استادیار مرکز تحقیقات خون و انکولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز و مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون و پایگاه منطقه‌ای آموزشی انتقال خون تبریز
کاربرد وزیکولهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی در طب ترمیمی
داود پشوتن سرور1، کریم شمس اسنجان2، پروین اکبرزاده لاله3، علی‌اکبر موثق‌پور4، حمزه تیماری1، سارا اقمشه1
چکیده سابقه و هدف سلولهای بنیادی مزانشیمی، سلولهایی پرتوان بوده که قابلیت خودنوزایی و تمایز به انواع مختلف سلولهای استرومایی را دارند. این سلولها بهواسطه اتصال مستقیم سلول- سلول و هم چنین ترشح فاکتورهای مختلف رشد و سایتوکاینها نقش بسیار مهمی در هموستاز بافتی، خونسازی و تعدیل پاسخهای ایمنی دارند. وزیکولهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی غنی از فاکتورهای رشد مختلف از قبیل پروتئینها، سایتوکاینها و میکروRNAهای متعددیبوده که تحت شرایط مختلف فیزیولوژیکی و یا پاتولوژیکی تولید و ترشح میشوند. قدرت بالای این وزیکولها در ترمیم بافتهای آسیب دیده و هم چنین تعدیل پاسخهای ایمنی باعث شده است که این وزیکولها امروزه به عنوان ابزاری مناسب و کارآمد در طب ترمیمی مورد توجه قرار گیرند. مواد و روش‌ها در مطالعه مروری حاضر، مقالات منتشر شده طی دو دهه اخیر در زمینه وزیکولهای خارج سلولی بررسی گردید. در این مطالعه، به بررسی ساختار و هویت، روشهای آزمایشگاهی جداسازی وزیکولهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی و هم چنین اهمیت و کاربردهای این وزیکولها در حوزه طب ترمیمی پرداخته شده است. یافته‌ها بررسی مقاله‌های مختلف نشان داد که سلولهای بنیادی مزانشیمی اثرات پاراکرینی خود را از طریق ترشح سایتوکاینها و وزیکولهای مختلف اعمال میکنند. وزیکولهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی اثرات محافظتی از قبیل بازسازی بافتهای آسیب دیده، القاء آنژیوژنز، تحریک عصبزایی، سرکوب پاسخهای التهابی و تعدیل پاسخهای ایمنی را دارند. نتیجه گیری با توجه به اینکه وزیکولهای مشتق از سلولهای بنیادی غنی از فاکتورهای مختلف رشد بوده و هم چنین توان بالایی در ترمیم بافتی دارند لذا، از این وزیکولها میتوان جهت ترمیم بافتهای آسیب دیده ناشی از اختلالات تخریب بافتی استفاده کرد. هم چنین این وزیکولها را میتوان بهعنوان ناقل دارو یا ژن به سلول مورد هدف به کار برد. کلمات کلیدی:طب ترمیمی، سلول درمانی، سلولهای بنیادی مزانشیمی، وزیکولهای خارج سلولی
تاریخ دریافت: 23/8/95 تاریخ پذیرش: 20/4/96
1- دانشجوی کارشناسی ارشد هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات سلولهای بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران 2- مؤلف مسئول: PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات خون و انکولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران ـ صندوق پستی: 51335 3- PhD بیوتکنولوژی دارویی ـ استادیار دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران 4- PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات خون و انکولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران
مقدمه سلولهای بنیادی مزانشیمی(Mesenchymal Stem Cells; MSCs) به عنوان سلولهای غیرهماتوپوئتیک حدود 001/0% - 01/0% از کل سلولهای هستهدار مغزاستخوان را تشکیل میدهند(2، 1). سلولهای بنیادی مزانشیمیبه طور غالب در مغز استخوان حضور دارند، هر چند که این سلولها از منابع مختلفی از قبیل بافت چربی، کبد، طحال، تیموس، خون بند ناف، جفت، ژله وارتون، مغز، ریه، پولپ دندان، غدد بزاقی، خون محیطی و سایر بافتها نیز جداسازی شدهاند(5-3). سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از بافتهای مختلف بدن از لحاظ فنوتیپ مشابه ولی از لحاظ عملکردی متفاوت میباشند(6). سلولهای بنیادی مزانشیمی بافتهای مختلف مارکرهای سطحی یکسانی ندارند که احتمالاً به دلیل تنوع گونهای، منابع مختلف بافتی و شرایط مختلف کشت باشد(7). جامعه بینالمللی سلول درمانی(The International Society for Cell Therapy; ISCT) چندین معیار به منظور تعیین هویت سلولهای بنیادی مزانشیمی جداسازی شده از بافتهای انسانی پیشنهاد میکند که شامل موارد زیر میباشند: 1) قابلیت چسبندگی به پلاستیک تحت شرایط استاندارد کشت 2) بیان مارکرهای سطحی CD105 ، CD90 و CD73 و فقدان مارکرهای CD34 ، CD14 یا CD11b ، CD79a یا CD19 ، HLA-DR و CD45 3) قابلیت تمایز به سلولهای آدیپوسیت، کندروبلاست و استئوبلاستها در شرایط آزمایشگاهی (8). سلولهای بنیادی مزانشیمی در مغز استخوان از طریق تماس مستقیم سلول - سلول هم چنین ترشح طیف وسیعی از فاکتورهای رشد نقش خود را ایفا میکنند (جدول 1)(9، 1). سلولهای بنیادی مزانشیمی با مهاجرت به بافتهای آسیب دیده باعث بازسازی بافتهای آسیب دیده میشوند چرا که این سلولها علاوه بر قابلیت تمایز به ردههای سلولی مختلف، فاکتورهای رشد مختلفی را تولید و ترشح میکنند که در ترمیم و بازسازی بافتی نقش دارند(11، 10). سلولهای بنیادی مزانشیمی به واسطه تولید فاکتورهای ضد فیبروتیک و آنژیوژنیک به ترتیب باعث مهار فیبروز بافتی و تحریک آنژیوژنز(عروقسازی) میشوند(12). به علاوه، این سلولها قابلیت ترمیم سیستم اعصاب و سرکوب سیستم ایمنی را دارند(13، 7). سلولهای بنیادی مزانشیمی که به عنوان اجزای اصلی سلولهای استرومای مغز استخوان شناخته میشوند، باعث حمایت از لانهگزینی، خودنوسازی، تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی خونساز(Hematopoietic Stem Cells; HSCs) در مغز استخوان میشوند(14، 13). به علاوه، این سلولها از آپوپتوز(مرگ فیزیولوژیک سلولی) سلولهای بنیادی خونساز جلوگیری میکنند (15). اکثر موادی که توسط سلولهای بنیادی مزانشیمی ترشح میشوند شامل فاکتورهای مختلف رشد، سایتوکاینها، کموکاینها، میکروRNAها و وزیکولهای خارج سلولی (میکرووزیکولها و اگزوزومها) میباشند که علاوه بر ترمیم بافتی، قابلیت تمایز خود سلولهای بنیادی مزانشیمی را نیز تحت تأثیر قرار میدهند(17، 16، 12). امروزه تحقیقات در زمینه وزیکولهای خارج سلولی مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی(Mesenchymal Stem Cells-Extracellular Vesicles; MSC-EVs)، یکی از حوزه‌های مورد توجه در طب ترمیمی میباشد بدین جهت که این وزیکولها اثرات پاراکرین سلولهای بنیادی مزانشیمی را اعمال میکنند و به نظر میرسد که در ارتباطات بین سلولی نقش داشته باشند. هدف از نگارش این مقاله، جمعبندی خصوصیات، محتویات و روشهای جداسازی این وزیکولهای خارج سلولی و هم چنین کاربردشان در طب ترمیمی بود.
وزیکولهای خارج سلولی: وزیکولهای خارج سلولی(Extracellular Vesicles; EVs) یک اصطلاح عمومی برای انواع مختلف اجزای غشایی است که توسط سلولهای مختلف از جمله سلولهای بنیادی، لنفوسیتهای B و T، دندرتیک سلها، مست سلها، آدیپوسیتها، نورونها، پلاکتها، سلولهای اندوتلیال و اپیتلیال به بیرون از سلول ترشح میشوند (20-18). البته اعمال وزیکولهای خارج سلولی به محتـوای درونـی ایـن وزیکولهـا، به برهمکنش اختصاصی با سلول هدف و غیره بستگی دارد.
جدول 1: فاکتورهای رشد مترشحه از سلولهای بنیادی مزانشیمی در شرایط in vivo و in vitro
فاکتور رشد
نقش
CXCL12 (SDF-1)
تنظیم فرآیند چسبندگی، تکثیر، مهاجرت و لانهگزینی سلولهای بنیادی خونساز اولیه، کاهش تولید سایتوکاینهای التهابی و کموکاینها
فاکتور سلوهای بنیادی (SCF)
حفظ تکثیر، خودنوسازی و بقاء سلولهای بنیادی خونسازاولیه، تنظیم پیوند پذیری سلولهای بنیادی خونساز، عامل تکثیر و تمایز و حتی فعال شدن مست سلها
Flt-3 ligand (FL)
حفظ تکثیر و بقاء سلولهای بنیادی خونسازاولیه و تنظیم رشد آنها
ترومبوپوئتین (TPO)
تحریک تکثیر و تمایز رده مگاکاریوسیتی، تنظیم حالت سکون و تکثیر سلولهای بنیادی خونساز اولیه
فاکتور محرک رشد مونوسیتی (M-CSF)
القاء تکثیر پیشسازهای مونوسیتی
فاکتور محرک رشد گرانولوسیتی-مونوسیتی (GM-CSF)
القاء ﺗﻜﺜﻴﺮ ﺭﺩﻩ ﮔﺮﺍﻧﻮﻟوسیتی و مونوسیتی، تنظیم پیوند پذیری سلولهای بنیادی خونساز اولیه
TNF-α
سایتوکاین التهابی، سایتوکاین مهاری قوی خونسازی
TGF-β1
مهار کننده عملکرد سایتوکاینهای تحریکی تکثیر و تمایز سلول بنیادی خونساز اولیه، تحریک و القاء آنژیوژنز
مهار کننده قوی خونسازی، مهار پاسخهای ایمنی و التهابی
اینترلوکین 7
القاء تکثیر و مهار آپوپتوز پیشسازهای رده لنفوئیدی
اینترلوکین 8
عامل کموتاکسی نوتروفیلها از خون محیطی به بافتها، نقش در آنژیوژنز
فاکتور مهاری لوسمی (LIF)
نقش اساسی در تنظیم خونسازی، استئوژنز، تکامل جنین و میلینسازی نورونها
وزیکولهای خارج سلولی
نقش در ترمیم بافتی، تعدیل پاسخهای ایمنی و سرکوب پاسخهای التهابی
به علاوه، وزیکولهای خارج سلولی از بسیاری از مایعات بدن از قبیل ادرار، سرم، مایع آمنیوتیک، بزاق، مایع مغزی- نخاعی، شیر و ترشحات بینی نیز جداسازی شدهاند(24-21). سلولهای سرطانی در مقایسه با سلولهای طبیعی، سطوح بیشتری از این وزیکولها را ترشح میکنند که نقش ضروری در تشخیص، پیشرفت و درمان اکثر سرطانها دارند(27-25، 23). وزیکولهای خارج سلولی اندازهای بین 1000-20 نانومتر داشته که بر اساس اندازه و منبع ترشح به سه دسته کلی تقسیم میشوند: 1) اکتوزوم یا میکرووزیکولها(MVs) که اندازهای حدود 1000-200 نانومتر داشته و از غشای پلاسمایی مشتق میشوند، 2) اگزوزومها(100-40 نانومتر) که از جوانه زدن اندوزومهای ثانویه درون سلولی تشکیل شده و پس از ادغام شدن در غشای سلولی به خارج از سلول ترشح میشوند، و 3) اجسام آپوپتوتیک که اندازهای حدود 500-50 نانومتر داشته و از سلولهایی آزاد میشود که دچار آپوپتوز شدهاند(31-28، 19). از بین تمامی این وزیکولهـای خارج سلولــی، اگزوزومهـا طـی دو دهه اخیر بیشتر مورد
جدول 2: خصوصیات اگزوزومها
اندازه
100-40 نانومتر
منشاء
اندوزوم
چگالیشناورسازی
g/mL 21/1-10/1 در محلول سوکروز
مارکرهای سطح سلولی
- تتراسپانینها (CD9، CD63، CD81 و CD82) - مولکولهای MHC-I و MHC-II - پروتئینهای شوک حرارتی (Hspa8، Hspa60، Hspa70 و Hspa90) - GTPase ها (EEF1A1 و EEF2) - پروتئینهای دخیل در بیوژنز اجسام مولتی وزیکولار مثل Alix و TSG101
پروتئینهای مرتبط با اسکلت سلولی
- اکتین - میوزین - Syntenin
محتوای درون سلولی
- آنزیمهای متابولیکی (GAPDH، LDHA، PGK1، PKM و آلدولاز) - پروتئینهای ناقل مثل آلبومین - لیپیدها (فسفو گلیسریدها، کلسترول، سرآمید، اسفنگومیلینو زنجیرههای اسیدهای چرب) - mRNA، microRNA، siRNA، قطعات tRNA و بهندرت DNA
توجه پژوهشگران قرار گرفته است.
اگزوزومها: اگزوزومها دارای چگالیشناورسازی g/mL 21/1-10/1 در یک شیب محلول سوکروز هستند که میتوانند به وسیله سانتریفوژ با نیروی g× 100000 رسوب داده شوند(28، 18). تمامی اگزوزومها به علت منشأ اندوزومی‌شان، دارای پروتئینهای مرتبط با غشاء مثل تتراسپانینها، مولکولهای MHC ، پروتئینهای شوک حرارتی و پروتئینهای دخیل در بیوژنز اجسام مولتی وزیکولار مثل Alix و TSG101 هستند. هم چنین برخی از آنزیمهای متابولیکی، پروتئینهای مرتبط با اسکلت سلولی و پروتئینهای ناقل مثل آلبومین نیز در اگزوزومها شناسایی شدهاند(جدول 2)(32، 28، 19). اجزای پروتئینی خاص این وزیکولها بستگی به منشا و سلول ترشح‌کننده این وزیکولها دارد که تحت شرایط مختلف فیزیولوژیکی ممکن است نوسان داشته باشند. اگزوزومهـای حاصـل از سلولهــای بنیادی مزانشیمی تفاوتی از لحاظ مورفولوژیکی، جداسازی و شرایط ذخیرهسازی با اگزوزومهای حاصل از سایر سلولها ندارند. علاوه بر مارکرهای سطحی مشترک تمامی اگزوزومها(CD9 و CD81)، اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی مولکولهای متعددی از سلولهای بنیادی مزانشیمی مثل CD29 ، CD44 ، CD90 و CD73 را نیز بیان میکنند(34، 33). علاوه بر پروتئینها، اگزوزومها با مجموعهای از سایتوکاینها، برخی لیپیدهای خاص مانند فسفو گلیسریدها، کلسترول، سرآمید، زنجیرههای اسیدهای چرب و انواع RNAها مانند mRNA ، microRNA ، siRNA ، قطعات tRNA و به ندرت DNA غنی شدهاند(37-35، 19). محتوای دقیق و جامع اگزوزومها به صورت آنلاین در پایگاه دادههای http://exocarta.org و هم چنین http://microvesicles.org در دسترس میباشند. ترشح وزیکولهای خارج سلولی به محرکهای شیمیایی، محیطی و مکانیکی بستگی دارد. اشعه گاما، یونوفورهای کلسیم، هپاراناز، داروهای استاتین، شرایط هایپوکسی(کاهش اکسیژن)، شرایط اسیدی محیط و از هم گسیختگـی مـاتریکس خـارج سلولی باعث افزایش تـرشح این وزیکولهـا در شرایـط آزمایشگاهـی می‌شونـد (38، 35، 19). به علاوه، فعالسازی TCR/CD3 در لنفوسیتها، ایجاد شرایط هایپوکسی در محیط کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی جفت و دپولاریزاسیون وابسته به پتاسیم در سلولهای عصبی نیز ترشح اگزوزومها را القاء میکنند (41-39). تودوکورو و همکارانش در سال 2013 نشان دادند که بیان miR-210 در اگزوزومهای تولید شده در شرایط هایپوکسی نسبت به شرایط نورموکسی(فشار اکسیژن نرمال) افزایش مییابد کهمیتواند شاخص خوبی برای افتراق اگزوزومهای تولید شده در دو شرایط هایپوکسی و نورموکسی باشد(42).
جداسازی وزیکولهای خارج سلولی: روش متداول و پایهای برای جداسازی و تخلیص وزیکولهای خارج سلولی از مایع رویی کشت سلولی و مایعات بیولوژیک بدن، روش سانتریفوژهای تفریقی با دور بالا(اولترا سانتریفوژ) میباشد که اغلب در ترکیب با شیب‌های مختلف محلول سوکروز با دانسیتههای مختلف انجام میشود(20). اعمال نیروهای مختلف سانتریفوژ باعث برطرف شدن سلولهای مرده و پارتیکلهای بزرگ و در نهایت رسوب وزیکولها میشود(43). به طور خلاصه در این روش پس از سانتریفوژ مایع رویی حاصل از کشت سلولی با دور g× 2000 به مدت 10 دقیقه جهت رسوب سلولها و سلولهای مرده، مایع رویی آن برداشته شده و سپس با دور g× 10000به مدت 30 دقیقه به منظور رفع بقایای سلولی سانتریفوژ میشوند. تا این مرحله برای جداسازی هر دو میکرووزیکولها و اگزوزومها یکسان بوده ولی از این مرحله به بعد متفاوت میباشد. به منظور جداسازی میکرووزیکولها، سوپرناتانت حاصل از مرحله قبل با بافر فسفات- سالین(PBS) سوسپانسه شده و دوباره با دور g× 10000به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ میگردد تا میکرووزیکولها رسوب پیدا کنند. اما برای جداسازی اگزوزومهـا، مایـع‌رویـی حاصـل از مرحلـه دوم کـه حاوی فاکتورهـای رشـد و اگـزوزومها میباشد را با دور g× 100000به مدت 1 ساعت سانتریفوژ کرده تا اگزوزومها در ته لوله رسوب کنند. به منظور حذف پروتئینها، رسوب با PBS سوسپانسه گردیده و دوباره با دور g× 100000به مدت 1ساعت سانتریفوژ میگردد. رسوب سلولی حاصله اگزوزوم میباشد که در PBS سوسپانسه و حل میشود(44، 43). سایر روشهای جداسازی وزیکولهای خارج سلولی شامل اولترافیلتراسیون، کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (High Performance Liquid Chromatography; HPLC)، رسوب اگزوزومها توسط پلیمر پلی‌اتیلن گلیکول و روش تخلیص تمایلی توسط آنتیبادیهای اختصاصی بر علیه آنتیژنهای CD9 ، CD63 ، CD81 و CD82 میباشد (45، 43). علاوه بر این روشهای سنتی، امروزه کیتهای جداسازی و محلول‌های رسوب‌دهی این وزیکولها هم وجود دارند که توسط شرکت‌های مختلف در سال‌های اخیر گسترش یافته‌اند. این محصولات روشهای مؤثر و قابل اعتمادی را برای جداسازی و تخلیص وزیکولهای خارج سلولی فراهم کرده‌اند و شرایط اسیدی محیط جداسازی، تخلیص و پایداری اگزوزومها را بالا میبرد (46).
تعیین هویت وزیکولهای خارج سلولی: وزیکولهای خارج سلولی پس از جداسازی و تخلیص باید حداقل توسط دو تا از روشهای زیر تعیین هویت شوند. از روشهای تعیین هویت وزیکولها میتوان میکروسکوپ نیروی اتمی، میکروسکوپ اسکن الکترونی، روش پراکندگی نور دینامیکی، فلوسایتومتری مارکرهای سطحی، ایمونوبلاتینگ(وسترن بلات)، نانوپارتیکل آنالایزر، میکروسکوپ الکترونی و الایزا را نام برد(49-47).البته روش ایمونوبلاتینگ با آنتیبادیهای ضد پروتئینهای اختصاصی وزیکولهای خارج سلولی قبل از بررسی با میکروسکوپ الکترونی توصیه میشود. در نهایت وزیکولهای خارج سلولی باید قبل از منجمد کردن تعیین غلظت شوند. غلظتپروتئینی وزیکولهای خارج سلولی به روش برادفورد و یا با استفاده از کیتهای تجاری تعیین میشود(43). ذخیرهسازی وزیکولهای خارج سلولی: در نهایت پس از جداسازی و تعیین هویت و غلظت، وزیکولهای خارج سلولی به منظور کاربردهای آزمایشگاهی، تحقیقاتی و حتی بالینی باید فریز گردند چرا که این وزیکولها در دمای اتاق و 37 درجه سانتیگراد ناپایدار هستند. اگزوزومها میتوانند به مدت 6 ماه در دمای 20- درجه سانتیگراد بدون هیچ گونه مواد نگه‌دارندهای ذخیره و فریز گردند(50). سوکولوا و همکارانش در سال 2011 پایداری اگزوزومها را در سه دمای 20- ، 4 و 37 درجه سانتیگراد مورد ارزیابی قرار دادند. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که در صورت نگهداری اگزوزومها در دمای 4 و 37 درجه سانتیگراد علاوه بر کاهش در اندازه، تغییرات ساختاری نیز رخ می‌دهد. هم چنین نشان دادند که فریز و دفریز مجدد اگزوزومها(تا دمای 20- درجه سانتیگراد) و حتی انجام اولتراسانتریفوژ تغییری در اندازه اگزوزومها ایجاد نمیکند. از اینرو، دمای 20- درجه سانتیگراد و دماهای پایینتر برای نگهداری و فریز اگزوزومها برای مدت طولانی سالم مناسب میباشد که هیچ گونه تغییرات ساختاری و اندازهای در آن رخ نمیدهد(49).
کاربردهای درمانی وزیکولهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی: سلولهای بنیادی مزانشیمی قابلیت ترمیم بافتهای آسیب دیده و هم چنین تعدیل پاسخهای ایمنی را دارند. این اثرات سلولهای بنیادی مزانشیمی به طور گستردهای توسط قابلیت تمایز ذاتی این سلولها، سیگنالهای مستقیم سلول- سلول و هم چنین ترشح فاکتورهای رشد مختلف از قبیل سایتوکاینها، کموکاینها و وزیکولهای خارج سلولی واسطهگری میشوند(52، 51). اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی نوعی از وزیکولهای خارج سلولی بوده که طی دو دهه اخیر بیشتر مورد توجه و تحقیق پژوهشگران بوده است. اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی به علت غنی بودن از فاکتورهای رشد مختلف گمان میرود که در بسیاری از فـرآیندهـای فیـزیولوژیـکی و پـاتولوژیکی سلولی دخالت داشته باشند(53، 19). بنابراین جداسازی و تعیین هویت اگزوزومها از محیطهای کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی و هم چنین بررسی اثرات این سلولها در شرایط آزمایشگاهی و حتی بالینی میتواند این وزیکولها را در آیندهای نه چندان دور وارد حوزه بالینی و طب ترمیمی جهت درمان بیماریهای عصبی، قلبی، عضلانی، کلیوی، روماتولوژی و هماتولوژیکی کند. تزریق داخل وریدی اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی بند ناف انسانی در مدلهای موشی قابل تحمل است زیرا این اگزوزومها باعث کاهش وزن این موشها میشوند و اثرات منفی بر عملکرد بافتهای کلیوی یا کبدی ندارند(54). اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی نقش بسیار مهمی در تنظیم و حفظ هموستاز بافتی از طریق ریکاوری، ترمیم و بازسازی بافتی دارند(55). این اگزوزومها هم چنین از طریق القاء تکثیر سلولی، تحریک آنژیوژنز، مهار آپوپتوز و هم چنین استرس اکسیداتیو اثرات محافظتی در بافت قلبی دارند(2). وزیکولهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی از طریق القاء آنژیوژنز باعث محافظت بافت قلبی از آسیبهای ایسکمیک میشوند(56). به علاوه، اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی باعث کاهش آسیبهای ناشی از ایسکمی/رپرفیوژن قلبی در مدلهای موشی میشوند (58، 57). اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی با فعال کردن مسیر PI3K/Akt ، افزایش سطوح ATP و کاهش میزان استرس اکسیداتیو باعث افزایش عملکرد و دوام بافت قلبی طی آسیبهای ناشی از ایسکمی/رپرفیوژن قلبی میشود. از این رو، اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی میتوانند به عنوان یک ادجوان بالقوه برای رپرفیوژن استفاده شوند(59). اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی در موشها باعث حفاظت کلیهها در برابر آسیبهای ناشی از ایسکمی رپرفیوژن از طریق کاهش پاسخهای التهابی و آپوپتوز میشوند(33). به علاوه، اگزوزومهای مشتق از سلولهای بند ناف انسانی از طریق کاهش آپوپتوز و هم چنین کاهش آسیب اکسیداتیو ایجاد شده توسط سیس پلاتین، تکثیر سلولهای اپیتلیال کلیوی را در شرایط آزمایشگاهی افزایش میدهند(60). در مدلهای موشی ثابت شده که اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان، روده را در مقابل التهابات رودهای نکروزان (Necrotizing Enterocolitis: NEC) محافظت میکنند (61). میکروRNA ها گروهی از RNA های کوتاه غیر کد شونده به طول 24-18 نوکلئوتید بوده که بسیاری از فرآیندهای سلولی از قبیل رشد، تکثیر، تمایز، تکوین و مرگ سلولی را تنظیم و کنترل میکنند(62). به علت این که وزیکولهای خارج سلولی با طیف وسیعی از میکروRNA(miR) غنی شدهاند، احتمالاً این وزیکولها نقش بسیار حیاتی در فرآیندهای سلولی از قبیل هموستاز بافتی و خونسازی(Hematopoiesis) داشته باشند. miR-191 ، miR-222 ، miR-21 و let-7a موجود در اگزوزومها در تنظیم چرخه سلولی و پرولیفراسیون، miR-222 ، miR-21 و let-7f هم چنیـن در القـاء آنـژیوژنز نقـش دارنـد و miR-6087 باعث القاء تمایز سلولهای اندوتلیال میشود(63). هم چنین miR-9 ، miR-125b ، miR-124 ، miR-128 ، miR-133b و miR-let7b موجود در اگزوزومها در القاء فرآیندهای آنژیوژنز و عصبزایی نقش دارند(64). اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی باعث ترمیم عضلات از طریق میوژنز و آنژیوژنز میشود که این اثر بیشتر به miR-494 وابسته است تا سایتوکاینهای موجود در اگزوزومها(65). وزیکولهای خارج سلولی از طریق القاء بیان ژن در سلولهای هدف ممکن است بر روی بازسازی استرومای مغز استخوان، عملکرد سلولهای هدف، آنژیوژنز، پیشرفت و متاستاز بدخیمیهای خونی تاثیر گذارند(66). مطالعهای در سال 2012 نشان داد که اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی با افزایش بیان فاکتور رشد سلولهای اندوتلیال عروق(Vascular Endothelial Growth Factor: VEGF) و متعاقب آن فعال شدن مسیر خارج سلولی سیگنال تنظیم کیناز 1 و 2 (Extracellular Signal-Regulated Kinase1/2: ERK1/2) در سلولهای توموری، باعث تحریک رشد سلولهای توموری میشود(67). این در حالی است که لی و همکارانش در سال 2013 نشان دادند که miR-16 موجود در اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی با کاهش بیان VEGF در سلولهای توموری باعث مهار آنژیوژنز و رشد تومور میگردد(68). حضور برخی از میکروRNAها در محتوای اگزوزومها میتواند به تشخیص برخی بیماریها کمک کند. از میکروRNAهای غالب در اگزوزومهای مشتق از سلولهای سرطانی سینه میتوان miR-451 و miR-1246 را نام برد. همچنین miR-494 و miR-542-3P در اگزوزومهای مشتق از سلولهای آدنوکارسینومای موشی، miR-21 و miR-29a در اگزوزومهای مشتق از سلولهای سرطانی ریوی، miR-92a در اگزوزومهای مشتق از سلولهای لوسمیک و غیره حضور دارند(19). زین و همکاران نشان دادند که تزریق داخل وریدی اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی پس از سکته مغزی باعث القاء نورونسازی، ترمیم نورونی و آنژیوژنز میشود(69). اگزوزومهای مشتق از سلولهای نورونی بر خلاف اکثر داروها از سد خونی- مغزی عبور کرده و اثرات ترمیمی سیستم اعصاب را از طریق محافظت از انواع نورونها، حمایت از پیشسازهای الیگو دندریتیک و مهار پاسخهای التهابی سیستم عصبی اعمال میکنند (70). به علاوه، اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی از طریق انتقال میکروRNAها به جسم سلولی نورونی باعث القاء رشد آکسونها میشوند که این میتواند یک رویکرد جدید در درمان بیماریهای تحلیلی پیشرونده عصبی باشد(71). اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی بند ناف انسانی با افزایش درصد سلولهای T تنظیمی(FoxP3+ ، CD25+ ، CD4+) و کاهش تکثیر سلولهای TCD4+ و TCD8+ ، خاصیت تعدیل پاسخهای ایمنی را دارند(72). اگزوزومهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی میزان ماندگاری پیوند آلوژنیک پوست را در موشها تقویت میکنند و بروز واکنش پیوند بر علیه میزبان(Graft Versus Host Disease; GVHD)را به مدت دو روز به تأخیر می‌اندازند که این به دلیل شیفت سلول‌هـای TCD4+ فعـال بـه سمـت سلولهای T تنظیمی میباشد(73). نتیجه‌گیری وزیکولهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی در بسیاری از شرایط آزمایشگاهی و مدلهای حیوانی مختلف مورد آزمایش قرار گرفتهاند. این وزیکولهای خارج سلولی، ناقلین(Vectors) ایدهآلی برای تحویل دارو یا ژن به بافت مورد هدف هستند چرا که غنی از فاکتورهای رشد متعدد میباشند. طی دو دهه اخیر، بسیاری از مطالعه‌های انجام شده در زمینه وزیکولهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی نشان دادهاند که این وزیکولها باعث ترمیم و بازسازی بافتهای آسیب دیده، سرکوب پاسخهای التهابی و تنظیم پاسخهای سیستم ایمنی میشوند اما درباره اثرات‌شان بر روی رشد و پیشرفت تومور، ضد و نقیض‌هایی وجود دارد که نیازمند مطالعه‌های بیشتر میباشد. محتوا و میزان ترشح این وزیکولها به نوع منبع سلول بنیادی مزانشیمی ترشح کننده و شرایط محیطی بستگی دارد. لذا، بهینهسازی روشهای جداسازی و جمع‌آوری این وزیکولها از محیط کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی مختلف میتواند در آیندهای نزدیک باعث رویکرد جدید سلول درمانی بر مبنای وزیکولهای مشتق
از سلولهای بنیادی مزانشیمی در طب ترمیمی شود. سلولهای بنیادی مزانشیمی به واسطه مهار بلوغ سلولهای ایمنی و هم چنین افزایش سلولهای T تنظیمی، توانایی بسیار در سرکوب پاسخهای ایمنی دارند. هم چنین سلولهای بنیادی مزانشیمی خطر واکنش پیوند بر علیه میزبان را حین پیوند سلولهای بنیادی خونساز افزایش میدهند که وزیکولهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی این قابلیتها را ندارند. از اینرو، وزیکول درمانی میتواند جایگزین خوبی برای سلول درمانی مزانشیمی در طب ترمیمی باشد. شناخت مکانیسمهای دقیق اثرات ترمیم بافتی وزیکولهای مشتق از سلولهای بنیادی مزانشیمی، نیازمند پژوهشهای بیشتر میباشد.
تشکر و قدردانی بدین‌وسیله از همکاری خانم سحر دهبیدی و آزاده مصلایی در جمع‌آوری اطلاعات و خانم زهرا کسرائیان، آقایان قاسم حسام پور رضوی، مهدی میرزا خانی، داود زارعی و علیرضا صلاح در مشخص نمودن کیتهای غربالگری و تاییدی تشکر و قدردانی میشود.
