بررسی مولکولی عفونت همزمان به ویروس‌های HCV و HBV در مبتلایان
به عفونت HIV در استان چهار محال و بختیاری
 
فرزانه طاهری¹، الهه تاج‌بخش²، احسان حیدری سورشجانی³
 
 
چکیده
سابقه و هدف
هپاتیت­های ویروسی B و C ، از مشکلات درمانی افراد مبتلا به عفونت HIV به ­شمار می­روند. اهمیت این عفونت‌ها در راه انتقال مشترک آن­ها است و نیز این که بیماری کبد در نتیجه عفونت با HCV و HBV و عفونت توأم با HIV می­تواند باعث مرگ شود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه توصیفی ـ مقطعی در سال 1394 ، تعداد 31 نمونه سرم از افراد مراجعه‌کننده به مرکز مشاوره بیماری­های رفتاری مرکز بهداشت استان چهار محال و بختیاری که از نظر ابتلا به HIV با روش وسترن بلات مثبت قطعی تشخیص داده شده بودند، با کسب رضایت ایشان تهیه و از نظر عفونت هم­زمان با ویروس‌های HBV و HCV به­ روش PCR مورد بررسی قرار گرفتند. یافته‌ها به کمک آزمون دقیق فیشر و نرم‌افزار 7 prism، تجزیه و تحلیل شدند.
یافته‌ها
نتایج حاصل از این تحقیق بر روی نمونه­های سرم افراد مبتلا به HIV ، فراوانی هم­ زمان عفونت HBV و HCV در افراد HIV مثبت را 22/3% ، فراوانی هم زمان عفونت HBV در افراد HIV مثبت را 45/6% و فراوانی هم زمان عفونت HCV در مبتلایان به HIV را 5/22% برآورد کرد.
نتیجه گیری
با توجه به راه­های مشترک انتقال ویروس­های HCV ، HBV و HIV ، تمامی افرادی که از نظرHIV آزمایش می­شوند و یا آلوده بهHIV  هستند بایستی از نظر ابتلا به ویروس­های هپاتیت B و C نیز بررسی شوند.
کلمات کلیدی: عفونت هم زمان، هپاتیت B، هپاتیت C، HIV، تشخیص مولکولی
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
تاریخ دریافت: 21/12/96
تاریخ پذیرش:  3  /7 /97
 

1- کارشنـاس ارشـد میکروبیولـوژی ـ مرکـز تحقیقات انتقال خون ـ موسسه عالی آموزش و پژوهشی طب انتقال خون و پایگاه منطقه‌ای انتقال خون شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران
2- مؤلف مسئول: دکترای میکروبیولوژی ـ دانشیار دانشکده علوم پایه دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران ـ صندوق پستی: 166
3- کارشناس ارشد ژنتیک ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزش و پژوهشی طب انتقال خون و پایگاه منطقه‌ای انتقال خون شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران

مقدمه ‌
    ایدز یا سندرم نقص ایمنی اکتسابی، نوعی بیماری است که در دستگاه ایمنی و توسط ویروس نقص ایمنی انسان ایجاد می‌شود. بیماری ایدز به­ علت نقص ایمنی شدیدی که ایجاد می­کند، بر تمام دستگاه­های بدن تأثیر می­گذارد. یکی از مشکلات بیماران مبتلا به HIV ، ابتلا همراه با هپاتیت B وC در این بیماران می­باشد. اهمیت این عفونت‌ها در راه انتقال مشترک آن­ها است و نیز این که بیماری کبد در نتیجه عفونت با HCV  وHBV  و عفونت توأم با HIV می­تواند باعث مرگ شود. در میان افراد آلوده به ویروس نقص ایمنی انسانی، اختلالات کبدی شایع است. با توجه به این­که عفونت درمان نشده ویروس نقص ایمنی انسانی منجر به تضعیف سیستم ایمنی و افزایش حساسیت فرد نسبت به عفونت­های مختلف می­گردد، بیماری کبدی ممکن است به ­واسطه هپاتیت­های ویروسی مزمن یا به علت راه­های مشترک انتقال هپاتیتB  وC حاد، نمای بیماری ویروس نقص ایمنی اکتسابی را پیچیده­تر سازد. به­ دلیل تشابه روش­های انتقال HIV، HCV و HBV ، ابتلای هم ­زمان به این دو عفونت بسیار شایع است. تخمین زده می­شود که 34 تا 36 میلیون نفر در سراسر جهان مبتلا به عفونت HIV ، 170 میلیون نفر مبتلا به HCV و 4 تا 5 میلیون نفر مبتلا به عفونت هم‌زمان HCV و HIV هستند(2، 1). بروز عفونت هم­زمان بهHIV  ، HCV وHBV بسته به فاکتورهای خطر مساعدکننده در کشورهای مختلف و حتی در مناطق مختلف یک کشور نیز متفاوت است(4، 3). شیوع عفونت هم زمان در افراد مبتلا به HIV در آمریکا 25%-4%، در ایتالیا 49%، اوکراین 70%، برزیل 45% و در ایران نیز آمارهای غیر رسمی بسیار متفاوت از 7/8% تا 9/94% گزارش شده است (6، 5). ابتلا به عفونت HCVوHBV به ­عنوان یک کوفاکتور مهم در پیشرفت ایمنولوژیکی و کلینیکی و هم چنین نتایج درمانی افراد مبتلا به عفونت HIV مطرح است (7). ابتلا به هپاتیت باعث سیر سریع­تر بیماران به سمت هپاتیت مزمن، سیروز و بدخیمی کبدی خواهد شد، این هم ­زمانی به ­ویژه در معتادان تزریقی، می‌تواند تا90% نیز برسد. مطالعه‌های بالینی نشان می‌دهند حدود 10% تا 15% افراد مبتلا به ویروس نقص ایمنی انسانی، به­ طور هم ­زمان مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت  B نیز هستند. در حالی که این نسبت در افراد غیر مبتلا به ویروس نقص ایمنی انسانی تنها 5% است. از آن ­جا که پیشرفت عفونت هپاتیت B و یا کارسینوم هپاتوسلولار در افراد آلوده به ویروس نقص ایمنی انسانی، نسبت به افراد صرفاً مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت به تنهایی، سریع­تر انجام می­شود، میزان بقای این بیماران به ­شدت کاهش می‌یابد، به ­طوری که تخمین زده می‌شود حدود 3/1% مرگ‌های افراد مبتلا به   HIVIبه ­طور مستقیم و یا غیر مستقیم به HCV مرتبط است(8). از طرف دیگر ابتلا به این عفونت هم­زمان سبب کاهش کلیرانس HCV شده و عوارض ناشی از ابتلا به عفونت HCV را نیز به­ شدت افزایش می­دهد(10، 9). HIV پاسخ ایمنی سلولی به آنتی‌ژن HCV را به ­شدت مختل نموده و سیر مزمن شدن بیماری کبدی را بسیار تسریع می­نماید(13-11). با توجه به آن چه بیان شد، تشخیص و مدیریت عفونت­های مشترک HIV و هپاتیت­های ویروسی می­تواند از پیچیده شدن فرآیند درمان و افزایش مرگ و میر در بیماران بکاهد از این رو هدف از این مطالعه، ­بررسی مولکولی عفونت هم­زمان به ویروس­های HCV و HBV در مبتلایان به عفونت HIV در استان چهارمحال و بختیاری بود.
 
مواد و روش‌ها
    این مطالعه توصیفی- مقطعی با همکاری مرکز مشاوره بیماری­های رفتاری استان چهارمحال و بختیاری به ­منظور تعیین میزان آلودگی به ویروس­های هپاتیت نوع B و C در مبتلایان به HIV در شهرستان شهرکرد در سال 1394 صورت گرفت. روش نمونه‌گیری در این مطالعه از نوع نمونه­گیری تصادفی ساده بود که  تعداد 31 نمونه از افراد مبتلا به HIV که قبلا آلودگی آن­ها به روش وسترن بلات تایید شده بود، تهیه گردید(محدودیت تشخیص کیت Adaltis برابر  IU/mL1 بود). تعداد 31 نمونه سرمی تهیه و تا زمان انجام آزمایش در فریزر70- درجه سانتی‌‌گراد نگهداری شدند. به­ منظور تشخیص ویروس هپاتیت نوع C با توجه به این­که این ویروس یک ویروسRNA دار می‌باشد، اقدام به استخراج RNA از نمونه­های مورد بررسی نمودیم. جهت استخراج RNA از نمونه‌های سرم مورد مطالعه از کیت استخراج RNA (RNX-PLUS) ساخت شرکت سیناژن ایران استفاده شد. جهت ساخت cDNA از کیت RT PreMix (ساخت شرکت بیونیر، آلمان) طبق دستورالعمل کیت مربوطه استفاده شد. برای این منظور 1 میکرولیتر از نمونه RNA به همراه 1 میکرولیتر راندوم هگزامر(فرمنتاس، آلمان) و 15 میکرولیتر آب مقطر حاوی DEPC به لوله‌های آماده کیت اضافه و با اعمال برنامه حرارتی 15 درجه به ­مدت 1 دقیقه، 55 درجه سانتی‌گراد به مدت 60 دقیقه و 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر رشته cDNA تهیه گردید. جهت انجام آزمایش Nested RT PCR به­ منظور تشخیص قطعی ژنوم ویروس HCV ، واکنش PCR طی دو مرحله با استفاده از دستگاه(اپندورف ـ آلمان) Master Cycler Gradient استفاده شد(جدول 1)(14). مرحله اول واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای خارجی در حجم نهایی µL 25 متشکل از µL 5/2 بافر با غلظت 10 برابر، mmoL 5/1 کلرید منیزیم، µmoL 100Mix dNTP ، 1 واحد آنزیم پلی‌مراز(فرمنتاس- لیتوانی) moL µ 1 از زوج آغازگرهای  F1و R1  انجام شد. راند دوم واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای داخلی در حجم نهایی µL 25 متشکل از µL 5/2 بافر با غلظت10 برابر، mmoL 5/1 کلرید منیزیم، µmoL 100 Mix dNTP ، 1 واحد آنزیم پلی‌مراز(فرمنتاس- لیتوانی) و µmoL 1 از زوج آغازگرهای F2 و R2 انجام شد.
    به ­منظور تشخیص مولکولیHBV ، استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA (شرکت سیناژن) و طبق راهنمای آن بر روی نمونه­های مثبت و کنترل مثبت و منفی اهدایی از دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد، صورت گرفت. جهت انجام آزمایش PCR به ­منظور تشخیص قطعی ژنوم ویروس HBV ، واکنشPCR  طی دو مرحله انجام شد(جدول 1)(15).
    مرحله اول واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای خارجی در حجم نهایی µL 25 متشکل از µL 5/2 بافر با غلظت 10 برابر، mmoL 5/1 کلرید منیزیم، µmoL 100 Mix  dNTP ، 1 واحد آنزیم پلی‌مراز(فرمنتاس- لیتوانی)، µmoL 1 از زوج آغازگرهای F3 ، R3 و DNA مربوط به هر ایزوله تنظیم شد. مرحله دوم واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای داخلی در حجم نهایی 25 میکرولیتر متشکل از محصول واکنش مرحله اول PCR ، PCR buffer 10x ، Mix dNTP mM 10، MgCl₂ mM50، آغازگرهای F4 و R4 ، آنزیم Smar Taq DNA Polymerase و آب مقطر انجام شد(14).
    برای ارزیابی کیفی DNA استخراج شده از الکتروفورز بر روی ژل آگارز 1% با رنگ اتیدیوم بروماید رنگ‌آمیزی و استفاده شد. سپس ژل در دستگاه ترانس لومیناتور قرار داده شده و با کمک نور UV، قطعات DNA مشاهده و با دستگاه Gel Documentation ثبت گردید. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم‌افزار 7 Prism و آزمون دقیق فیشر صورت گرفت.
 

جدول 1: آغازگرهای مورد استفاده جهت تشخیص ویروس‌های HCV و HBV
 

آغازگر		سکانس	اندازه قطعه(bp)
آغازگر HCV	آغازگرهای خارجی	F1: GGCGACACTCCACCATAGATC	bp 324
		R1: GGTGCACGGTCTACGAGACCT
	آغازگرهای داخلی	F2: CTGTGAGGAACTACTGTCTTC	bp 256
		R2: CCCTATCAGGCAGTACCACAA
آغازگر HBV	آغازگرهای خارجی	F3: TCGTGTTACAGGCGGGGTTT	bp 513
		R3: CGAACCACTGAACAAATGGC
	آغازگرهای داخلی	F4: CAAGGTATGTTGCCCGTTTG	bp 233
		R4: GGCACTAGTAAACTGAGCCA

یافته‌ها
    در این تحقیق نمونه‌های سرمی 31 فرد مبتلا به HIV که به روش وسترن بلات بیماری ایدز در آن­ها تشخیص داده شده بود، از نظـر آلودگـی هم­زمـان بـه ویـروس‌هـای HBV و HCV مورد بررسی قرار گرفتند. در 10 مورد(25/32%) آلودگی هم­زمان به HCV و در 2 مورد (45/6%) آلودگی هم­‌زمان به HBV گزارش گردید. تنها در 1 مورد (22/3%) عفونت هم­زمان ویروس­های HBV و HCV مشاهده شد(نمودار و شکل 1).
    در تجزیه و تحلیل آماری با آزمون دقیق فیشر، بین آلودگی به HIV و عفونت HCV با شاخص تکرارپذیری ارتباط معنادار مشاهده گردید(05/0 p<) اما بین آلودگی به HIV وHBV ارتباط معنادار مشاهده نشد.
    از 31 فرد مورد بررسی، 27 نفر مرد(09/87%) و 4 نفر زن(90/12%) بودند. در جنس زن آلودگی هم ­زمان با ویروس­هایHBV وHCV مشاهده نشد. در صورتی که در جنس مرد در 10 مورد(25/32%)، آلودگی هم زمان به HCV و در 2 مورد(45/6%) آلودگی هم­زمان به HBV گزارش گردید. در 1 مورد (22/3%) عفونت هم زمان ویروس­های HBV و HCV مشاهده شد. در تجزیه و تحلیل آماری با آزمون دقیق فیشر بین آلودگی به HIV و عفونت HCV در جنس مرد با شاخص تکرارپذیری ارتباط آماری معنادار مشاهده گردید(05/0 p<).
    از نظر وضعیت تأهل، 26 نفر(87/83%) متاهل و 5 نفر (12/16%) مجرد بودند. عفونت هم ­زمان به HBV و HCV در افراد متاهل تنها در یک نفر(84/3%) و در افراد مجرد نیز تنها در یک نفر(20%) گزارش گردید. در تجزیه و تحلیل آماری با آزمون دقیق فیشر، بین آلودگی به HIV و وضعیت تاهل با شاخص تکرارپذیری ارتباط معنادار آماری مشاهده گردید(05/0 p<).
    از نظر وضعیت اعتیاد، 24 نفر(41/77%) معتاد تزریقی و 7 نفر(58/22%) معتاد غیر تزریقی بودند. عفونت هم زمان به HBV و HCV در یک نفر از معتادان تزریقی گزارش شد(16/4%). عفونت هم­ زمان با HCV در معتادان تزریقی مبتلا به HIV در 10 نمونه(66/41%) و عفونت هم ­زمان بهHBV  در معتادان تزریقی مبتلا به HIV در 2 نمونه(33/8%) گزارش گردید. در معتادان غیر تزریقی، آلودگی هم­ زمان به HBV و HCV گزارش نشد. در تجزیه و تحلیل آماری با آزمون دقیق فیشر بین آلودگی به HIV و عفونت HCV در معتادان تزریقی با شاخص تکرارپذیری ارتباط معنادار آماری مشاهده گردید(05/0 p<). در صورتی­که بین آلودگی به HIV و عفونت HBV در معتادان غیر تزریقی ارتباط آماری معنادار مشاهده نشد.
    از نظر سابقه زندان، 4 نفر(9/12%) سابقه زندانی شدن داشتنـد و 27 نفـر(09/87%) سابقـه زندانـی شدن نداشتند.
 

نمودار 1: فراوانی آلودگی هم زمان به ویروس‌های HBV و HCV در مبتلایان به HIV
 
 
 
شکل 1. الف) مرحله اول واکنش Nested RT PCR. ستون M: مارکر 100 جفت بازی (فرمنتاز)،ستون 1: کنترل منفی، ستون 2: کنترل مثبت، ستون­های 5-4 نمونه­های HCV مثبت مورد بررسی ب) مرحله دوم واکنش Nested RT PCR. ستون 1: مارکر 100 جفت بازی (فرمنتاز)،ستون 2: کنترل منفی، ستون های 3، 4 و 5 نمونه های HCV مثبت مورد بررسی
 
جدول 2: آلودگی به HBV و HCV و فاکتورهای خطر مورد بررسی
 

	HCV		HBV
وضعیت تأهل	متأهل	مجرد	متأهل	مجرد
	0	0	1	0
	(0%)	(0%)	(84/3%)	(0%)
وضعیت اعتیاد	معتاد تزریقی	معتاد غیر تزریقی	معتاد تزریقی	معتاد غیر تزریقی
	10	2	0	0
	(66/41%)	(33/8%)	(0%)	(0%)
سابقه زندانی شدن	دارند	ندارند	دارند	ندارند
	1	0	0	0
	(22/3%)	(0%)	(0%)	(0%)