجاد زخم 
(Indirect immunofluorescence of VEGF)


نتایج ایمنوهیستوشیمی بافت پوست:
    در این مطالعه، میزان بیان فاکتور  VEGFدر دو گروه درمان و شاهد در روزهای 3، 5، 7 و 14 بعد از ایجاد زخم توسط آنتی­بادی فلورسنت اندازه‌گیری شد(جدول 1). همان طور که در جدول مربوطه مشخص است، تفاوت معنادار بین گروه­های درمان و شاهد در روزهای 5، 7، 14 دیده می‌شود به طوری که میزان بیان VEGF در گروه‌های درمان شدید در حالی که میزان بیان این فاکتور رشد در گروه­های شاهد متوسط است(شکل 4).
 
بحث
    روند بهبود زخم­های پوستی شامل یکسری وقایع سلولی و بیوشیمیایی بنام هموستاز و التهاب، تکثیر، بلوغ و
بازسازی می‌باشد(14). امروزه روش­های درمانی مختلفی برای بهبود زخم وجود دارد اما روش درمانی که بتواند به تسریع این روند بهبودی کمک کند، بسیار ارزشمند است. تجمع پلاکت­ها در محل زخم و آزادسازی فاکتورهای رشد مختلف از آن­ها می­تواند محرکی برای تسریع مراحل ترمیم زخم باشند(15).
    در این مطالعه، هدف از تهیه ژل پلاکتی این بود که بتوان پلاکت­ها را با آگونیست­های قوی مانند ترومبین در حضور کلسیم فعال کرد تا بدین طریق محتویات گرانول‌های پلاکتی به بیرون تراوش کند(11). در ارزیابی‌های هیستوپاتولوژی شاخص­های ترمیمی مانند میزان تشکیل بافت پوششی، میزان تشکیل کلاژن و میزان نفوذ سلول­های التهابی بررسی شد که نتایج نشان ­داد استفاده ار ژل پلاکتی به­ صورت موضعی باعث تسریع در روند ترمیم زخم­های پوستی می­شود. هم چنین در ارزیابی ایمنوهیستوشیمی میزان بیان فاکتور VEGF در دو گروه شاهد و درمان گزارش شد. میزان رگ­زایی که در ترمیم زخم نقش مهمی ایفا می­کند به­ صورت اختصاصی با آنتی‌بادی فلورسنت ارزیابی شد. براساس نتایج به­ دست آمده از روز 5 بعد از ایجاد زخم، میزان بیان VEGF در گروه درمان شدید و در گروه شاهد متوسط مشاهده شد.
    در سال 2015 پارازی و همکاران سطوح بالایی از هورمون ها و مولکول­هایی با توانایی ترمیم بافت در ژل پلاکتی تهیه شده از خون بندناف کشف نمودند. ژل پلاکتی خون بندناف در مقایسه با خون محیطی غلظت­های بالاتری از چندین فاکتور رگ‌زا را دارد(16). در مطالعه حاضر نیز با ارزیابی­های هیستوپاتولوژی بافت مشاهده شد که استفاده از ژل پلاکتی به ­صورت موضعی باعث تسریع روند ترمیم زخم در گروه درمان نسبت به گروه شاهد می­شود. در ارزیابی ایمنوهیستوشیمی افزایش میزان رگ­زایی در گروه درمان شده با ژل پلاکتی نسبت به گروه شاهد مشاهده شد.
دمسی و همکارانش در سال 2016 اثر فاکتورهای رشد را بر ترمیم زخم­های پوستی در موش صحرایی مورد مطالعه قرار دادند. در مطالعه آن­ها، گروهی با تزریق فاکتور رشد EGF و گروهی دیگر با تزریق ترکیبی از چندین فاکتور رشد(VEGF، FGF و IGF) درمان شدند. نتایج حاصل از مطالعه آن­ها بیانگر این بود که تزریق چندین فاکتور رشد در مرز زخم­های پوستی منجر به بهبودی سریع­تر و کاهش بافت گرانوله می­شود و به ­طور کلی با ارزیابی­های هیستوپاتولوژی در گروه درمان، افزایش میزان رگ­زایی گزارش شده بود(17). در سال 2017 تاتار و همکارانش اثر PRP را بر ترمیم زخم­های پوستی در موش صحرایی مورد بررسی قرار دادند. موش­ها به گروه­های مختلفی تقسیم شدند. گروهی PRP را به صورت موضعی در محل زخم و گروهی دیگر  PRPرا به صورت تزریقی داخل زخم دریافت کردند. در نتایج به دست آمده از مطالعه آن‌ها، در روزهـای 7 و 14 بعـد از ایجـاد زخم در گروهی
که  PRPرا به صورت موضعی دریافت کردند میزان
رگ‌زایی به طور معنا­داری بیشتر از گروه­های دیگر بود (14). در مطالعه حاضر با ارزیابی ایمنوهیستوشیمی میزان بیان  VEGFدر روزهای مختلف بعد از ایجاد زخم بررسی گردید و یافته­های ایمنوهیستوشیمی بیانگر آن بود که میزان بیان فاکتور VEGF در روزهای 5، 7 و 14 بعد از ایجاد زخم در گروه درمان شده با استفاده موضعی از ژل پلاکتی نسبت به گروه شاهد بیشتر بوده است.
    دیوراکس و همکارانش در سال 2018 اثر PRP را بر فیبروبلاست­های پوستی مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان ­داد استفاده از PRP باعث افزایش فیبروبلاست­های پوستی می­شود که این فیبروبلاست­ها با مهاجرت و تکثیر در بافت گرانوله اطراف زخم ذخیره شده و باعث کاهش اسکار پوستی می­شوند(18). هم چنین در سال 2018 شو ایبی و همکارانش  اثر PRP را در تکثیر و مهاجرت فیبروبلاست­های پوستی انسان مورد مطالعه قرار دادند. هدف از این مطالعه، بررسی اثرات PRP بر روی بازسازی ماتریکس خارج سلولی بود که نیاز به فعال‌سازی فیبروبلاست­های پوستی دارد. PRP باعث تحریک تکثیر و مهاجرت فیبروبلاست­های پوستی و هم چنین افزایش بیان پروکلاژن І آلفا 1، الاستین، MMP-1، MMP-2 در فیبروبلاست­های پوستی می­شود در نتیجه می­تواند به تسریع ترمیم کمک کند(19). در مطالعه حاضر نیز در ارزیابی میکروسکوپی روز 5 بعد از ایجاد زخم، میزان تشکیل کلاژن در گروه درمان نسبت به گروه شاهد بیشتر مشاهده شد که نشان­دهنده تاثیر ژل پلاکتی بر تسریع روند ترمیم زخم است.
    عبداله و همکارانش در سال 2018 ، اثرات استفاده موضعی ازPRP (همولوگ) در خرگوش را بررسی کردند. در ارزیابی­های میکروسکوپی روز 3 بعد از ایجاد زخم در گروهی که PRP دریافت کردند، تشکیل بافت پوششی در بستر زخم به همراه افزایش میزان رگ­زایی به طور مشخص دیده شد(20). در نتایج میکروسکوپی ما در این مطالعه در روز 3 بعد از ایجاد زخم، تشکیل بافت پوششی در گروه شاهد مشاهده نشد در حالی که در گروه درمان شده با ژل پلاکتی، تشکیل بافت پوششی دیده شد اما برخلاف نتایج میکروسکوپی روز 3 بعد از ایجاد زخم در مطالعه آن­ها، میزان رگ­زایی در گروه شاهد و درمان در مطالعه حاضر مشابه بوده است(نتایج ایمنوهیستوشیمی). نتایج روز 7 در مطالعه آن­ها نشان داد در گروه درمان شده با PRP ، تشکیل بافت پوششی تکمیل و رشته­های کلاژن ضخیم نسبت به گروه شاهد دیده شد(20). اما در مطالعه حاضر تشکیل بافت پوششی و میزان کلاژن در دو گروه درمان و شاهد در روز 7  اختلاف آماری معنا­داری نداشت و در هر دو گروه درمان وشاهد بافت پوششی در حال ترمیم و رشته­های کلاژن با ضخامت قابل توجه دیده شد.
    در سال 2018 چونچارونی و همکارانش اثر ژل پلاکتی را بر ترمیم زخم­های پوستی در موش­های صحرایی مورد ارزیابی قرار دادند که همانند مطالعه ما از پلاکت انسانی برای ترمیم زخم­های پوستی در موش صحرایی استفاده شد با این تفاوت که آن­ها از PRP تاریخ گذشته­ استفاده کردند و آن را در دمای 70- درجه سانتی‌گراد نگهد­اری کرده و قبل از استفاده، PRP را در داخل یک ژلی که با محلول سدیم کربوکسی متیل سلولز، گلیسیرین، متیل پارابن و پروپیل پارابن تهیه شده قرار دادند(15). اما در مطالعه حاضر طرز تهیه ژل پلاکتی متفاوت بود زیرا ما ژل پلاکتی را با ترکیب PRP تازه و تغلیظ شده به همراه ترومبین تهیه کردیم. در مطالعه آن­ها ارزیابی میکروسکوپی در روزهای 3، 7 و 12 بعد از ایجاد زخم نشان ­داد که در روزهای 3 و 7 بعد از ایجاد زخم، در گروه درمان افزایش مهاجرت سلول­های اپی­تلیال و تشکیل بافت پوششی در محل زخم به خوبی دیده شد (15). در مطالعه حاضر نیز در مراحل ابتدایی روند ترمیم زخم، تشکیل بافت پوششی و افزایش نفوذ سلول­های التهابی تک هسته­ای قابل مشاهده بود که این امر نشان‌دهنده اثر ترمیمی ژل پلاکتی تهیه شده از
پلاکت تازه بر روند بهبود زخم­های پوستی می­باشد. به­ طور کلی پلاکت‌های تاریخ گذشته و کهنه با کیفیتی مشابه با پلاکت‌های تازه می­توانند در تهیه ژل پلاکتی مورد استفاده قرار گیرند زیرا فاکتورهای رشد موجود در پلاکت‌هاست که باعث تسریع روند ترمیم زخم­های پوستی می­شود (4).
 
نتیجه‌گیری
    در این مطالعه ارزیابی­های هیستوپاتولوژی و ایمنوهیستوشیمی انجام شده در روزهای مختلف بعد از ایجاد زخم نشان داد که استفاده از ژل پلاکتی حاوی فاکتورهای رشد در روند ترمیم زخم به­ویژه در مراحل ابتدایی ترمیم مؤثر است به طوری که با افزایش میزان رگ­زایی، تشکیل بافت پوششی و تشکیل کلاژن و هم­چنین افزایش نفوذ سلول­های التهابی(تک هسته­ای) به علت تولید انواع فاکتورهای رشد، سیتوکین­ها، کموکین­ها، مدیاتورهای پیش التهابی و اعمال اثرات ضد میکروبی در فرآیند التیام، باعث تسریع روند بهبود زخم­های پوستی می­شود. این مطالعه می­تواند در تعداد بیشتری از حیوانات آزمایشگاهی و با اندازه‌گیری شاخص­های پاتولوژی بیشتر تکمیل شود. بدیهی است کاربرد این ژل پلاکتی در انسان نیازمند انجام بررسی­های بیشتر از نظر میزان کارایی، ایمنی و اثر بخشی می­باشد.
 
تشکر و قدردانی 
 بدین وسیله از همکاری اساتید و کارکنان آزمایشگاه مرکز
تحقیقات سازمان انتقال خون ایران و اعضای محترم گروه
پاتولوژی و جراحی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران سپاسگزاری می‌نماییم.
ارسال پیام به نویسنده مسئول

ارسال نظر درباره این مقاله
نام کاربری یا پست الکترونیک شما:

CAPTCHA

XML   English Abstract   Print

Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Mohammadipour M, Amirizadeh N, Mortazavi P, Jahandideh A. Evaluation of human platelet gel effect on production process and expression level of VEGF in experimental skin wounds in rat. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2019; 16 (2) :103-115
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1251-fa.html
محمدی پور ماهان، امیری زاده ناصر، مرتضوی پژمان، جهاندیده علیرضا. اثر ژل پلاکتی بر روند ترمیم و میزان بیان فاکتور VEGF در زخم‌های تجربی پوست در موش صحرایی. فصلنامه پژوهشی خون. 1398; 16 (2) :103-115

URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1251-fa.html
بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.
جلد 16، شماره 2 - ( تابستان 1398 ) برگشت به فهرست نسخه ها
فصلنامه پژوهشی خون Scientific Journal of Iran Blood Transfus Organ
The Scientific Journal of Iranian Blood Transfusion Organization - Copyright 2006 by IBTO
Persian site map - English site map - Created in 0.06 seconds with 41 queries by YEKTAWEB 4645