چکیده سابقه و هدف پلی‌سایتمی‌ورا، یکی از نئوپلاسم‌های میلوپرولیفراتیو BCR-ABL1 منفی می‌باشد که از پروژنیتورهای هماتولوژیک به وجود می‌آید. در حدود 4%-3% بیماران پلی‌سایتمی‌ورا، دارای موتاسیون‌هایی در اگزون 12 ژن JAK2 می‌باشند. با توجه به اهمیت این موتاسیون‌ها در تشخیص بیماران مبتلا به پلی‌سایتمی‌ورا، مطالعه حاضر انجام گرفت. مواد و روش‌ها در این مطالعه توصیفی ـ تحلیلی، موتاسیون‌های اگزون 12 ژنJAK2در 58 بیمار مبتلا به پلی‌سایتمی‌ورا V617F منفی در آزمایشگاه پیوند مورد ارزیابی قرار گرفتند. تمامی بیماران واجد شرایط پلی‌سایتمی‌ورا و V617F منفی وارد مطالعه شدند. علاوه بر این، فایل 60 بیمار دارای موتاسیون V617F بررسی شدند. بعد از کنترل کیفی DNA ژنومیک استخراج شده، اگزون 12به روش واکنش زنجیره پلی‌مراز تکثیر شد، غربالگری موتاسیون‌ها به وسیله تعیین توالی مستقیم انجام گرفت و سپس با آزمون کای‌دو و نرم‌افزار 13 SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. یافته‌ها در این مطالعه، 58 بیمار پلی‌سایتمی‌ورا V617F منفی مورد بررسی قرار گرفتند. 45 نفر(6/77%) مرد و 13 نفر(4/22%) زن بودند. متوسط سن بیماران 2/4 ± 8/46 سال بود. بعد از تجزیه و تحلیل‌های لازم، موتاسیون E543-D544del در یک خانم 72 ساله مشاهده شد. نتیجه گیری شیوع پایینی از موتاسیون‌های اگزون 12 ژن در جمعیت ایرانی وجود دارد که ممکن است به دلیل تعداد کم بیماران و یا شیوع پایین در جمعیت ایرانی مرتبط باشد. بنابراین مطالعه بر روی جامعه بزرگتر آموزنده خواهد بود. کلمات کلیدی: پلی‌سایتمی‌ورا، نئوپلاسم‌ها، اگزون‌ها
تاریخ دریافت: 1 /9 /95 تاریخ پذیرش: 27/10/95
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون آزمایشگاهی ـ دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران 2- مؤلف مسؤول: PhD هماتولوژی و بانک خون ـ استادیار دانشگاه آزاد اسلامی ـ واحد پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1495/19395 3- PhD هماتولوژی و بانک خون آزمایشگاهی ـ استادیار مرکز تحقیقات خون و انکولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران 4- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مجتمع آموزش عالی سلامت ورامین ـ دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران 5- فوق تخصص خون و انکولوژی ـ دانشیار دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران
مقدمه نئوپلاسم‌های میلوپرولیفراتیو(MPNs)، اختلالات کلونال هماتولوژیک مختلفی هستند که از یک تغییر در سلول بنیادی خونساز به وجود می‌آیند. ویلیام دامشکاولین کسی بود که در سال 1951 به این یافته دست پیدا کرد(1). بر طبق سیستم طبقه‌بندی WHO ، شناسایی موتاسیون JAK2 (جایگزینی فنیل آلانین به جای والین در موقعیت 617 ژن جانوس کیناز 2) و اریتروسیتوز، به عنوان 2 معیار اصلی همراه با یک معیار فرعی(از جمله تشکیل کلون‌های اریتروئیدی اندوژن، یافته‌های حاصل از بیوپسی مغز استخوان و سطح کاهش یافته اریتروپوئتین سرم) در تشخیص بیماری پلی‌سایتمی‌ورا ضروری هستند. تحریک مسیر JAK-STAT منجر به افزایش تکثیر سلولی و مستقل از سیتوکین‌ها می‌شود(3، 2). پلی‌سیتمی‌ورا (PV)، اختلالی است که در اثر یک جهش سوماتیک در ژن JAK2 یا ژن LNK در سلول‌های خونساز ایجاد می‌شود که منجر به اریتروسیتوز و هیپرپلازی در سلول‌های میلوئیدی می‌گردد(6-4). حدود 95% بیماران پلی‌سایتمی‌ورا دارای موتاسیون V617F می‌باشند(7). اگر چه اکثر بیماران مبتلا به پلی‌سایتمی‌ورا موتاسیون JAK2 V617F را در اگزون 14 دارند، با این وجود موتاسیون‌های متعددی در اگزون 12 بعضی از بیماران پلی‌سایتمی‌ورا توصیف شده است(6). مطالعه‌های مختلف نشان داد که تقریباً 3% تا 4% از بیماران پلی‌سایتمی‌ورا دارای موتاسیون‌هایی در اگزون 12 ژن JAK2 هستند(8). موتاسیون‌های اگزون 12 ، رزیدوهای 536 تا 547 را تحت تاثیر قرار می‌دهند که این رزیدوها درست در مجاورت نقطه شروع دومن شبه کینازی(JH2) واقع شده است(6). تا سال2011، 37 موتاسیون در محدوده اگزون 12 شناسایی شده است که شامل 20 حذف، 11 جایگزینی غیر مترادف و 6 دوپلیکیشن می‌باشد. موتاسیون‌های شایع عبارتند از: N542- E543del (23%)، E543-D544del (11%) ، F537-K539delinsL و K539L (10%)، R541-E543delinsK(8%). به دلیل این که مطالعه‌های محدودی در مورد بیماران مبتلا به PV در جمعیت ایرانی وجود دارد و علاوه بر این، مشخص نیست که بیماران دارای موتاسیون اگزون 12 دارای خصوصیات بالینی متفاوت در مقایسه با بیماران JAK2 V617F مثبت هستند، از این رو، مطالعه حاضر با هدف بررسی شیوع موتاسیون‌های اگزون 12 ژن JAK2 در بیماران پلی‌سایتمی‌ورا JAK2 V617F منفی انجام گرفت.
مواد و روش‌ها در یک مطالعه توصیفی - تحلیلی، غربالگری موتاسیون‌های اگزون 12 در 58 بیمار پلی‌سایتمی‌ورا V617 منفی انجام شد. علاوه بر این، فایل 60 بیمار JAK2 V617F مثبت با تشخیص قطعی پلی‌سایتمی‌ورا با روش تعیین توالی مورد بررسی قرار گرفت و برای مقایسه بیشتر علائم بالینی آن‌ها به مطالعه اضافه شد(نمودار 1). به منظور تشخیص بیماران پلی‌سایتمی‌ورا، معیارهای سازمان بهداشت جهانی(WHO) مورد استفاده قرار گرفت و همه شرکت‌کنندگان دارای معیارهای ذکر شده بودند. موافقت کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی تبریز با کد 11057/4/5 در تاریخ 10/12/92 فراهم شد و رضایت‌نامه آگاهانه از هر یک از بیماران اخذ و مطالعه در راستای قوانین و اصول توافق‌نامه هلسینکی انجام شده است. اطلاعات بیماران از پرونده‌های پزشکی آن‌ها به دست آمد و پرسشنامه بیماران توسط یک پزشک با مصاحبه از بیمار و یا والدین آن‌ها (در موارد زیر 16 سال) پر شد.
تجزیه و تحلیل آزمایشگاهی: تمام شرکت‌کنندگان به منظور غربالگری اگزون 12 ژن JAK2 به آزمایشگاه تشخیص طبی و تخصصی پیوند ارجاع داده شدند و نمونه خون بیماران توسط پرسنل آموزش دیده گرفته و در شرایط استریل در لوله‌های حاوی EDTA جمع‌آوری شد. نمونه ها در 70- درجه سانتی‌گراد به منظور بررسی در زمان دیگری فریز شدند. لایه بافی‌کوت از خون محیطی جدا شد. استخراج DNA از لایه بافی‌کوت با استفاده از یک کیت(فرمنتاز، آمریکا) با توجه به دستورالعمل کارخانه سازنده صورت گرفت. DNA استخراج شده از نظر کیفیت با تعیین نسبت280/260 OD و تکثیر ژن β-گلوبین بررسی شد. پس از بررسی کیفیت (غلظـت و خلـوص DNA)، واکنش زنجیره پلی‌مراز کیفی
نمودار 1: درصد تظاهرات بالینی بیماران مورد مطالعه
(PCR) برای ژن JAK2 با یک جفت آغازگر جلوبرنده: 5’-CAAAGTTCAATGAGTTGACCCCTA-3’ و معکوس: 5’-ACACAAGGTTGGCATATTTTCATAAG-3’ با توجه به برنامه خاص PCR انجام گرفت(9). نتایج به دست آمده از PCR در نهایت برای تعیین توالی دو طرفه به شرکت پیشگام (ماکروژن) ارسال شد.
تجزیه و تحلیل آماری: متغیرهای پیوسته به صورت SD± میانگین و میانه و متغیرهای کیفی به صورت درصد بیان شد. تفاوت بین مورد و کنترل توسط آزمون t مشخص شدند. 05/0 p< از نظر آماری معنادار در نظر گرفته شد. متغیرهای گسسته با استفاده از آزمون کای‌دو و نرم‌افزار 13 SPSSتجزیه و تحلیل شدند.
یافته‌ها در این مطالعه، 58 بیمار پلی‌سایتمی‌ورا JAK2 V617F منفی مورد بررسی قرار گرفتند. 45 نفر(6/77%) مرد و 13 نفر(4/22%) زن بودند. متوسط سن بیماران 2/4 ± 8/46 سال با حداقل سن 15 سال و حداکثر 79 سال بود. تعدادی از بیماران داروهای ضد انعقاد خون از جمله آسپرین و پلاویکس استفاده می‌کردند و درمان فلبوتومی برای بعضی از آن‌ها اعمال شده بود(جدول 1). 4 نفر از 58 نفر(9/6٪)، اریتروسیتوز همراه با لکوسیتوز و 3 نفر(2/5٪)، اریتروسیتوز همراه با ترومبوسیتوز داشتند. علاوه بر این، دو نفر(4/3٪) افزایش در تمام سه رده خونساز(اریتروسیتوز، لکوسیتوز و ترومبوسیتوز) را داشتند.
موتاسیون‌های اگزون 12 ژن JAK2 : آزمون PCR به منظور تکثیر اگزون 12 ژن JAK2 بر روی کروموزوم 9 انجام پذیرفت. تمامی بیماران در محدوده bp 453 محصول PCR داشتند. محصولات حاصل از PCR بعد از انجام کنترل کیفی به منظور تعیین توالی به مرکز ذکر شده ارسال شـد و سپس نتیجه به دست آمده از تعیین توالی با نوع وحشی(wild type) اگزون 12 به وسیله نـرم‌افـزار MEGA4 مـورد ارزیـابی قـرار گرفـت(شکل 1).
شیوع و نوع موتاسیون: از 58 بیمار پلی‌سایتمی ورا JAK2 V617F منفی که مورد بررسی قرار گرفتند، فقط یکی از بیماران از نظر موتاسیون‌های اگزون 12 مثبت بود. این بیمار یک خانم 72 ساله با هموگلوبینg/dL 5/16 و مقدار WBC، RBC و plt به ترتیب 109 × 5/14، 109 × 9/7 و 109 × 289 در لیتر بود.
جدول 1: یافته‌های هماتولوژیک بیمار مبتلا به پلی‌سایتمی‌ورا JAK2 V617F منفی و مثبت
پلی‌سایتمی‌ورا
Hb (g/dL)
MCV (fL)
(L/ 109 *) RBC
(L/ 103 *) WBC
(µL/ 103 *) Plt
V617F منفی
محدوده
22-9/15
2/97-8/69
17/9-86/4
36/17-29/4
818-84
میانگین
7/17
1/85
19/6
96/7
260
V617F مثبت
محدوده
9/20-16
7/98-8/64
28/9-26/5
3/26-73/3
900-135
میانگین
9/17
5/83
35/6
5/8
338
p value
985/0
472/0
425/0
633/0
211/0
شکل 1: نمونه‌ای از تعیین توالی ژن JAK2 محدوده کادر: بیشتر موتاسیون‌های اگزون 12 در این ناحیه اتفاق می‌افتد
شکل 2: موتاسیون‌های سوماتیک اگزون 12 ژن JAK2 در بیماران پلی‌سایتمی‌ورا . بخش A : سکانس DNA که از لایه گرانولوسیت‌های خون محیطی به دست آمده را نشان می دهد نمونه نرمال و نوع جهش یافته در موقعیت مشابه آشکار است. این پنل یک موتاسیون را در محدوده اگزون 12 نشان می‌دهد. بخش B : ترازی از آلل نرمال و آلل موتانت یافته اگزون 12 را نشان می‌دهد(نوکلئوتیدها و اسیدهای آمینه با حروف بزرگ نشان داده شده است و خط تیره‌ها موقعیت نوکلئوتیدهای حذف شده را نشان می‌دهد).
نوع موتاسیون در این بیمار E543-D544del بود که باعث حذف شش نوکلئوتید در محدوده اگزون 12 شده بود. در 57 بیمار دیگر هیچ موتاسیونی در اگزون 12 و 14 مشاهده نشد(شکل 2).
بحث در این مطالعه موتاسیون‌های اگزون 12 ژن JAK2 با استفاده از روش واکنش زنجیره پلی‌مراز مورد بررسی قرار گرفتند و نتایج حاصل از آن با استفاده از روش تعیین توالی ارزیابی شدند. نتایجی که از این مطالعه به دست آمد نشان داد که موتاسیون‌های اگزون 12 را می‌توان در 7/1% بیماران پلی‌سایتمی‌ورا مشاهده نمود. به طور کلی مکانیسم پلی‌سیتمی‌ورا تا سال 2005 در هاله‌ای از ابهام قرار داشت تا زمانی که برخی از گروه‌های مختلف موتاسیون JAK2 V617F را در اگزون 14 کروموزوم 9 گزارش کردند که مسئول اریتروسیتوز در عدم وجود اریتروپوئتین بود. از آن زمان به بعد، آزمون موتاسیون JAK2 V617F یک ابزار تشخیصی اصلی در ارزیابی بیماران مشکوک به PV شده است. در سال 2007، تعداد زیادی از محققان یک گروه از موتاسیون‌های جدید و کمیاب را در اگزون 12 ژن JAK2 در بیماران مبتلا به پلی‌سایتمی‌ورا JAK2 V617F منفی شناسایی کردند و مشخص شد که هر دو نوع این موتاسیون‌ها تقریباً مسئول تمامی موارد PV هستند(12-10، 8). از آن جایی که موتاسیون‌های اگزون 12 همانند موتاسیون JAK2 V617F از معیارهای اصلی تشخیصی WHO می‌باشد، بررسی هر کدام از این موتاسیون‌ها به ترتیب اولویت، برای تشخیص ضروری می‌باشد(13). از لحاظ علائم بالینی، جنسیت، سن و ویژگی‌های نژادی بین موارد JAK2 V617F مثبت و منفی تفاوت آماری معناداری وجود نداشت. در این مطالعه، 58 بیمار پلی‌سایتمی‌ورا JAK2 V617F منفی و 60 بیمار پلی‌سایتمی‌ورا JAK2 V617F مثبت وجود داشت. از 58 بیمار مبتلا به پلی‌سایتمی‌ورا JAK2 V617F منفی فقط یک بیمار دارای موتاسیون اگزون 12 (E543-D544del) بود. از نظر شیوع موتاسیون‌های اگزون 12 ، در تحقیقی که توسط پاردانانی و همکارانش در سال 2007 انجام شد، با به کارگیری روش آلل اختصاصی PCR (Allele-Specific PCR) از220 بیمار مبتلا به پلی‌سایتمی‌ورا، 6 بیمار JAK2 V617F منفی بودند که در 5 مورد از این 6 بیمار(3/2%)، موتاسیون‌های JAK2 exon12 مثبت گزارش شد(14). نوع این موتاسیون‌ها F537-K539delinsL یا N542-E543del بود. به طور مشابه، مطالعه‌ای در سال 2010 توسط یومینیه و همکارانش در تایوان انجام شده است(15). در این پژوهش 22 بیمار پلی‌سایتمی‌ورا حضور داشتند. 17 نفر از 22 نفر(77%) موتاسیون V617F را داشتند. 5 نفر از 22 نفر(23%) دارای موتاسیون‌های اگزون 12 بودند. سه نوع مختلف از موتاسیون‌های اگزون 12 شناسایی شد: سه نفر با موتاسیون N542-E543del و یک موردهم با موتاسیون F537-K539delinsl ویک بیمار با موتاسیون I540-E543delins KK .در این مطالعه درصد بالایی(23%) از موتاسیون‌های اگزون 12 بر خلاف کشورهای غربی گزارش شده است. اعتقاد بر این است که در مورد این موتاسیون‌ها، عدم تعادل توزیع جغرافیایی وجود دارد(15). در مطالعه دیگری که توسط ژانگ و همکارانش در سال 2013 در چین انجام گرفت، 140 بیمار که دارای انواع مختلفی از بیماری‌های هماتولوژیک بودند مورد ارزیابی قرار گرفتند(16). به طور مشابه با مطالعه حاضر بررسی بیماران با روش تعیین توالی انجام گرفت. از کل بیماران مورد مطالعه، 74 بیمار به منظور بررسی موتاسیون‌های اگزون 12 ژن JAK2 مورد آزمایش قرار گرفتند. در هیچ یک از بیماران موتاسیون اگزون 12 شناسایی نشد. نتیجه ای که از این مطالعه به دست آمد، نشان داد که علی‌رغم وجود زمینه ژنتیکی یکسان بین جمعیت آماری چین و جمعیت آماری تایوان، اختلاف زیادی در فراوانی این موتاسیون‌ها (چین: 0% و تایوان: 23%) گزارش شده است. بنابراین این تفاوت‌ها را نمی‌توان به اختلافات جغرافیایی نسبت داد(17). مطالعه‌هایی که در گذشته در مورد شیوع موتاسیون‌های اگزون 12 ژن JAK2 در بیماران مبتلا به پلی‌سایتمی‌ورا انجام گرفته، در جدول 2 خلاصه شده است. در مطـالعـه حاضـر پـس از بـررسی 58 بیمـار مبتـلا به پلی‌سایتمی‌ورا
جدول 2: درصد شیوع موتاسیون‌های اگزون 12 در بیماران پلی‌سایتمی‌ورا در مطالعه‌های مختلف
مطالعه‌های انجام شده
کل بیماران پلی‌سایتمی‌ورا
بیماران پلی‌سایتمی‌ورا V617F منفی
موتاسیون‌های اگزون ژن JAK2
Scott et al (10)
73
2
2 (3)
Pardanani et al (14)
220
6
5 (3/2)
Williams et al (17)
157
10
3 (9/1)
Bernardi et al (19)
190
47
5 (6/2)
Yeh YM et al (15)
22
5
5 (23)
Zhang et al (16)
28
5
0
Schnittger et al (9)
63
63
10 (9/15)
Theocharides et al (20)
33
3
3 (09/9)
Pietra et al (21)
147
147
17 (56/11)
Kouroupi et al (22)
26
18
8 (76/30)
Laughlin et al (23)
34
34
4 (76/11)
Present study
58
58
1 (7/1)
و ارزیابی آن‌ها از نظر موتاسیون‌های اگزون 12 ژن JAK2 ، یک مورد مثبت در بین بیماران یافت شد. اشاره به برخی از احتمالات به تفاوت بین فراوانی این موتاسیون‌ها در جمعیت ایران در مقایسه با سایر جمعیت‌ها می‌تواند کمک‌کننده باشد. علت این که 57 بیمار مبتلا به پلی‌سایتمی‌ورا در هر دو نوع موتاسیون 12 و 14 منفی بودند، به صورت مبهم باقی مانده است. توضیح خاصی درباره مورد این شرکت‌کنندگان نداریم اما می‌توانیم آن‌ها را به وجود موتاسیون در ژن‌های TET2 ، ASXL1 ، CBL ، SH2B3 (LNK نیز نامیده می‌شود) و ژن EZH2 نسبت دهیم. با توجه به عدم ارزیابی حساسیت تعیین توالی با دستورالعمل به کار گرفته شده در مطالعه حاضر، حداقل حساسیت مشخص نبوده لذا بر طبق مطالعه‌های دیگر در صورتی که آلل موتانت یافته کمتر از 15%-10% باشد، ممکن است تشخیص با این روش داده نشود که می‌تواند به عنوان یکی از دلایل در میزان موتاسیون در نظر گرفته شود(18). میزان موتاسیون‌های اگزون 12 ژن JAK2 در مناطق مختلف دنیا متفاوت گزارش شده است به طوری که در کشورهای آسیای جنوب شرقی، موتاسیون بیشتر از آمریکا و کشورهای اروپایی است. این امر می‌تواند ناشی از وجود احتمالی تفاوت‌های قومی و نژادی و هم چنین فاکتورهای اکتسابی و محیطی ناشناخته بر روی این موتاسیون‌ها باشد(جدول 2). این قضیه با توجه به عدم مطالعه در ایران و کشورهای همسایه قابل اثبات نبوده اما محتمل است. آنالیز مولکولی بیشتر برای بیمارانی که برای هر دو نوع موتاسیون JAK2V617F و اگزون 12 منفی بودند، لازم است.
نتیجه‌گیری در نتیجه شیوع کم موتاسیون‌های اگزون 12 ژن JAK2 در این مطالعه نشان داد که میزان شیوع این جهش‌ها در جمعیت ایرانی شبیه به دیگر مناطق جهان است. تعیین توالی مستقیم یک روش مهم برای غربالگری موتاسیون‌های اگزون 12 به عنوان دقت و تکرارپذیری بالا به شمار می‌آید و الزامات مورد نیاز برای آزمایش‌های بالینی در طول تشخیص بالینی فراهم می‌کند.
تشکر و قدردانی در خاتمه لازم می‌دانیم از تمام کارکنان آزمایشگاه تشخیص طبی و تخصصی پیوند، مرکز تحقیقات خون و انکولوژی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز تشکر نماییم.
Torab Z, Poopak B, Movassagh Pour A A, Younesi M, Emami A, Elahi F. Evaluation of prevalence of JAK 2 exon 12 gene mutations among Iranian patients with Polycythemia Vera . Sci J Iran Blood Transfus Organ 2017; 14 (2) :101-108 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1091-fa.html
تراب زهرا، پوپک بهزاد، موثق پور اکبری علی اکبر، یونسی محمدرضا، امامی امیرحسین، الهی فاضل. شیوع موتاسیون‌های اگزون 12 ژن JAK2 در بیماران ایرانی مبتلا به پلی‌سایتمی‌ورا. فصلنامه پژوهشی خون. 1396; 14 (2) :101-108
