[صفحه اصلی ]   [Archive] [ English ]  
:: صفحه اصلي :: درباره نشريه :: آخرين شماره :: آرشيو مقالات :: جستجو :: ثبت نام :: ارسال مقاله :: تماس با ما ::
بخش‌های اصلی
مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون::
اطلاعات نشریه::
آرشیو مقالات::
برای نویسندگان::
برای داوران::
ثبت نام و اشتراک::
اخبار و رویدادها::
تماس با ما::
تسهیلات تارنما::
فرم تعهد نامه (الزامی)::
::
جستجو درتارنما

جستجوی پیشرفته
..
دریافت اطلاعات تارنما
نشانی پست الکترونیک خود را برای دریافت اطلاعات و اخبار پایگاه، در کادر زیر وارد کنید.
..
بانک تخصصی مقالات پزشکی

AWT IMAGE

..
نمایه ها
https://vlibrary.emro.who.int/journals_search/?skeyword=the+scientific+journal+of+iranian+blood+transfusion+organization&country=&subject=&indexing_status=&country_group=&so
..
:: جلد 15، شماره 3 - ( پاییز 1397 ) ::
جلد 15 شماره 3 صفحات 225-210 برگشت به فهرست نسخه ها
تاثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت بر میزان آپوپتوز و بیان نشانگرهای سطح سلولی CD33 و CD34 جهت رهیافت درمانی لوسمی میلوئیدی مزمن
داود نجفی ، عزت اله فتحی ، راحله فرحزادی
گروه علوم درمانگاهی ـ داشنیار دانشکده دامپزشکی دانشگاه تبریز
واژه‌های کلیدی: کلمات کلیدی: لوسمی میلوئیدی مزمن، سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان، آپوپتوز، هم‌کشتی
متن کامل [PDF 1048 kb]   (1855 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (4363 مشاهده)
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: سلولهاي بنيادي
انتشار: 1397/9/13
متن کامل:   (3379 مشاهده)
تاثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت بر میزان آپوپتوز و بیان نشانگرهای
سطح سلولی CD33 و CD34 جهت رهیافت درمانی لوسمی میلوئیدی مزمن
 
داود نجفی1، عزت‌اله فتحی2، راحله فرحزادی3
 
 
چکیده
سابقه و هدف
مقاومت دارویی در لوسمی میلوئیدی مزمن، یکی از چالش­ها در درمان این بیماری می­باشد. در این مطالعه با هدف القای آپوپتوز در سلول­های رده سلولی K562 (لوسمی میلوئیدی مزمن) و سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان رت (rBMSCs) جهت بررسی مارکر­های سطح سلولی CD33 و CD34 و هم چنین درصد آپوپتوز صورت گرفته، هم ­کشتی این دو رده سلولی انجام شد.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، پس از جداسازی rBMSCs ، این سلول­ها به لحاظ تمایز به استخوان، چربی و غضروف شناسایی و هم چنین از نظر بیان مارکر­های سطحی CD90 ، CD105 ، CD45 و  CD56تعیین ماهیت شدند. سپس سلول­های K562 جهت بررسی مارکر­های سطح سلولی CD33 و CD34 و آپوپتوز با استفاده از روش فلوسیتومتری جمع­آوری گردیدند.
یافته‌ها
نتایج حاصل از ایمنوفنوتایپینگ سلول­ها حاکی از بیان مثبت CD90 و CD105 و بیان منفی CD45 و CD56 بوده و بیان مارکر­های سطح سلولی CD33 و CD34 در رده سلولی K562 در حضور rBMSCs به ترتیب به میزان 2/45% و 5/76% افزایش یافت. القای آپوپتوز در رده سلولی K562 به طور معنادار و به میزان 6/56% در مقایسه با گروه کنترل افزایش نشان داد(05/0 p<).
نتیجه گیری
مطالعه حاضر نشان داد، هم­کشتی رده سلولی K562 با rBMSCs سبب افزایش معنادار در میزان بیان مارکر­های سطح سلولی CD33 و CD34 و القای آپوپتوز در رده سلولی K562 می­شود. این تاثیر می‌تواند از طریق فاکتور­ها و سیتوکاین­های مترشحه از سلول­های بنیادی مزانشیمی باشد. هر چند که ارزیابی بهتر این سیتوکاین­ها از نظر نوع آن­ها در مطالعه‌های آینده توصیه می­شود.
کلمات کلیدی: لوسمی میلوئیدی مزمن، سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان، آپوپتوز، هم‌کشتی
 
 
 
 
 
 
 
 
تاریخ دریافت: 5/12/96
تاریخ پذیرش: 19/2/97
 

1- دکترای عمومی دامپزشکی ـ دانشکده دامپزشکی دانشگاه تبریز ـ تبریز ـ ایران
2- مؤلف مسئول: متخصـص کلینیکال پاتولوژی دامپزشکی ـ گروه علوم درمانگاهی ـ دانشیار دانشکده دامپزشکی دانشگاه تبریز ـ تبریز ـ روبروی شهرک خاوران ـ ایران ـ کد پستی: 5166616471
3- متخصص بیوشیمی بالینی ـ استادیار مرکز تحقیقات هماتولوژی و انکولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران
 

مقدمه
    لوسمی میلوئیدی مزمن یا CML (Chronic myeloid leukemia)، یک سرطان میلوپرولیفراتیو است که 15% تا 20% کل لوسمی­های افراد بالغ را تشکیل داده و احتمالاً بیشترین مطالعه روی بدخیمی­های انسان روی این بیماری صورت گرفته است(1). CML توسط کروموزوم فیلادلفیا شناخته می­شود که در واقع یک ناهنجاری اکتسابی کلونال بوده و از جابه‌جایی کروموزوم­های 9 و 22 و تشکیل انکوژن اتصالی BCR-ABL ایجاد می‌گردد. در دهه­های اخیر تشخیص CML راحت­تر شده که علت درک عمیق‌تر پاتوژنز مولکولی و تعیین هدف­دار داروها به منظور عملکرد مناسب در محل مورد نظر می­باشد(2).
    در اواسط سال­های 1970، پیوند سلول­های بنیادی آلوژنیک موجب از بین رفتن کلون­های pH مثبت در بیماران CML گردید(3). سلول‌های بنیادی مزانشیمی، سلول‌های چند توان هستند که توان خودنوزایی و هم‌چنین تمایز به انواع دودمان‌های بافت همبند از جمله آدیپوسیت، کندروسیت و استئوسیت را دارا می‌باشند. در تماس مستقیم سلول با سلول، سلول‌های بنیادی مزانشیمی می­توانند با ترشح سیتوکاین­ها در فرآیند خونسازی نقش داشته باشند و بدین ترتیب سرنوشت سلول­های بنیادی خونساز را تعیین می­کنند(4). شواهد آزمایشگاهی نشان داده است که سلول‌های بنیادی مزانشیمی می­توانند موجب توقف رشد سلول‌های توموری در فاز 1G چرخه سلولی شوند(5). هم چنین مطالعه‌های گسترده­ای که در زمینه کنترل سلول­های توموری توسط سلول­های بنیادی صورت گرفته، نشان داده که سلول‌های بنیادی مزانشیمی می­توانند موجب مهار رشد تومور گردند (8-6). یکی از شواهدی که به هنگام تغییرات مورفولوژیکی و تشکیل بدخیمی­ها در سلول­ها قابل پیگیری است، تغییر در بروز و بیان نشانگر­های اختصاصی سطح سلول می­باشد(9). از نشانگر­های سطح سلولی موجود در سلول­های لوسمی میلوئیدی مزمن می‌توان CD33 و  CD34را نام برد. این دو نشانگر در حالت عادی در سطح سلول­های لوسمی میلوئیدی مزمن در سطح پایینی بیان می­شوند (10). در حال حاضر نشانگر CD34 شناخته‌شده­ترین آنتـی­ژن سطـح سلولـی اسـت کـه
بــرای تشخیص و جداسازی سلول‌های پیش­ساز خونساز در تمام رده‌های سلولی به کار می‌رود(11). نشانگر CD33  در ارتباط بین سلول‌ها و پیام رسانی نقش دارد، روی سلول‌های اجدادی میلوئیدی و منوسیتی وجود دارد و تقریباً در مراحل آخر بلوغ میلوسیتی از سلول حذف می‌گردد. آنتی بادی‌های مونوکلونال(MoAbs = Monoclonal antibodies) مولکول CD33 که برای درمان لوسمی میلوئیدی حاد مورد استفاده قرار گرفته است، حتی قبل از اقدام به روش درمانی جایگزینی مغز استخوان در این بیماران، در تشخیص لوسمی حاد از اهمیت بالایی برخوردار بوده‌اند چرا که امکان تشخیص سلول‌های لوسمی میلوئیدی حاد را از دیگر سلول‌های لنفوئیدی -CD33 (فاقد این نشانگر) می‌دهند(12، 11). آپوپتوز یک رخداد طبیعی بوده نقش کلیدی در سیستم ایمنی، تکامل و زندگی طبیعی موجودات بر عهده دارد(13). روش‌های مختلفی برای بررسی و ارزیابی آپوپتوز وجود دارد. یکی از این روش‌ها ارزیابی تغییرات غشای سیتوپلاسمی مانند بروز فسفاتیدیل سرین است. آمینوفسفولیپید­هایی مثل فسفاتیدیل سرین و فسفاتیدیل اتانول آمین در سمت داخل غشایی قرار گرفته‌اند. با شروع آپوپتوز، فسفاتیدیل سرین به سمت خارج غشایی حرکت کرده و در دسترس قرار می‌گیرد(شکل 1).
    امروزه سعی بر این است تا با به کارگیری روش­های متفاوت، آپوپتوز را القا نمود تا گامی مهم در درمان سرطان و سایر بیماری­ها برداشته شود(16-14). در مطالعه حاضر با استفاده از هم­کشتی سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان و سلول­های لوسمی K562 در پلیت­های مخصوص هم­کشتی، به بررسی روشن ساختن مکانیسم‌های دخیل در سطح سلولی پرداخته شد تا علاوه بر درمان­های موجود از قبیل شیمی­درمانی، دارو درمانی، درمان القایی و ... راه را برای روش­های درمانی جدیدتر برای این بیماری هموار­تر سازد. هدف از این مطالعه، بررسی تاثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت بر میزان آپوپتوز و بیان نشانگرهای سطح سلولی CD33 و CD34 در رده سلولـی لوسمـی میلوئیـدی مـزمـن (K562) بـود. بـدین منظـور ابتـدا سلــول­های بنیادی مزانشیمی از
 

 
شکل 1: دیاگرام سلول­های سالم و درگیر آپوپتوز همراه با نشانگر­های تشخیص آپوپتوز. در سلول­های طبیعی، فسفولیپید فسفاتیدیل سریل که دارای بار منفی است به کمک آنزیم فلیپاز در سمت سیتوزولی غشای سلول قرار دارد. با شروع آپوپتوز این فسفولیپید به سمت خارج غشایی سلول می­رود. در مراحل ابتدایی آپوپتوز که سلول هنوز تمامیت غشایی خود را حفظ کرده است، آنکسین v در حضور کلسیم به فسفاتیدیل سرین اتصال می­یابد. در این حالت هنوز رنگ PI نمی­تواند وارد سلول شود چرا که سلول آن را پس می­زند. در مراحل انتهایی آپوپتوز، سلول تمامیت غشایی خود را از دست داده و بدین ترتیب رنگ PI وارد سلول می­گردد(BD Biosciences, August 2011).
 
 
مغز استخوان رت جدا شده و پس از پاساژهای متوالی به پلیت­های مخصوص هم کشتی که حاوی سلول­های K562 بود انتقال داده شدند. تاثیر سلول­های بنیادی مزانشیمی بر روی آپوپتوز و بیان نشانگرهای سطح سلولی CD33 و CD34 در سلول­های K562 به وسیله فلوسیتومتری مورد ارزیابی قرار گرفت.
 
مواد و روش‌ها
مواد و وسایل مصرفی:
    مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. تمام مواد شیمیایی مورد استفاده به غیر از مواردی که در متن مقاله اشاره شده است، از شرکت سیگما ـ آلدریچ(آمریکا) و هم چنین تمام ظروف مخصوص کشت سلولی نیز از شرکت پوچئون(کره) تهیه شد.
 
استخراج سلول:
    پس از اخذ موافقت از کمیته اخلاق، پنج سر رت گونه رتوس نوروژیکوس(Rattis mprvegocis) با سن 6- 8 هفتگی از مرکز تحقیقات کاربردی و دارویی دانشگاه علوم پزشکی تبریز خریداری گردید. پس از بیهوشی رت­ها به وسیله داروهای کتامین - زایلازین(کتامین 5% با دوز mg/kg 90 و زایلازین 2% با دوز mg/kg 5) و تزریق دوز بالای داروهای بیهوشی، استخوان فمور آن‌ها جدا شد و با افزودن بافر فسفات سالین(PBS) حاوی آنتی‌بیوتیک داخل ظرف مناسب قرار داده شدند. به منظور جداسازی سلول‌های تک هسته‌ای، ابتدا استخوان‌ها چندین مرتبه با بافر PBS حاوی آنتی‌بیوتیک پنی‌سیلین- استرپتومایسین شستشو داده شدند. پس از شستشوی استخوان در شرایط استریل زیر هود، دو انتهای استخوان­ها بریده شد و با استفاده از سرنگ حاوی PBS از یک طرف استخوان عمل فلاشینگ انجام شد تا محتویات داخل استخوان به درون پتری دیش‌های استریل ریخته شود. سپس این محتویات به وسیله سمپلر و با استفاده از محلول DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles Medium) شستشو داده شد و سلول‌ها جمع­آوری شدند. نمونه‌ها وارد لوله­های فالکون­ 15میلی‌لیتر شده و به مدت 5 دقیقه با دور g ×360 سانتریفیوژ شدند. رسوب سلولی حاصل از سانتریفیوژ در یک حجم از PBS حل شده و به داخل فالکون حاوی فایکول برده شد. پس از سانتریفیوژ محلول حاصله در دور  g ×400 به مدت 25 دقیقه، سه فاز به دست آمد که سلول‌های فاز میانی برداشته شد. این سلول‌ها چندین مرتبه توسط محلول PBS حاوی 5% FBS (Fetal    Bovin   Serum) شستشـو داده شدنـد و بـا دور g ×360 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ گردیدند. پس از شمارش سلول­ها با لام نئوبار، در تراکم 105 × 5/1 سلول در هر سانتی­متر مربع در پلیت شش خانه کشت داده شدند. یک چهارم فضای پلیت کشت سلول پر شده و با محیط DMEM حاوی 10% FBS تغذیه شدند(17).
 
تعویض محیط، پاساژ سلولی و تعیین زمان دوبرابر شدن سلول­ها:
    تعویض محیط کشت سلولی در پلیت‌های شش خانه‌ای هر دو روز یک بار با محیط تازه انجام گرفت. پس از چسبیدن سلول‌های مزانشیمی دوکی شکل و رسیدن به مقدار رشد 70% تا 80%، سلول‌ها تریپسینه و کشت داده شدند(17). جداسازی سلول‌ها از کف فلاسک توسط 1 تا 2 میلی­لیتر محلول تریپسین 04/0% و EDTA 25/0% در دمای 37 درجه سانتی‌گراد برای مدت 2 تا 3 دقیقه صورت گرفت. با افزودن محیط کشت DMEM حاوی 10% FBS به این مجموعه، اثر تریپسین خنثی گردید. سوسپانسیون حاوی سلول به لوله فالکون 15 میلی­لیتری منتقل شد و با دور g ×360 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ گردید. محیط کشت حاوی 10% FBS به سه چاهک دوازده خانه(نسبت 1 به 3) افزوده شده و به منظور ایجاد سوسپانسیون سلولی یکنواخت، پیپتاژ گردید، در سه فلاسک با اندازه T25 تقسیم شد و به انکوباتور منتقل گردید. این سلول­ها تا پاساژ چهارم کشت داده شدند و در تمامی مراحل این تحقیق از سلول­های پاساژ چهارم استفاده شد. به منظور تعیین زمان دو برابر شدن سلول­ها، از نرم‌افزار اینترنتی doubling time calculator به آدرس اینترنتی  http:/ www. Doubling-time.com استفاده گردید. شمارش سلولی در ساعات 24، 48 و 72 انجام گرفته و داده‌های به دست آمده در اختیار این نرم‌افزار قرار گرفتند.
 
تایید سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان توسط فلوسیتومتری:
   در این مطالعه با استفاده از روش فلوسیتومتری بررسی نشانگرهای اختصاصی سطح سلول صورت گرفت (20-18). جهت آماده‌ سازی برای فلوسیتومتری، سلول‌ها به داخل فالکون 15 میلی­لیتری انتقال داده شده و پس از این مرحله 2 میلی­لیتر محیط کشت به آن افزوده گردید. فالکون حاوی سوسپانسیون سلولی با دور g ×360  به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شده و رسوب سلولی دو مرتبه با بافر شستشو (PBS حاوی 3% FBS) شستشو داده شد. رسوب سلولی شستشو داده شده با آنتی بادی‌های کونژوگه با فلورسئین ایزوتیوسیانات(برای CD45 ، CD56) و فیکواریترین(برای CD105 ، CD90) مخلوط گردید. پس از ریختن آنتی­بادی‌ها، حجم نهایی را به 100 میکرولیتر رسانده(توسط بافر شستشو) و به مدت 20 دقیقه محلول در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. پس از این مرحله، با 1 میلی­لیتر بافر شستشو، شسته شده و سانتریفیوژ گردید. مایع رویی دور ریخته شده و با افزودن 500 میکرولیتر از بافر شستشو به درون تیوب‌های جداگانه انتقال داده شد. نمونه­های حاصل با استفاده از فلوسیتومتر(BD ، بیوساینس، سان‌دیگو) مورد ارزیابی قرار گرفت.
 
بررسی توان تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی به چربی، استخوان و غضروف:
    به منظور اطمینان از مزانشیمی بودن و توان تمایزی این سلول­ها، از محیط تمایزی استخوان، چربی و غضروف برای سلول­های پاساژ چهارم استفاده گردید. پس از شمارش با لام نئوبار، تعداد ۱۰4 × ۸ سلول در پلیت­های شش خانه کشت داده شد. بعد از این که سلول‌ها ۷۰% تا ۸۰% سطح پلیت شش خانه را پر کردند از محیط تمایز به چربی(با محیط کشت حاوی: DMEM با گلوکز بالا و 10% FBS ، 05/0 میلی‌مولار اسکوربیک اسید، 1/0 میکرومولار دگزامتازون، ۱۰۰ نانومولار ایندومتاسین)، محیط تمایز به استخوان(با محیط کشت شامل: DMEM با گلوکز بالا و ۱۰% FBS ، ۱۰ میلی‌مولار بتا-گلیسروفسفات، 05/0 میلی‌مولار اسکوربیک اسید، 1/0 میکرومولار دگزامتازون) و محیط تمایزی سلول­های غضروف]محیط DMEM حاوی 10 نانوگرم فاکتور رشد TGF-β3 (Transforming Growth Factor-b3)، 10 نانوگرم BMP-6 (Bone morphogenetic protein-6)، 50 میلی‌گرم ITS (Insulin-Transferin Selenium)، 35/5 میلی‌گرم لینولئیک اسید، 1% سرم گاوی[ به مدت 21 روز استفاده گردید. هر ۳ روز یک بار محیط کشت سلول­ها تعویض می‌شد(23-21). جهت تایید تمایز چندگانه سلول­ها، رنگ­آمیزی­های اویل رد، آلیزارین رد و تولوئیدن بلو به ترتیب جهت بررسی تمایز به استخوان، چربی و غضروف انجام شد.
 
رنگ­آمیزی اویل رد:
    سلول‌های تمایز یافته به چربی سه مرتبه با PBS شسته شده و با استفاده از پارافرمالدئید 4% به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق فیکس شدند. پس از فیکس، سلول‌ها با آب مقطر شستشو داده شد و پس از خشک شدن 2 میلی‌لیتر از محلول رنگ­آمیزی اویل رد(آمریکا، سیگما) روی سلول‌ها اضافه گردید. پس از آن سلول‌ها در 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. پس از رنگ­آمیزی چندین مرتبه با آب مقطر شستشو داده و واکوئول­های چربی ایجاد شده با میکروسکوپ معکوس بررسی شدند.
 
رنگ­­آمیزی آلیزارین رد:
    سلول‌های تمایز یافته به استخوان سه مرتبه با PBS شستشو داده شدند و با استفاده از پارافرمالدئید 4% به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق فیکس شدند. بعد از انجام مرحله فیکساسیون، سلول‌ها با آب مقطر شستشو داده شدند و بعد از شستشو اجازه داده شد تا کاملاً خشک شوند. سلول‌ها برای مدت 30 تا ۶۰ دقیقه در دمای اتاق با رنگ آلیزارین رد(آمریکا، سیگما) ۲% (با ۷/۲ :PH) انکوبه شدند. در نهایت بعد از اتمام رنگ­آمیزی، سلول‌ها را با آب مقطر شستشو داده و رسوبات کلسیمی ایجاد شده با استفاده ازمیکروسکوپ معکوس بررسی گردیدند.
 
رنگ­آمیزی تولوئیدن بلو:
    سلول‌هـای تمایـز یافتـه به غضروف سه مرتبه با PBS شسته شده و با استفاده از پارافرمالدئید 4% به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق فیکس شدند. بعد از انجام مرحله فیکساسیون، سلول‌ها با آب مقطر شستشو داده شدند و پس از خشک شدن، ۲ میلی­لیتر از محلول رنگ­آمیزی تولوئیدن بلو(آلمان، سیگما) روی سلول‌ها اضافه شد. سلول‌ها برای مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق با رنگ تولوئیدن بلو انکوبه شدند. چندین مرتبه سلول‌ها توسط آب مقطر شستشو داده شدند و رسوبات اگرکان ایجاد شده با استفاده از میکروسکوپ معکوس بررسی شدند.
 
انجام آزمایشRT-PCR  :
    برای انجام آزمایش RT-PCR ، کل محتوای RNA سلولی سلول­های تمایز یافته به استخوان، چربی و غضروف با کیت شرکت یکتا تجهیز آزما استخراج گردید. RNAهای استخراج شده با DNase I (رُوش) تیمار شدند تا در صورت آلودگی نمونه­ها با DNA ، پاکسازی و خالص­سازی صورت گیرد. غلظت و خلوص نمونه­های RNA با روش اسپکتروفتومتری مورد ارزیابی قرار گرفت. نسخه‌برداری معکوس با استفاده از یک میکرو­گرم RNA استخراج شده، آغازگر راندوم هگزامر و کیتRevert AldTMH Minus First Strand cDNA Synthesis (فرمنتاز) انجام شد. الگوی مورد استفاده برای PCR در آزمایش، cDNA تولید شده بود. مواد مورد نیاز شامل: 2 میکرولیتـر cDNA (ng/mL 100)، 5/2 میکرولیتر بافر PCR ، 75/0 میکرولیتر MgCl2 (50 میلی‌مولار)، 5/0 میکرولیتر dNTPmix (10 میلی‌مولار)، 5/0 میکرولیتر Smar Taq (سیناژن، C110 TAB)(unit/µL 5( و یک میکرولیتراز هر آغازگر(یک میکرومولار) در یک لوله PCR با هم مخلوط شده و حجم لوله با استفاده از آب دو بار تقطیر به 25 میکرولیتر رسانده شد(جدول 1). محصولات PCR روی آگارز 1% جدا شده و با استفاده از دستگاه ژل داک مشاهده شدند(23، 17). شرایط PCR بدین صورت انجام گردید: الف- واسرشتگی ابتدایی (5 دقیقه با دمای 93 درجه سانتی­گراد)، ب- واسرشتگی هر مرحله(45 ثانیه با دمای 93 درجه سانتی­گراد)، ج- آنیلینـگ(بستـه بـه آغازگرهای هر ژن تفاوت می­کند)، د-
اکستنشن هر چرخـه(45 ثانیه)، و- اکستنشـن زمانــی(10
دقیقه با دمای 72 درجه سانتی­گراد).
 
کشت و نگهداری سلول‌های لوسمی رده K562 :
    سلول‌های K562 پس از خریداری از مرکز انستیتو پاستور به محیط کشت انتقال داده شدند. در آزمایشگاه با محیط کشـت 1640RPMI- در شرایـط: دمـای 37 درجه سانتی‌گراد؛ انکوباتور حاوی 5% 2CO و 95% رطوبت کشت داده شدند. به منظور تعویض محیط کشت، محلول سوسپانسیون سلولی به داخل لوله فالکون انتقال داده شد و سانتریفیوژ گردید(g ×360 به مدت 5 دقیقه). پس از دور ریختن محلول رویی، با بافر PBS شستشو داده و محیط کشت جدید در زیر هود به آن اضافه گردید. فلاسک حاوی سلول­ها در داخـل انکوباتـور قـرار گـرفت. در مدت زمان کشت و رشد سلول‌ها، به لحاظ رشد، تقسیـم سلولی، مـورفولوژی و آلودگـی محیطی هر روز با میکروسکوپ اینورت مورد بررسی قرار می‌گرفتند (24، 21).
 
هم­کشتی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان با سلول‌های رده K562 :
    در این مرحله، با استفاده از پلیت‌های مخصوص هم‌کشتی با قطر منافذ 4/0 میکرومتری، هم­کشتی دو رده سلولی K562 و سلول­های بنیادی مزانشیمی انجام گرفت. پس از کاشتن تعداد 105 از سلول‌های بنیادی مزانشیمی در هر کدام از چاهک‌های بالایی پلیت و گذشت 24 ساعت(به منظور چسبیدن سلول‌ها به کف پلیت)، تعداد 106 عدد از سلول‌های K562 (نسبت 1 به 10) در هر چاهک از پلیت شش خانه کاشته شد. محیط مورد استفاده در هم­کشتی RPMI دارای 10% FBS بود. به مدت هفت روز و با دو بار تعویض محیط کشت، پلیت در داخل انکوباتور(5% 2CO، دمای 37 درجه سانتی‌‌گراد و 95% رطوبت) قرار گرفت(26، 25، 21).
 
بررسی آپوپتوز توسط روش فلوسیتومتری:
    بـرای بـررسی و ارزیابـی آپـوپتوز در سلول­هــای رده K562 پس از هم­کشتی با سلو­ل‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان، از فلوسیتومتری استفاده گردید(27، 26). به همین منظور کیت Annexin V FITC Apoptosis خریداری شده و پس از آماده­سازی بافر اتصال(Binding buffer)، جمع­آوری نمونه­ها و شستن آن­ها توسط PBS با سانتریفیوژ با دور g ×360 به مدت 5 دقیقه انجام گردید. پس از آن شستشوی دوباره با بافر اتصال صورت گرفته و پس از دور ریختن مایع رویی، 100 میکرولیتر بافر اتصال به همراه 5 میکرولیتر آنکسینV متصل به رنگ FITC  به تعداد 105 سلول افزوده شد. محلول حاصله به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق و در تاریکی انکوبه گردید. پس از سانتریفیوژ با دور g ×360 به مدت 5 دقیقه، 190 میکرولیتر بافر اتصال و 10 میکرولیتر پروپیدیوم یدید به منظور رنگ‌آمیزی به نمونه­ها افزوده شد. 5 دقیقه بعد از افزودن پروپیدیوم یدید، سنجش نمونه‌‌ها با دستگاه فلوسیتومتری (FACSCalibursystem BD)(بیوساینس، سان‌دیگو) انجام گردید. نتایج حاصل از فلوسیتومتری در یک جدول چهار خانه گزارش می‌گردد: 1- ناحیه آنکسین V-/PI-: در این ناحیه، سلول‌های زنده قرار می­گیرند. 2- ناحیه آنکسین V+/PI-: در این ناحیه، سلول­های آپوپتوتیک اولیه قرار دارند. 3- ناحیه آنکسین V+/PI+: در این ناحیه، سلول­های مرده توسط نکروز و آپوپتوز ثانویه قرار می­گیرند. 4- ناحیه آنکسین V-/PI+: در این ناحیه، سلول­های آسیب دیده در طی مراحل آماده‌سازی قرار دارند(آپوپتوز در آن‌ها رخ نداده است).
 
بررسی نشانگرهای سطح سلولی CD33 و CD34 :
    جهت بررسی تاثیر هم­کشتی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان رت بر میزان بیان نشانگرهای سطح سلولی CD33 و CD34 سلول‌های رده K562 از روش فلوسیتومتری استفاده شد. در این مرحله سلول­ها به داخل فالکون 15 میلی­لیتری انتقال داده شده و همراه با 2 میلی­لیتر بافر شستشو(بافر PBS حاوی 3% FBS) سانتریفیوژ (g ×360 ، 5 دقیقه) و شستشو داده شدند و رسوب سلولی حاصله با آنتی‌بادی‌های کونژوگه با فلورسئین ایزوتیوسیانات(برای CD34) و فیکواریترین (برای CD33) تیمار شدند. پس از ریختن آنتی‌بادی‌ها، حجم نهایی محلول را با بافر شستشو به 100 میکرولیتر رسانده و به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انکوبه گردید. پس از دو بار سانتریفیوژ کردن به منظور حذف آنتی‌بادی‌های اضافه، 500 میکرولیتر بافر شستشو داخل میکروتیوب‌های نمونه ریخته شده و چند بار پیپتاژ گردید. پس از این که سلول‌ها به طور کامل در محلول شناور شدند، داخل لوله آزمایش برده و داخل دستگاه فلوسیتومتر(بیوساینس، سان‌دیگو)(FACSCalibursystem)
گذاشته تا عملیات فلوسیتومتری صورت پذیرد(21).

یافته‏ها   
کشت، پاساژ و زمان دو برابر شدن سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان:
    طی ساعات اولیه پس از کشت، سلول‌ها هنوز مشخصات سلول­های فیبروبلاستی را نشان نمی­دادند به صورتی که این سلول­ها گرد بوده و دارای هسته‌های نامشخص بودند. سلول‌ها پس از گذشت 2 روز از کشت، کشیده شده و کمی دوکی شکل شدند و پس از 72 ساعت از نظر مورفولوژی شبیه سلول‌های فیبروبلاست گردیدند.
 

شکل 2: سلول­های بنیادی مشتق از مغز استخوان رت. در شکل بالا: (A) سلول‌ها قبل از اتصال حالتی گرد و هسته نامشخص داشتند اما سلول‌های جدا شده از مغز استخوان فمور 24 ساعت بعد کشت اولیه، پس از اتصال به کف ظرف کشت، ظاهری دوکی شکل به خود گرفتند. (B) سلول‌های جدا شده 5 روز پس از کشت اولیه را نشان می‌دهد که کاملاً کشیده و دوکی شکل شده و ظاهری شبیه به سلول‌های فیبروبلاست پیدا کرده‌اند. (C) سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان رت در پاساژ 4. سلول‌ها در این تصویر، کاملاً یک دست بوده و شکل معمول سلول­های بنیادی مزانشیمی را از خود نشان می­دهند. در این زمان رشد و تکثیر سلول‌ها بالا رفته است، این سلول­ها هم­اکنون مناسب مطالعه هستند(بزرگنمایی x40).
 
 
 

نمودار 1: زمان دو برابر شدن سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان رت. در این تصویر، محور عمودی نشان‌دهنده تعداد سلول‌های زنده شمارش شده با استفاده از رنگ­آمیزی تریپان‌بلو بوده و محور افقی نشان‌دهنده بازه‌های زمانی در ساعات مختلف 0، 24، 48 و 72 می‌باشد. زمان دو برابر شدن در این سلول‌ها 5/19 ساعت بود.
 
 


نمودار 2: آنالیز فلوسیتومتری سلول‌های بنیادی مزانشیمی در مجاورت آنتی‌بادی‌های CD90 و CD105. بیان این نشانگرهای سطح سلولی به ترتیب 5/92% و 5/90% می‌باشد.
 
 

نمودار 3: آنالیز فلوسیتومتری سلول‌های بنیادی مزانشیمی در مجاورت آنتی‌بادی‌های CD45 و CD56. بیان این نشانگرهای سطح سلولی به ترتیب 27/0% و 39/0% می‌باشد.
 
 
پس از پاساژ سلولی اول، سرعت دو برابر شدن سلول‌ها تقریباً 20 ساعت بود و سلول‌ها پس از گذشت 8  و 11 روز به پاساژ 2 و 3 رسیدند(شکل2 و نمودار 1).
 
بررسی نشانگر­های سطح سلولی سلول‌های بنیادی مزانشیمی:
    با استفاده از نشانگر­های سطح سلولی می­توان مزانشیمی بودن سلول‌های بنیادی مزانشیمی را اثبات نمود. در این روش بیان نشانگرهای سطح سلولی CD90 ، CD105، CD45 و CD56 مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج آزمون فلوسیتومتری نشان داد که سلول‌های آزمایش شده، نشانگرهای سطح سلولیCD90  و CD105 (مربوط به سلول‌های بنیادی مزانشیمی) را بیان نموده ولی CD56 و CD45 (مربوط به سلول­های هماتوپوئتیک) را بیان نکردند(نمودارهای 2 و 3).
 
تمایز به چربی:
    در این پژوهش قدرت تمایز به سلول‌های چربی نیز مورد بررسی قرار گرفت(شکل A3). تمایز BMSCs به سلول‌های چربی با استفاده از رنگ­آمیزی با اویل رد تایید گردید. نوک پیکان­ها، وزیکول‌های کوچک پراکنده و قطرات چربی در داخل سلول‌ها را نشان می­دهند. به علاوه نتایج RT-PCR حاکی از تولید ژن­های ویژه بافت چربی شامل PPAR-α و PPAR-γ بود(شکل D3).
 
تمایز به استخوان:
    نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که سلول‌های بنیادی مشتق از مغز استخوان می‌توانند پس از 21 روز قرار گرفتن در محیط کشت تمایزی حاوی عوامل رشد استخوانی، به سلول‌های استخوان­ساز تبدیل شوند(شکل B3). اولین نشانه‌های بارز تغییر مورفولوژی و تمایز به صورت تشکیل شدن توده‌های سلولی و بزرگ‌تر شدن آن‌ها در مناطق لایه‌های تک سلولی در روز 5 پس از القای تمایز دیده شد. برای تشخیص حضور رسوب املاح معدنی به خصوص کلسیم و تایید تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان از رنگ­آمیزی آلیزارین رد استفاده گردید. توده‌های قرمز رنگ نشان‌دهنده رسوبات معدنی بوده و نشان از معدنی شدن ماتریکس داشتند. بررسی بیشتر با روش RT-PCR نشان داد که در توده سلولی تمایز یافته، مارکرهای اختصاصی آلکالین فسفاتاز(ALP) و استئوپوئتین(OCN) بیان شده است (شکل E3).
 
تمایز به غضروف­:
    در این پژوهش قدرت تمایز به سلول‌های غضروف‌ساز نیز مورد بررسی قرار گرفت. در برخی مناطق کشت توده­های سلولی تشکیل یافت(شکل C3). دوره تمایزی این سلول‌ها 21 روز بود و توسط رنگ‌آمیزی تولوئیدن بلو بررسی شدند. رنگ بنفش نشان‌دهنده متاکرومیک بودن و حضور ماتریکس غضروفی در این سلول‌ها بود و آنالیز RT-PCR نشان داد که mRNA مربوط به ژن­های اگرکان و کلاژن نوع II تولید شده است (شکل F3).
 


شکل 3: تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان به سلول‌های چربی­ساز، استخوان­ساز و غضروف­ساز. A : 21 روز پس از تیمار، تمایز BMSCs به سلول‌های چربی با استفاده از رنگ­آمیزی با اویل رد تایید گردید. وزیکول‌های کوچک پراکنده و قطرات چربی در داخل سلول‌ها قابل مشاهده می­باشد.B :21 روز پس از تیمار، تمایز BMSCs به سلول‌های استخوانی توسط رنگ­آمیزی آلیزارین رد مشخص گردید. توده‌های قرمز رنگ نشان­دهنده رسوبات معدنی هستند.C : 21 روز پس از تیمار، تمایز BMSCs به سلول‌های غضروفی با استفاده از رنگ­آمیزی تولوئیدن بلو تایید گردید. رنگ بنفش رسوبات سلولی، نشان‌دهنده حضور رسوبات اگرکان در ماتریکس غضروفی است(بزرگنمایی x40). D-F : مارکرهای اختصاصی سلول­های چربی، استخوان و غضروف با RT-PCR نشان داده شده است.
 

کشت و نگهداری سلول‌های لوسمی رده K562 :
    این رده سلولی به صورت آماده از انستیتو پاستور خریداری گردید. از مشخصات این سلول‌ها، رشد سریع و مقاومت بالا است که در فاز بلاستیک لوسمی میلوئیدی مزمن قرار داشتند.
    از دیگر ویژگی‌های این سلول‌ها خاصیت نیمه شناور بودن آن‌هاست که نیاز به استفاده از آنزیم تریپسین نخواهد داشت. سلول‌های زنده در زیر میکروسکوپ ظاهری کروی داشته و به صورت یک کلنی، کانون‌هایی را در نزدیک یکدیگر به صورت مجموعه تشکیل می‌دهند. در صورتی که سلول‌های مرده به صورت جمع شده بوده و جدا جدا هستند.
نتایج حاصل از آزمایش آنکسین V/PI در سلول­های K562 پس از هم­کشتی با سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان:
    یکی از ویژگی­های آپوپتوز از دست رفتن غشای سلو‌ل­های آپوپتوتیک می­باشد. فسفاتیدیل سرین در سلول‌های آپوپتوتیک به سطح خارجی غشا منتقل شده و آنکسین V تمایل بالایی را برای باند شدن به آن نشان می­دهد(نمودار 4). بررسی نتایج حاصل از 7 روز هم­کشتی سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان با سلول­های K562 نشان داد که این هم­کشتی می­تواند موجب القای آپوپتوز به میزان 6/56% در سلول­های K562 گردد.
 
 

نمودار 4: نمودار نقطه­ای حاصل از بررسی میزان آپوپتوز در سلول­های K562 با استفاده از روش آنکسین V/PI. A و C : توزیع جمعیت سلول‌های K562 بدون هم­کشتی و همراه با هم­کشتی سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان. B و D : میزان و نوع مرگ سلولی سلول­های K562 بدون هم­کشتی و همراه با هم­کشتی سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان. نواحی Q1، Q2، Q3 و Q4 به ترتیب بیانگر میزان توزیع سلول­ها در منطقه نکروز، آپوپتوزی ثانویه، آپوپتوزی اولیه و سالم می­باشند.
 

بیان نشانگرهای سطح سلولی CD33 و CD34 در سلول‌های K562 پس از هم­کشتی با سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان:
    جهت بررسی تأثیر هم­کشتی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان بر نشانگرهای سطح سلولی CD33 و CD34 در سلول‌های K562 از روش فلوسیتومتری استفاده گردید. نتایج این بررسی نشان داد که میزان بیان نشانگرهای سطح سلولی CD33 و CD34 در سلول‌های K562 که در هم­کشتی با سلول‌های بنیادی قرار گرفتند به ترتیب 2/45% و 5/76% بوده و نسبت به گروه کنترل افزایش یافته است(نمودارهای 5 و 6).
 
 

نمودار 5: نمودار نقطه­ای آنالیز فلوسیتومتری سلول‌های K562 ، در مجاورت آنتی‌بادی CD33. A و C : توزیع جمعیت سلول­های K562 بدون هم­کشتی و همراه با هم­کشتی سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان در حضور آنتی‌­بادی CD33 . B و D :  میزان بیان نشانگر سطح سلولی CD33 سلول­های K562 بدون هم­کشتی و همراه با هم­کشتی سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان. بیان این نشانگر سطح سلولی در حضور سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان 2/45% می‌باشد.
 
   

نمودار 6: نمودار نقطه­ای آنالیز فلوسیتومتری سلول‌های K562 ، در مجاورت آنتی‌بادی CD34. A و C :  توزیع جمعیت سلول­های K562 بدون هم­کشتی و همراه با هم­کشتی سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان در حضور آنتی‌­بادی CD34 . B و D : میزان بیان نشانگر سطح سلولی CD34 سلول­های K562 بدون هم­کشتی و همراه با هم­کشتی سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان. بیان این نشانگر سطح سلولی در حضور سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان 5/76% می‌باشد.
 

بحث
    در مطالعه حاضر سلول­های بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان رت استخراج و پس از کشت و پاساژ سلولی تا چهار مرحله همراه با سلول­های رده K562 در پلیت هم‌کشتی قرار داده شدند. پس از 7 روز هم­کشتی، میزان آپوپتوز و بیان نشانگرهای سطح سلولی CD33 و CD34 در سلول­های رده K562 بررسی گردید.
    امروزه روش­های درمانی به سمت استفاده از سلول درمانی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی به عنوان روشی مناسب و ایمن در امر درمان سرطان­های بدخیم سوق پیدا کرده است. سلول­های بنیادی مزانشیمی یکی از برجسته­ترین سلول­های مورد استفاده در امر سلول درمانی می­باشنـد. رامـاسامی و همــکاران(2007) تاثیر سلول­های
بنیادی مزانشیمی مغز استخوان را روی رده سلولی 173BV که از سلول­های توموری خون­ساز هستند مورد بررسی قرار دادند که نتایج این تحقیق نشان داد سلول‌های بنیادی مزانشیمی اثر ضد رشد را به صورت وابسته به دوز، بر روی این رده سلولی نشان می­دهند(5). نتایج حاصل از تحقیق راماسامی، نتایج مطالعه انجام شده توسط لی و همکاران(2011) را در رابطه با تاثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی انسانی بر روی تومور ریوی رده سلولی A549 و سرطان مری رده سلولی Eca-109 تایید می­کند و نشانگر توانایی سلول­های بنیادی مزانشیمی در القای آپوپتوز در سلول­های توموری است(28). در این مطالعه، میزان و درصد آپوپتوز با روش فلوسیتومتری و با استفاده از آنکسین V مورد ارزیابی و تجزیه و تحلیل قرار گرفت. با شروع آپوپتوز، فسفاتیدیل سرین که در حالت عادی در سطح داخلی غشا سلولی است به سمت خارجی غشا منتقل می­گردد(29). تحقیقات نشان داده است که آنکسین V می­تواند به صورت اختصاصی و در حضور کلسیم به فسفاتیدیل کولین متصل گردد(27، 26). در مطالعه سچیرو و همکاران که بر روی تأثیر هم‌کشتی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان انسان با لنفوم غیر هوچکین صورت گرفت، میزان آپوپتوز با استفاده از آنکسین V مورد ارزیابی قرار گرفت(30). نتایج این تحقیق نشان داد که این هم­کشتی موجب القای آپوپتوز در سلول­های لنفوم غیر هوچکین می­گردد و این نتایج همسو با نتایج مطالعه حاضر می­باشد.
    یکی از جالب توجه­ترین استراتژی­های درمان سرطان‌های بدخیم استفاده از راه‌کارهایی است که بتواند مرگ آپوپتوتیک را در این سلول­ها القا نماید چرا که بر خلاف نکروز، آپوپتوز در یک سلول به سلول­های مجاور آسیبی وارد نمی­کند و التهاب یا آسیب بافتی ایجاد نمی‌کند(31). دینگ و همکاران(2009) در نتایج مطالعه‌های خود بیان کردند که سلول­های بنیادی مزانشیمی انسان سلول­های K562 را در مرحله G0 و G1 سلولی نگه داشته و موجب القای آپوپتوز در این سلول­ها می­شوند. این اثر مهاری وابسته به تعداد سلول­های بنیادی بوده به صورتی که در مقادیر بالا، باعث اثر مهاری بیشتر می‌گردد. بررسی این عملکرد پس از هم­کشتی سلول­های لوسمی میلوئیدی مزمن با سلول­های بنیادی در تعداد برابر و مقادیر متفاوت صورت پذیرفت. پس از بررسی با روش فلوسیتومتری مشخص گردید که در تعداد برابر سلول­ها در هم­کشتی، سلول­های بنیادی می­توانند موجب مهار رشد سلول­های K562 شوند که این اثر مهاری در تعداد بالاتر سلول­های بنیادی بیشتر می­شود(32). نتایج این محقق همسو با نتایج مطالعه حاضر می­باشد که در نسبت 1 به 10، سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان به سلول­های K562 هم­کشتی داده شدند و مشاهده شد میزان آپوپتوز در سلول­های K562 به میزان 6/56% افزایش یافت. علاوه بر این در مطالعه­ای دیگر مشاهده شد که هم­کشتی سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان افراد مبتلا به لوسمی میلوئیدی مزمن موجب مهار رشد سلول­های لوسمی گردید که این عملکرد به وسیله ترشح اینترفرون آلفا بود(33).
    CD34 ، نشانگر سطح سلولی سلول‌های پیش‌ساز خونساز بوده که توسط بسیاری از سلول‌های طبیعی خونساز اولیه و نیز بسیاری از لوسمی­های حاد ساخته می‌شود. پس از بررسی بیان c-kit و  CD34در یک مطالعه، مشاهده شد که بیان مولکول CD34 در سلول‌های CML در فاز بلاستیک بسیار بالا می‌رود(34). در مطالعه دیگری نشان داده شد که میزان سلول‌های CD34+ در بیماران مبتلا به CML نسبت به سلول‌های CD34+ در افراد طبیعی به طور معناداری بالاتر بود(35). نشانگر CD33 در ارتباط بین سلول‌ها و علایم‌رسانی نقش دارد و روی سلول‌های اجدادی میلوئیدی و منوسیتی وجود دارد و تقریباً در مراحل آخر بلوغ میلوسیتی از سلول حذف می‌گردد. الگوی بیان CD33 در سلول‌های خونساز نشان‌دهنده یک نقش بالقوه CD33 در تنظیم تمایز سلول‌های میلوئیدی است. در واقع می­توان گفت که CD33 در سلول­های میلوئیدی و پیش­ساز­های آن­ها بیان می­گردد و یک آنتی­ژن پان­میلوئیدی(Pan myeloid antigen) می­باشد(12). در مطالعه حاضر مشاهده شد که نشانگرهای سطح سلولی CD33 و CD34 در سلول­های K562 تیمار نشده با سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان در حد بسیار پایینی بیان شده و یا اصلاً بیان نمی­گردند. در صورتی که همین سلول­ها در تیمار با سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان، نشانگرهای سطح سلولی CD33 و CD34 را در حد بالایی(2/45% و 5/76%، به ترتیب) بیان نمودند. در مطالعه اینوئه و همکاران (2014) مشاهده شد که نشانگر CD33 در سلول­های K562 زمانی که سلول­ها در حالت نابالغ (state Immature) باشند، در حد بالایی(7/61%) بیان می‌گردد که البته این اختلاف ممکن است به دلیل تفاوت در آنتی­بادی مورد استفاده و فاکتور­های تکنیکی(حساسیت فلوسیتومتری، گیت‌بندی و ...) باشد(36). علاوه بر این ثابت شده است که سلول­های CML که نشانگر CD34 را در حد بالایی بیان می­کنند، نسبت به سلول­های CML که این نشانگر را بیان نمی­کنند، به درمان با دارو­های مهار­گر­ تیروزین کیناز از قبیل داساتینیب(Dasatinib) و پوناتینیب(Ponatinib) به طور معنا­داری حساس­تر هستند. با این حال سلول­های پیش‌ساز نابالغ  CMLکه نشانگر CD34 را بیان نمی­کنند، نسبت به درمان مقاوم­تر هستند(37). بنابراین با توجه به شواهد به دست آمده از تحقیق حاضر و با توجه به این که سلول­های CML در حالت بالغ عمر کمتری داشته و حساسیت بالایی را نسبت به دارو درمانی نشان می­دهند، احتمال می­رود روش درمانی جدیدی برای بیماری CML داشته باشیم که بتوان با استفاده از سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان، تمایز سلول­های نابالغ و پیش­ساز CML را به سلول­های بالغ القا نمود.
 
نتیجه‌گیری
    در مجموع نتایج این مطالعه نشان داد که هم­کشتی سلو­ل­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان با
سلول­های
K562 ، موجب القای آپوپتوز و افزایش بیان نشانگرهای سطح سلولی  CD33و CD34 در سلول­های K562 می­گردد. این نتیجه ممکن است تاثیر مناسبی در روند بهبود بیماری CML داشته باشد. به هر حال اقدامات بیشتری باید در این زمینه صورت پذیرد تا تأثیر مثبت سلول­های بنیادی مزانشیمی را در درمان این بیماری بدخیم تایید کند.
 
تشکر و قدردانی
    این مقاله منتج از پایان­نامه مقطع دکترای عمومی دامپزشکی دانشگاه تبریز و با کد اخلاق 1218. 1396 می‌باشد. کلیه حقوق مادی و معنوی مربوط به این کار پژوهشی متعلق به دانشگاه تبریز می­باشد. نویسندگان از مرکز تحقیقات سلول­های بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تبریز به دلیل فراهم آوردن مکان و تجهیزات آزمایشگاهی تشکر و قدردانی می­نمایند.
ارسال پیام به نویسنده مسئول

ارسال نظر درباره این مقاله
نام کاربری یا پست الکترونیک شما:

CAPTCHA


XML   English Abstract   Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Najafi D, Fathi E, Farahzadi R. Investigation of rat bone marrow mesenchymal stem cells effect on apoptosis and cell surfacof CD33 and CD34 as an approach to treatment e markers expression of chronic myeloid leukemia. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2018; 15 (3) :210-225
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1181-fa.html

نجفی داود، فتحی عزت اله، فرحزادی راحله. تاثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت بر میزان آپوپتوز و بیان نشانگرهای سطح سلولی CD33 و CD34 جهت رهیافت درمانی لوسمی میلوئیدی مزمن. فصلنامه پژوهشی خون. 1397; 15 (3) :210-225

URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1181-fa.html



بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.
جلد 15، شماره 3 - ( پاییز 1397 ) برگشت به فهرست نسخه ها
فصلنامه پژوهشی خون Scientific Journal of Iran Blood Transfus Organ
The Scientific Journal of Iranian Blood Transfusion Organization - Copyright 2006 by IBTO
Persian site map - English site map - Created in 0.19 seconds with 41 queries by YEKTAWEB 4645