جلد 14، شماره 1 - ( بهار 1396 )
جلد 14 شماره 1 صفحات 42-34 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Mashati P, Esmaeili S, Dehghan Nayeri N, Darvishi M, Gharehbaghian A. The effect of methanolic extract of aerial parts of Artemisiaannua on proliferation and apoptosis of acute lymphoblasticleukemia cell lines, Nalm-6 and Reh. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2017; 14 (1) :34-42
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1085-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1085-fa.html
مشاتی پرگل، اسماعیلی سمیه، دهقان نیری نسرین، درویشی مینا، قره‌باغیان احمد. تاثیر عصاره متانولی بخش‌های هوایی گیاه درمنه خزری(Artemisia annua) بر تکثیر و مرگ سلول‌های سرطانی لوسمی لنفوبلاستیک حاد رده‌های Nalm-6 و Reh. فصلنامه پژوهشی خون. 1396; 14 (1) :34-42
دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی
متن کامل [PDF 581 kb]
(2495 دریافت)
| چکیده (HTML) (5842 مشاهده)
مقدمه
لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL)، با تکثیر و تجمع کلونال سلول‌های بلاست در مغز استخوان و خون محیطی همراه است. این لوسمی در کودکان 2 الی 5 سال شایع‌تر است. شیوع این لوسمی در بالغین(بالای 15 سال)، یک سوم شیوع آن در کودکان می‌باشد. دومین شیوع بالای آن در بالغین بالای 50 سال است که با افزایش سن، احتمال بروز آن افزایش می‌یابد(1). مشتقات صناعی و نیمه صناعی حاصله از گیاهان، از منابع مهم داروهای ضد سرطان هستند(2). تقریباً 60% داروهایی که در بالین به عنوان ضد سرطان مصرف می‌شوند، از منابع طبیعی به دست آمده یا با آن مرتبط هستند. گیاهان مدت زمان زیادی است که در درمان سرطان استفاده می‌شوند(3). جونیپروس اکسلسا (Juniperus excelsa)، یک درخت یا درختچه‌ای همیشه سبز از خانواده Cupressaceae می‌باشد که در کشورهای منطقه بالکان، ترکیه، سوریه، لبنان، گرجستان، ارمنستان، آذربایجان و قسمت شرقی ایران نزدیک ترکمنستان و هم چنین در نواحی شمال شرق سواحل دریای سیاه و دامنه قفقاز وجود دارند(4). نام‌های محلی این گیاه اُرس، اردوج و آروس می‌باشد(5). جونیپروس اکسلسا یک گیاه دارویی محسوب می‌شود که در گذشته برای درمان دیس منوره یا قاعدگی دردناک، سرفه، برونشیت و سرماخوردگی، یرقان، سل و تحریک قاعدگی مورد استفاده قرار می‌دادند(8-6، 4). این گیاهان به طور سنتی در عربستان در درمان زردی و سل و در ترکیه برای درمان سرفه، برونشیت و هموروئید مورد استفاده قرار گرفته‌اند(9). هم چنین توسط افراد بومی ایران به عنوان گیاهی با کاربردهای متنوع شناخته شده است و به طور سنتی در درمان بیماری‌های قلبی، عصبی، گوارشی و مجاری ادراری و... کاربرد دارد(10). فعالیت ضد میکروبی ماده مؤثره میوه و برگ‌های این گیاه علیه چندین میکروب شامل باسیلوس سابتیلیس، کاندیدیا آلبیکنز، استافیلوکوک اورئوس و اشریشیاکلی مورد بررسی قرار گرفته است(4). هم چنین در مطالعه‌ای نشان داده شده که اجزای این گیاه فعالیت آنتی‌لیشمانیایی نیز دارد(11). در فرآیند آپوپتوز کاسپازها نیز نقش مهمی ایفا می‌کنند. کاسپازها، سیستئین پروتئازهایی هستند که به شکل پروآنزیم وجود دارند و در اثر شکسته شدن فعال می‌شوند(13، 12). دو مسیر جایگزین برای شروع فرآیند آپوپتوز وجود دارد: مسیر خارجی که وابسته به گیرنده‌های مرگ موجود بر سطح سلول است و مسیر داخلی که وابسته به میتوکندری می‌باشد. در هر دو مسیر کاسپازها فعال می‌شوند(14). مسیر خارجی و داخلی به یک مسیر مشترک ختم می‌شوند که با شکستن کاسپاز 3 آغاز شده و نهایتاً منجر به شکستن DNA ، دژنره شدن پروتئین‌های اسکلت سلولی و پروتئین‌های هسته‌ای، شکل‌گیری اجسام آپوپتوتیک، بیان لیگاند برای گیرنده‌های سلول‌های فاگوسیت‌کننده و در آخر جذب توسط سلول‌های فاگوسیت‌کننده منتهی خواهد شد(15). در این مرحله از آپوپتوز، فسفاتیدیل سرین(PS) به سطح خارجی غشای سلول می‌آید. فسفاتیدیل سرین‌ها به طور طبیعی در لایه داخلی یا سیتوپلاسمیک غشای سلول‌های زنده قرار گرفته‌اند(16). انکسین V دارای جایگاه اتصال به فسفاتیدیل سرین است. اخیرا مشخص شده هر نوع سلول دارای مکانیسمی است که باعث ظاهر شدن فسفاتیدیل سرین در سطح سلول می‌شود، که این مکانیسم طی آپوپتوز فعال می‌شود. جهت درک مکانیسم مرگ سلولی از آزمون فلوسیتومتری Annexin V-FITC استفاده می‌شود(17). هم چنین در این مطالعه، بررسی فعالیت کاسپاز 3 به دلیل اهمیت آن در هر دو مسیر آپوپتوز صورت گرفت. تا به حال در مورد اثرات سایتوتوکسیک و آپوپتوتیک عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا بر رده‌های سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد گزارشی منتشر نشده است، لذا در این مطالعه بر آن شدیم تا اثر این عصاره را بر سلول‌های سرطانی لنفوبلاستیک حاد شامل Nalm-6 و Reh مورد بررسی قرار دهیم.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه بنیادی، این گیاه از استان کهگیلویه و بویراحمد در جنوب غربی ایران جمع‌آوری شده است. اندام مورد استفاده در عصاره‌گیری، اندام هوایی شامل سرشاخه‌های مخروط‌دار بوده که در مرحله زایشی جمع‌آوری گردید. 10 گرم از پودر گیاه خشک شده توسط 100 میلی‌لیتر متانل(به نسبت 1 به 10) با استفاده از روش خیساندن(maceration) به مدت 24 ساعت عصاره‌گیری شد. عصاره‌های به دست آمده با استفاده از کاغذ صافی از پودر گیاه جدا شده و سپس با دستگاه روتاری در دمای کمتر از 40 درجه سانتی‌گراد تغلیظ و در ویال ریخته شد. عصاره تغلیظ شده در زیر هود خشک و تا قبل از بررسی در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. تمامی مراحل مربوط به عصاره‌گیری در مرکز تحقیقات طب سنتی و گیاهان دارویی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی و زیر نظر متخصص فارماکوگنوزی انجام گرفت. برای آماده‌سازی عصاره و رساندن آن به غلظت مورد نظر، ابتدا میزان 100 میلی‌گرم عصاره در میکروتیوب با ترازوی دیجیتال وزن شده و سپس در 1 میلی‌لیتر DMSO استریل حل شدند(غلظت نهایی استوک اولیه عصاره mg/mL 100 بود).
با توجه به رقیق نمودن استوک اولیه عصاره، جهت تهیه غلظت‌های مورد نیاز برای مطالعه، غلظت نهایی DMSO به کمتـر از 01/0 رسیده و نیازی به کنترلDMSO نبوده است.
کشت سلولی و تیمار سلول‌ها با عصاره:
رده‌های سلولی Nalm-6 و Reh از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران (تهران، ایران) تهیه شد. در یک مطالعه تجربی، به منظور کشت سلولی ابتدا سلول‌ها از تانک ازت خارج و یخ‌زدایی شدند، سپس در محیط کشت RPMI 1640 (جیبکو) حاوی 10% FBS و 1% پنی‌سیلین کشت داده شدند.
فلاسک‌های کشت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با 5% CO2 انکوبه شدند. بعد از این که سلول‌ها به قدر کافی رشد کردند، 105× 3 تا از هر سلول در پلیت‌های 96 خانه با غلظت‌های مختلف عصاره تیمار و در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با 5% CO2 به مدت 48 و 72 ساعت انکوبه شدند. غلظت‌های مختلف عصاره با استفاده از محیط کشت استریل تهیه شدند. همه آزمایش‌ها به صورت شش‌تایی و در حداقل سه آزمایش جداگانه مورد بررسی قرار گرفتند.
آزمون MTT به منظور سنجش فعالیت متابولیک:
پس از تیمار و اتمام زمان انکوباسیون، به هر چاهک 20 میکرولیتر محلول MTT (4,5 dimethyl diphenyl tetrazolium bromid ) اضافه نموده و مجدداً به مدت 2 تا 4 ساعت در انکوباتور دی‌اکسید کربن در 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. سپس پلیت‌ها با دور g2900 به مدت 9 دقیقه سانتریفوژ شده و محیط کشت رویی دور ریخته شد. در طی زمان انکوباسیون، MTT توسط سیستم سوکسینات دهیدروژناز که یکی از آنزیم‌های چرخه تنفسی میتوکندری‌ها است، احیا می‌شود. احیا و شکسته شدن این حلقه موجب تولید کریستال‌های آبی رنگ فورمازان می‌شود. میزان رنگ تولید شده با تعداد سلول‌هایی که از نظر متابولیک فعال هستند(سلول‌های زنده) رابطه مستقیم دارد. کریستال‌های فورمازان در آب غیرمحلول بوده و بایستی قبل از رنگ‌سنجی توسط ماده حلالی نظیر دی متیل سولفوکساید(DMSO) به حالت محلول درآیند. بنابراین بعد از تخلیه محیط کشت، 100 میکرولیتر DMSO به هر چاهک اضافه شد. در نهایت جذب نوری چاهک‌ها توسط دستگاه الایزا ریدر در طول موج 570 نانومتر قرائت شده و درصد سلول‌های زنده با فرمول زیر محاسبه شدند.
آزمون فلوسیتومتری به منظور سنجش میزان آپوپتوز:
ابتدا سلول‌ها در محیط RPMI حاوی 10% FBS در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد حاوی 5% گاز CO2 به منظور دسترسی به جمعیت مورد نظر کشت شدند. طبق دستور کیت(Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC ، بیوساینس)، برای هر آزمون به 105 × 3 سلول نیاز است. سلول‌ها در پلیت 96 خانه با غلظت‌های مختلف عصاره تیمار شده و به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. بعد از انکوباسیون، سلول‌ها به فالکون منتقل شده و سانتریفوژ شدند و مایع‌رویی آن دور ریخته شد. 500 میکرولیتر از بافر باندکننده به سلول‌های تیمار شده اضافه شد، سپس به ویال مربوط به انجام فلوسیتومتری منتقل شدند. در نهایت 5 میکرولیتر انکسین V و 16 میکرولیتر PI (Premium Iodide) به ویال اضافه و به مدت 20 دقیقه در تاریکی و در دمای اتاق انکوبه شدند در نهایت ویال‌ها توسط دستگاه فلوسیتومتری خوانده شد.
آزمون بررسی فعالیت کاسپاز 3 به منظور سنجش میزان آپوپتوز:
برای این آزمایش از کیت سنجش کلرومتریک فعالیت کاسپاز 3 (آبکام، آمریکا، ab39301) استفاده شد. تعداد سلول مورد نیاز برای هر غلظت طبق دستورالعمل کیت، 105 × 5-1 می‌باشد. ابتدا سلول‌های کشت داده شده با دوزهای مختلف عصاره جونیپروس اکسلسا در پلیت‌های 12 خانه، طبق روشی که قبلاً توضیح داده شد، تیمار شده و پلیت به مدت 48 ساعت در انکوباتور CO2 دار انکوبه شد. بعد از انکوباسیون، طبق دستورالعمل کیت پروتئین‌های سلول‌ها استخراج شده و به روش BCA protein assay ، میزان پروتئین آن‌ها سنجیده شد. غلظت مناسب پروتئین برای هر آزمون در سنجش فعالیت کاسپاز 3 ، 50 الی 200 میکروگرم به ازای هر 50 میکرولیتر بافر لیز کننده می‌باشد. در ادامه آزمون، فعالیت کاسپاز 3 همراه با تکرار به صورت دوتایی صورت گرفت. یک چاهک به عنوان background حاوی 50 میکرولیتر Reaction Buffer و در سایر چاهک‌ها، به میزان 50 میکرولیتر از نمونه‌ها اضافه شدند. سپس 50 میکرولیتر از مخلوط 2X Reaction Buffer و DTT و سپس به میزان 5 میکرولیتر از سوبسترا (4 میلی‌مول DEVD-p-NA) به هر چاهک اضافه کرده و پلیت به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. در نهایت جذب نوری چاهک‌ها در طول موج nm 450-400 خوانده شد.
آزمون‌های آماری:
آنالیز آماری داده‌ها با کمک نرم‌افزار 23 SPSS صورت گرفت. از آزمون one-way ANOVA برای ارزیابی اختلاف آماری بین گروه‌های تیمار شده و کنترل استفاده شد و 05/0 p< از لحاظ آماری معنادار تلقی گردید و 001/0 p<، 01/0 p< و 05/0 p< نشانگر کاهش معنادار نسبت به کنترل بودند.
یافته‌ها
نتایج آزمون MTT :
برای انجام آزمون MTT ، سلول‌های Nalm-6 و Reh با غلظت‌های 1، 2، 3، 4 و 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره جونیپروس اکسلسا با روشی که قبلا بیان شد، تیمار شدند. بعد از 48 و 72 ساعت انکوباسیون پلیت‌ها، جذب خانه‌های حاوی سلول‌های تیمار شده با جذب خانه‌های حاوی سلول‌های کنترل مقایسه شده و درصد سلول‌های زنده محاسبه گردید.
نمودار 1: اثر کشندگی عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا بر رده سلولی Nalm-6 با روش MTT
نمودار 2: اثر کشندگی عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا بر رده سلولی Reh با روش MTT
شکل 1: بررسی میزان آپوپتوز سلول‌های تیمار شده با عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا در رده‌های سلولی Nalm-6 و Reh به روش فلوسیتومتری. در این گراف‌ها ربع سمت چپ پایین- سلول‌های انکسین منفی/PI منفی(سلول‌های زنده)، ربع سمت چپ بالا- سلول‌های انکسین مثبت/PI منفی(آپوپتوز اولیه)، ربع سمت راست پایین- سلول‌های انکسین منفی/PI مثبت(سلول‌های نکروتیک) و ربع سمت راست بالا-سلول‌های انکسین مثبت/PI مثبت(آپوپتوز تاخیری) می‌باشند.
نمودار 3: نمودار نتایج حاصل از آزمون فلوسیتومتری در سلول Nalm-6 و Reh (01/0 p<)***
نمودار 4: نمودار فعالیت کاسپاز 3 در سلول‌های Nalm-6 و Reh . نمودار فوق میزان فعالیت کاسپاز 3 در سلول‌های Nalm-6 و Reh پس از تیمار 48 ساعته با عصاره گیاه جونیپروس اکسلسا را نشان می‌دهد. بعد از استخراج پروتئین و انجام مراحل مرتبط با کیت فعالیت کاسپاز 3، OD پلیت بعد از 24 ساعت سنجیده شد(01/0 p< ** و 05/0 p< *).
افزایش چشمگیر و معنادار آپوپتوز نسبت به گروه کنترل می‌شود(001/0 p<). در این آزمایش هم چنین افتراق سلول‌های آپوپتوز شده از سلول‌های نکروتیک صورت گرفت(شکل 1). همان طور که در شکل 1 نشان داده شده است، درصد سلول‌های نکروز شده در سلول‌های تیمار شده با عصـاره نسبـت بـه گروه‌های کنترل ، در هر دو رده
سلولی اختلاف معناداری نداشته است.
نتایج آزمون فعالیت کاسپاز 3:
برای این آزمون، سلول‌های Nalm-6 و Reh با غلظت‌های 2 و 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره جونیپروس اکسلسا با روشی که قبلاً بیان شد، تیمار شدند. نتایج حاصل از سنجش فعالیت کاسپاز 3 نشان داد که در هر دو رده سلول Nalm-6 و Reh ، تیمار با عصاره جونیپروس اکسلسا، باعث افزایش فعالیت کاسپاز 3 نسبت به گروه‌های کنترل می‌شود. در سلول‌های Nalm-6 میانگین جذب نوری در غلظت‌های 2 و 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره به میزان زیادی با گروه کنترل متفاوت است(05/0 p<). در سلول‌های Reh نیز غلظت‌های 2 و 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره دارای اختلاف قابل توجه نسبت به گروه کنترل می‌باشد(01/0 p<)(نمودار 4). داده‌ها در نمودار 4 به صورت mean ± SD ، حاصل از حداقل سه آزمون جداگانه گزارش شدند.
بحث
نتایج حاصل از این مطالعه بیانگر اثر مهاری عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا بر رده‌های سلولی Nalm-6 و Reh می‌باشد. همان طور که در نتایج مربوط به آزمون MTT نشان داده شده است، در هر دو رده سلولی، عصاره گیاه جونیپروس اکسلسا از غلظت 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر به بالا دارای اثر کشندگی قابل توجه‌ای نسبت به گروه‌های کنترل بوده و بیشترین اثر مهاری در تیمار 72 ساعت مشاهده شد. به طوری که کاهش در میزان سلول‌های زنده، به ویژه در غلظت‌های بالاتر مشهود است. در بررسی‌هایی که قبلاً صورت گرفت، اثر مهاری عصاره دانه و شاخه‌های گیاه جونیپروس اکسلسا بر روی رده‌های سلولی دیگر از جمله HeLa ، KB و MDA-MB-468 در غلظت‌های بیشتر از 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره‌ها نشان داده شده است(18). این در حالی است که در مطالعه حاضر غلظت‌های کمتر از 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر بررسی و اثرات مهارکنندگی مشاهده شده است. هم چنین در مطالعه دیگری نیز اثر ضد توموری عصاره دانه‌های گیاه جونیپروس اکسلسا بررسی شد که مهار 86 درصدی تومور در مقایسه با داروی کنترل وین کریستین را گزارش نمودند(11). در مطالعه دیگری اثر مهاری ماده مؤثره گیاه جونیپروس اکسلسا بر رده‌های سلولی CCRF-CEM و CEM-ADR5000 مورد بررسی قرار گرفته و IC50 معادل 44-41 میکروگرم بر میلی‌لیتر گزارش شده است(19). در مطالعه اسماعیلی و همکاران، اثر کشندگی عصاره گیاه جونیپروس اکسلسا بر دیگر سلول‌های سرطانی از جمله HepG-2 ، MCF-7 و A-549 بررسی و IC50 معادل µg/mL 30 > گزارش شده است(20).
در مطالعه حاضر نتایج حاصل از آزمون فلوسیتومتری نیز نشان داد که غلظت µg/mL 3 عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا تاثیر بسیار قابل توجه‌ای(7 الی 5/7 برابر نسبت به گروه‌های کنترل) بر روی آپوپتوز هر دو رده سلولی گذاشته است، که این میزان آپوپتوز با کاهش معنادار درصد سلول‌های زنده در آزمون MTT مطابقت دارد. هم چنین در این مطالعه میزان فعالیت کاسپاز 3 نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. افزایش فعالیت کاسپاز 3 در سلول‌های تیمار شده با عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا، نسبت به گروه‌های کنترل نیز حاکی از افزایش القای فرآیند آپوپتوز در هر دو رده سلولی مورد مطالعه می‌باشد. همان طور که در نمودار 4 نشان داده شده است، کاسپاز 3 در سلول‌های تیمار شده با عصاره، فعالیت بیشتری نسبت به گروه‌های کنترل داشته است. به طوری که در هر دو رده سلولی، در غلظت 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر افزایش تقریباً 2/2 برابری و در غلظت 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر افزایش 6/2 برابری فعالیت کاسپاز نسبت به گروه کنترل مشاهده شد.
در مطالعه اُچ و همکاران، گونه‌های جونیپروس به عنوان منبعی جایگزین برای ترکیبات پودوفیلوتوکسین (PDP) و دئوکسی پودوفیلوتوکسین(dO-PDP) در نظر گرفته شدند و اثر کشندگی PDP و عصاره اتانولی برگ‌های گونه‌های جونیپروس علیه چندین رده سلولی سرطانی هم چون CCRF-CEM ،CEM-C1 و J45.01 ارزیابی شد. نتایج این مطالعه ارتباط احتمالی بین میزان PDP و اثر کشندگی عصاره اتانولی برگ‌های جونیپروس را نشان داده است و محدوده IC50 نیز از 3/0 الی 4/5 میکروگرم بر میلی‌لیتر گزارش شده است(21). عصاره الکلی بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا نیز می‌تواند هم چون سایر گونه‌های جونیپروس به عنوان منبعی از PDP و dO-PDP بوده و اثرات کشندگی عصاره این گیاه ناشی از این ترکیبات باشد.
نتیجه‌گیری
در این مطالعه برای اولین بار اثر کشندگی و آپوپتوتیک عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا بر روی
رده‌های سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد نشان داده شده است. لذا می‌توان عصاره این گیاه را به عنوان ماده‌ای با اثرات کشندگی بر روی رده‌های Nalm-6 و Reh پیشنهاد کرد. لازم است تحقیقات بیشتری در زمینه شناخت مکانیسم سلولی و مولکولی این عصاره بر روی رده‌های سلولی فوق صورت پذیرد، هم چنین این عصاره می‌تواند به عنوان جایگزین بالقوه در مطالعه‌های مرتبط با یافتن داروهای جدید در درمان بیماری لوسمی لنفوبلاستیک حاد مورد استفاده قرار گیرد.
متن کامل: (2772 مشاهده)
تاثیر عصاره بخش‌های هوایی گیاه اُرس(Juniperus excelsa)
بر تکثیر و مرگ سلول‌های سرطانی لوسمی لنفوبلاستیک حاد رده‌های
Nalm-6 و Reh
مینا درویشی1، سمیه اسماعیلی2، نسرین دهقان نیری3، پرگل مشاتی1، احمد قره‌باغیان4
چکیده
سابقه و هدف
لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL)، شایع‌ترین بدخیمی در کودکان است. به دلیل اثرات جانبی فراوان داروهای شیمی‌درمانی، استفاده از ترکیبات طبیعی مورد توجه قرار گرفته است. اُرس یک گیاه دارویی است که اثر مهاری عصاره آن بر روی چندین رده سلولی سرطانی گزارش شده است. هدف از این مطالعه، بررسی اثر کشندگی و آپوپتوتیک عصاره بخش‌های هوایی گیاه اُرس بر رده‌های سلولی ALL ( Nalm-6 و Reh) بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه بنیادی سلول‌های Nalm-6 و Reh بعد از کشت سلولی با غلظت‌های مختلف عصاره تیمار شده و با آزمون MTT ، درصد سلول‌های زنده بعد از 48 و 72 ساعت انکوباسیون بررسی شد. جهت درک مکانیسم مرگ سلولی از آزمون فلوسیتومتری Annexin V-FITC و سنجش فعالیت کاسپاز 3 استفاده شد. آنالیز آماری داده‌ها با استفاده از آزمون one-way ANOVA و 23 SPSS انجام گرفت.
یافته‌ها
نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد که غلظت‌های 3، 4 و 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره در هر دو رده سلولی، موجب کاهش معنادار درصد سلول‌های زنده می‌شود(001/0 p<). هم چنین نتایج حاصل از فلوسیتومتری حاکی از افزایش قابل توجه آپوپتوز در سلول‌های تیمار شده نسبت به گروه کنترل بود(001/0 p<). در آزمون سنجش فعالیت کاسپاز 3 نیز افزایش قابل توجه فعالیت آن در سلول‌های تیمار شده نسبت به گروه کنترل مشاهده شد(05/0 p<).
نتیجه گیری
با توجه به نتایج، عصاره بخش‌های هوایی گیاه اُرس دارای اثرات کشندگی و آپوپتوتیک بر سلول‌های سرطانی رده Nalm-6 و Reh بودند.
کلمات کلیدی: لوسمی لنفوبلاستیک حاد، جونیپروس اکسلسا، اثر کشندگی، آپوپتوز
تاریخ دریافت: 14/7 /95
تاریخ پذیرش : 19/8/95
1- دانشجوی کارشناسی ارشد خونشناسی آزمایشگاهی و بانک خون ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
2- PhD فارماکوگنوزی ـ دانشیار مرکز تحقیقات طب سنتی و مفردات پزشکی ـ دانشکده طب سنتی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
3- دانشجوی دکترای پروتئومیکس ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
4- مؤلف مسئول: PhD ایمونوهماتولوژی بالینی ـ استاد دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ مرکز تحقیقات بیماری‌های مادرزادی خونی کودکان دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ خیابان شریعتی ـ تهران ـ ایران ـ کد پستی: 15514-15468
بر تکثیر و مرگ سلول‌های سرطانی لوسمی لنفوبلاستیک حاد رده‌های
Nalm-6 و Reh
مینا درویشی1، سمیه اسماعیلی2، نسرین دهقان نیری3، پرگل مشاتی1، احمد قره‌باغیان4
چکیده
سابقه و هدف
لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL)، شایع‌ترین بدخیمی در کودکان است. به دلیل اثرات جانبی فراوان داروهای شیمی‌درمانی، استفاده از ترکیبات طبیعی مورد توجه قرار گرفته است. اُرس یک گیاه دارویی است که اثر مهاری عصاره آن بر روی چندین رده سلولی سرطانی گزارش شده است. هدف از این مطالعه، بررسی اثر کشندگی و آپوپتوتیک عصاره بخش‌های هوایی گیاه اُرس بر رده‌های سلولی ALL ( Nalm-6 و Reh) بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه بنیادی سلول‌های Nalm-6 و Reh بعد از کشت سلولی با غلظت‌های مختلف عصاره تیمار شده و با آزمون MTT ، درصد سلول‌های زنده بعد از 48 و 72 ساعت انکوباسیون بررسی شد. جهت درک مکانیسم مرگ سلولی از آزمون فلوسیتومتری Annexin V-FITC و سنجش فعالیت کاسپاز 3 استفاده شد. آنالیز آماری داده‌ها با استفاده از آزمون one-way ANOVA و 23 SPSS انجام گرفت.
یافته‌ها
نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد که غلظت‌های 3، 4 و 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره در هر دو رده سلولی، موجب کاهش معنادار درصد سلول‌های زنده می‌شود(001/0 p<). هم چنین نتایج حاصل از فلوسیتومتری حاکی از افزایش قابل توجه آپوپتوز در سلول‌های تیمار شده نسبت به گروه کنترل بود(001/0 p<). در آزمون سنجش فعالیت کاسپاز 3 نیز افزایش قابل توجه فعالیت آن در سلول‌های تیمار شده نسبت به گروه کنترل مشاهده شد(05/0 p<).
نتیجه گیری
با توجه به نتایج، عصاره بخش‌های هوایی گیاه اُرس دارای اثرات کشندگی و آپوپتوتیک بر سلول‌های سرطانی رده Nalm-6 و Reh بودند.
کلمات کلیدی: لوسمی لنفوبلاستیک حاد، جونیپروس اکسلسا، اثر کشندگی، آپوپتوز
تاریخ دریافت: 14/7 /95
تاریخ پذیرش : 19/8/95
1- دانشجوی کارشناسی ارشد خونشناسی آزمایشگاهی و بانک خون ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
2- PhD فارماکوگنوزی ـ دانشیار مرکز تحقیقات طب سنتی و مفردات پزشکی ـ دانشکده طب سنتی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
3- دانشجوی دکترای پروتئومیکس ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
4- مؤلف مسئول: PhD ایمونوهماتولوژی بالینی ـ استاد دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ مرکز تحقیقات بیماری‌های مادرزادی خونی کودکان دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ خیابان شریعتی ـ تهران ـ ایران ـ کد پستی: 15514-15468
مقدمه
لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL)، با تکثیر و تجمع کلونال سلول‌های بلاست در مغز استخوان و خون محیطی همراه است. این لوسمی در کودکان 2 الی 5 سال شایع‌تر است. شیوع این لوسمی در بالغین(بالای 15 سال)، یک سوم شیوع آن در کودکان می‌باشد. دومین شیوع بالای آن در بالغین بالای 50 سال است که با افزایش سن، احتمال بروز آن افزایش می‌یابد(1). مشتقات صناعی و نیمه صناعی حاصله از گیاهان، از منابع مهم داروهای ضد سرطان هستند(2). تقریباً 60% داروهایی که در بالین به عنوان ضد سرطان مصرف می‌شوند، از منابع طبیعی به دست آمده یا با آن مرتبط هستند. گیاهان مدت زمان زیادی است که در درمان سرطان استفاده می‌شوند(3). جونیپروس اکسلسا (Juniperus excelsa)، یک درخت یا درختچه‌ای همیشه سبز از خانواده Cupressaceae می‌باشد که در کشورهای منطقه بالکان، ترکیه، سوریه، لبنان، گرجستان، ارمنستان، آذربایجان و قسمت شرقی ایران نزدیک ترکمنستان و هم چنین در نواحی شمال شرق سواحل دریای سیاه و دامنه قفقاز وجود دارند(4). نام‌های محلی این گیاه اُرس، اردوج و آروس می‌باشد(5). جونیپروس اکسلسا یک گیاه دارویی محسوب می‌شود که در گذشته برای درمان دیس منوره یا قاعدگی دردناک، سرفه، برونشیت و سرماخوردگی، یرقان، سل و تحریک قاعدگی مورد استفاده قرار می‌دادند(8-6، 4). این گیاهان به طور سنتی در عربستان در درمان زردی و سل و در ترکیه برای درمان سرفه، برونشیت و هموروئید مورد استفاده قرار گرفته‌اند(9). هم چنین توسط افراد بومی ایران به عنوان گیاهی با کاربردهای متنوع شناخته شده است و به طور سنتی در درمان بیماری‌های قلبی، عصبی، گوارشی و مجاری ادراری و... کاربرد دارد(10). فعالیت ضد میکروبی ماده مؤثره میوه و برگ‌های این گیاه علیه چندین میکروب شامل باسیلوس سابتیلیس، کاندیدیا آلبیکنز، استافیلوکوک اورئوس و اشریشیاکلی مورد بررسی قرار گرفته است(4). هم چنین در مطالعه‌ای نشان داده شده که اجزای این گیاه فعالیت آنتی‌لیشمانیایی نیز دارد(11). در فرآیند آپوپتوز کاسپازها نیز نقش مهمی ایفا می‌کنند. کاسپازها، سیستئین پروتئازهایی هستند که به شکل پروآنزیم وجود دارند و در اثر شکسته شدن فعال می‌شوند(13، 12). دو مسیر جایگزین برای شروع فرآیند آپوپتوز وجود دارد: مسیر خارجی که وابسته به گیرنده‌های مرگ موجود بر سطح سلول است و مسیر داخلی که وابسته به میتوکندری می‌باشد. در هر دو مسیر کاسپازها فعال می‌شوند(14). مسیر خارجی و داخلی به یک مسیر مشترک ختم می‌شوند که با شکستن کاسپاز 3 آغاز شده و نهایتاً منجر به شکستن DNA ، دژنره شدن پروتئین‌های اسکلت سلولی و پروتئین‌های هسته‌ای، شکل‌گیری اجسام آپوپتوتیک، بیان لیگاند برای گیرنده‌های سلول‌های فاگوسیت‌کننده و در آخر جذب توسط سلول‌های فاگوسیت‌کننده منتهی خواهد شد(15). در این مرحله از آپوپتوز، فسفاتیدیل سرین(PS) به سطح خارجی غشای سلول می‌آید. فسفاتیدیل سرین‌ها به طور طبیعی در لایه داخلی یا سیتوپلاسمیک غشای سلول‌های زنده قرار گرفته‌اند(16). انکسین V دارای جایگاه اتصال به فسفاتیدیل سرین است. اخیرا مشخص شده هر نوع سلول دارای مکانیسمی است که باعث ظاهر شدن فسفاتیدیل سرین در سطح سلول می‌شود، که این مکانیسم طی آپوپتوز فعال می‌شود. جهت درک مکانیسم مرگ سلولی از آزمون فلوسیتومتری Annexin V-FITC استفاده می‌شود(17). هم چنین در این مطالعه، بررسی فعالیت کاسپاز 3 به دلیل اهمیت آن در هر دو مسیر آپوپتوز صورت گرفت. تا به حال در مورد اثرات سایتوتوکسیک و آپوپتوتیک عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا بر رده‌های سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد گزارشی منتشر نشده است، لذا در این مطالعه بر آن شدیم تا اثر این عصاره را بر سلول‌های سرطانی لنفوبلاستیک حاد شامل Nalm-6 و Reh مورد بررسی قرار دهیم.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه بنیادی، این گیاه از استان کهگیلویه و بویراحمد در جنوب غربی ایران جمع‌آوری شده است. اندام مورد استفاده در عصاره‌گیری، اندام هوایی شامل سرشاخه‌های مخروط‌دار بوده که در مرحله زایشی جمع‌آوری گردید. 10 گرم از پودر گیاه خشک شده توسط 100 میلی‌لیتر متانل(به نسبت 1 به 10) با استفاده از روش خیساندن(maceration) به مدت 24 ساعت عصاره‌گیری شد. عصاره‌های به دست آمده با استفاده از کاغذ صافی از پودر گیاه جدا شده و سپس با دستگاه روتاری در دمای کمتر از 40 درجه سانتی‌گراد تغلیظ و در ویال ریخته شد. عصاره تغلیظ شده در زیر هود خشک و تا قبل از بررسی در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. تمامی مراحل مربوط به عصاره‌گیری در مرکز تحقیقات طب سنتی و گیاهان دارویی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی و زیر نظر متخصص فارماکوگنوزی انجام گرفت. برای آماده‌سازی عصاره و رساندن آن به غلظت مورد نظر، ابتدا میزان 100 میلی‌گرم عصاره در میکروتیوب با ترازوی دیجیتال وزن شده و سپس در 1 میلی‌لیتر DMSO استریل حل شدند(غلظت نهایی استوک اولیه عصاره mg/mL 100 بود).
با توجه به رقیق نمودن استوک اولیه عصاره، جهت تهیه غلظت‌های مورد نیاز برای مطالعه، غلظت نهایی DMSO به کمتـر از 01/0 رسیده و نیازی به کنترلDMSO نبوده است.
کشت سلولی و تیمار سلول‌ها با عصاره:
رده‌های سلولی Nalm-6 و Reh از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران (تهران، ایران) تهیه شد. در یک مطالعه تجربی، به منظور کشت سلولی ابتدا سلول‌ها از تانک ازت خارج و یخ‌زدایی شدند، سپس در محیط کشت RPMI 1640 (جیبکو) حاوی 10% FBS و 1% پنی‌سیلین کشت داده شدند.
فلاسک‌های کشت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با 5% CO2 انکوبه شدند. بعد از این که سلول‌ها به قدر کافی رشد کردند، 105× 3 تا از هر سلول در پلیت‌های 96 خانه با غلظت‌های مختلف عصاره تیمار و در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با 5% CO2 به مدت 48 و 72 ساعت انکوبه شدند. غلظت‌های مختلف عصاره با استفاده از محیط کشت استریل تهیه شدند. همه آزمایش‌ها به صورت شش‌تایی و در حداقل سه آزمایش جداگانه مورد بررسی قرار گرفتند.
آزمون MTT به منظور سنجش فعالیت متابولیک:
پس از تیمار و اتمام زمان انکوباسیون، به هر چاهک 20 میکرولیتر محلول MTT (4,5 dimethyl diphenyl tetrazolium bromid ) اضافه نموده و مجدداً به مدت 2 تا 4 ساعت در انکوباتور دی‌اکسید کربن در 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. سپس پلیت‌ها با دور g2900 به مدت 9 دقیقه سانتریفوژ شده و محیط کشت رویی دور ریخته شد. در طی زمان انکوباسیون، MTT توسط سیستم سوکسینات دهیدروژناز که یکی از آنزیم‌های چرخه تنفسی میتوکندری‌ها است، احیا می‌شود. احیا و شکسته شدن این حلقه موجب تولید کریستال‌های آبی رنگ فورمازان می‌شود. میزان رنگ تولید شده با تعداد سلول‌هایی که از نظر متابولیک فعال هستند(سلول‌های زنده) رابطه مستقیم دارد. کریستال‌های فورمازان در آب غیرمحلول بوده و بایستی قبل از رنگ‌سنجی توسط ماده حلالی نظیر دی متیل سولفوکساید(DMSO) به حالت محلول درآیند. بنابراین بعد از تخلیه محیط کشت، 100 میکرولیتر DMSO به هر چاهک اضافه شد. در نهایت جذب نوری چاهک‌ها توسط دستگاه الایزا ریدر در طول موج 570 نانومتر قرائت شده و درصد سلول‌های زنده با فرمول زیر محاسبه شدند.
آزمون فلوسیتومتری به منظور سنجش میزان آپوپتوز:
ابتدا سلول‌ها در محیط RPMI حاوی 10% FBS در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد حاوی 5% گاز CO2 به منظور دسترسی به جمعیت مورد نظر کشت شدند. طبق دستور کیت(Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC ، بیوساینس)، برای هر آزمون به 105 × 3 سلول نیاز است. سلول‌ها در پلیت 96 خانه با غلظت‌های مختلف عصاره تیمار شده و به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. بعد از انکوباسیون، سلول‌ها به فالکون منتقل شده و سانتریفوژ شدند و مایع‌رویی آن دور ریخته شد. 500 میکرولیتر از بافر باندکننده به سلول‌های تیمار شده اضافه شد، سپس به ویال مربوط به انجام فلوسیتومتری منتقل شدند. در نهایت 5 میکرولیتر انکسین V و 16 میکرولیتر PI (Premium Iodide) به ویال اضافه و به مدت 20 دقیقه در تاریکی و در دمای اتاق انکوبه شدند در نهایت ویال‌ها توسط دستگاه فلوسیتومتری خوانده شد.
آزمون بررسی فعالیت کاسپاز 3 به منظور سنجش میزان آپوپتوز:
برای این آزمایش از کیت سنجش کلرومتریک فعالیت کاسپاز 3 (آبکام، آمریکا، ab39301) استفاده شد. تعداد سلول مورد نیاز برای هر غلظت طبق دستورالعمل کیت، 105 × 5-1 می‌باشد. ابتدا سلول‌های کشت داده شده با دوزهای مختلف عصاره جونیپروس اکسلسا در پلیت‌های 12 خانه، طبق روشی که قبلاً توضیح داده شد، تیمار شده و پلیت به مدت 48 ساعت در انکوباتور CO2 دار انکوبه شد. بعد از انکوباسیون، طبق دستورالعمل کیت پروتئین‌های سلول‌ها استخراج شده و به روش BCA protein assay ، میزان پروتئین آن‌ها سنجیده شد. غلظت مناسب پروتئین برای هر آزمون در سنجش فعالیت کاسپاز 3 ، 50 الی 200 میکروگرم به ازای هر 50 میکرولیتر بافر لیز کننده می‌باشد. در ادامه آزمون، فعالیت کاسپاز 3 همراه با تکرار به صورت دوتایی صورت گرفت. یک چاهک به عنوان background حاوی 50 میکرولیتر Reaction Buffer و در سایر چاهک‌ها، به میزان 50 میکرولیتر از نمونه‌ها اضافه شدند. سپس 50 میکرولیتر از مخلوط 2X Reaction Buffer و DTT و سپس به میزان 5 میکرولیتر از سوبسترا (4 میلی‌مول DEVD-p-NA) به هر چاهک اضافه کرده و پلیت به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. در نهایت جذب نوری چاهک‌ها در طول موج nm 450-400 خوانده شد.
آزمون‌های آماری:
آنالیز آماری داده‌ها با کمک نرم‌افزار 23 SPSS صورت گرفت. از آزمون one-way ANOVA برای ارزیابی اختلاف آماری بین گروه‌های تیمار شده و کنترل استفاده شد و 05/0 p< از لحاظ آماری معنادار تلقی گردید و 001/0 p<، 01/0 p< و 05/0 p< نشانگر کاهش معنادار نسبت به کنترل بودند.
یافته‌ها
نتایج آزمون MTT :
برای انجام آزمون MTT ، سلول‌های Nalm-6 و Reh با غلظت‌های 1، 2، 3، 4 و 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره جونیپروس اکسلسا با روشی که قبلا بیان شد، تیمار شدند. بعد از 48 و 72 ساعت انکوباسیون پلیت‌ها، جذب خانه‌های حاوی سلول‌های تیمار شده با جذب خانه‌های حاوی سلول‌های کنترل مقایسه شده و درصد سلول‌های زنده محاسبه گردید.
نمودار 1: اثر کشندگی عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا بر رده سلولی Nalm-6 با روش MTT
نمودار 2: اثر کشندگی عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا بر رده سلولی Reh با روش MTT
شکل 1: بررسی میزان آپوپتوز سلول‌های تیمار شده با عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا در رده‌های سلولی Nalm-6 و Reh به روش فلوسیتومتری. در این گراف‌ها ربع سمت چپ پایین- سلول‌های انکسین منفی/PI منفی(سلول‌های زنده)، ربع سمت چپ بالا- سلول‌های انکسین مثبت/PI منفی(آپوپتوز اولیه)، ربع سمت راست پایین- سلول‌های انکسین منفی/PI مثبت(سلول‌های نکروتیک) و ربع سمت راست بالا-سلول‌های انکسین مثبت/PI مثبت(آپوپتوز تاخیری) می‌باشند.
نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد که افزایش دوز عصاره جونیپروس اکسلسا، باعث کاهش فعالیت متابولیکی ناشی از مرگ سلول‌های Nalm-6 و Reh می‌شود. فرآیند کاهش فعالیت متابولیک علاوه بر این که وابسته به غلظت عصاره است، وابسته به زمان نیز می‌باشد. به طوری که بعد از تیمار 48 ساعته با غلظت µg/mL 4 و در تیمار 72 ساعته، در غلظت µg/mL 3 ، حدوداً 50% از سلول‌ها (IC50) در هر دو رده سلولی کشته شدند. همان طور که در نمودارهای 1 و 2 نشان داده شده است، در تیمار 48 ساعته، میانگین جذب نوری در غلظت‌های 3 ، 4 و 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر به میزان قابل توجه‌ای با گروه کنترل متفاوت بوده(001/0 p<) و در تیمار 72 ساعته علاوه بر غلظت‌های فوق، غلظت 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر نیز اختلاف قابل توجه‌ای نسبت به گروه کنترل داشته است (001/0 p< ). در نمودارهای 1 و 2، داده‌ها به صورت mean ± SD ، حاصل از حداقل سه آزمون جداگانه گزارش شدند.
نتایج آزمون فلوسیتومتری:
برای آزمون فلوسیتومتری، سلول های Nalm-6 و Reh با غلظت‌های 2 و 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره جونیپروس اکسلسا با روشی که قبلاً بیان شد، تیمار شدند. نتایج حاصل از آزمون فلوسیتومتری بعد از تیمار 48 ساعته، نشان‌دهنده افزایش میزان آپوپتوز در سلول‌های تیمار شده با عصاره نسبت به گروه کنترل بود. همان طور که در شکل 1 و نمودار 3 نشان داده شده است، میزان آپوپتوز سلول‌ها وابسته به غلظت عصاره بوده و غلظت 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره در هر دو رده سلولی، باعـث
نتایج آزمون فلوسیتومتری:
برای آزمون فلوسیتومتری، سلول های Nalm-6 و Reh با غلظت‌های 2 و 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره جونیپروس اکسلسا با روشی که قبلاً بیان شد، تیمار شدند. نتایج حاصل از آزمون فلوسیتومتری بعد از تیمار 48 ساعته، نشان‌دهنده افزایش میزان آپوپتوز در سلول‌های تیمار شده با عصاره نسبت به گروه کنترل بود. همان طور که در شکل 1 و نمودار 3 نشان داده شده است، میزان آپوپتوز سلول‌ها وابسته به غلظت عصاره بوده و غلظت 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره در هر دو رده سلولی، باعـث
نمودار 3: نمودار نتایج حاصل از آزمون فلوسیتومتری در سلول Nalm-6 و Reh (01/0 p<)***
نمودار 4: نمودار فعالیت کاسپاز 3 در سلول‌های Nalm-6 و Reh . نمودار فوق میزان فعالیت کاسپاز 3 در سلول‌های Nalm-6 و Reh پس از تیمار 48 ساعته با عصاره گیاه جونیپروس اکسلسا را نشان می‌دهد. بعد از استخراج پروتئین و انجام مراحل مرتبط با کیت فعالیت کاسپاز 3، OD پلیت بعد از 24 ساعت سنجیده شد(01/0 p< ** و 05/0 p< *).
افزایش چشمگیر و معنادار آپوپتوز نسبت به گروه کنترل می‌شود(001/0 p<). در این آزمایش هم چنین افتراق سلول‌های آپوپتوز شده از سلول‌های نکروتیک صورت گرفت(شکل 1). همان طور که در شکل 1 نشان داده شده است، درصد سلول‌های نکروز شده در سلول‌های تیمار شده با عصـاره نسبـت بـه گروه‌های کنترل ، در هر دو رده
سلولی اختلاف معناداری نداشته است.
نتایج آزمون فعالیت کاسپاز 3:
برای این آزمون، سلول‌های Nalm-6 و Reh با غلظت‌های 2 و 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره جونیپروس اکسلسا با روشی که قبلاً بیان شد، تیمار شدند. نتایج حاصل از سنجش فعالیت کاسپاز 3 نشان داد که در هر دو رده سلول Nalm-6 و Reh ، تیمار با عصاره جونیپروس اکسلسا، باعث افزایش فعالیت کاسپاز 3 نسبت به گروه‌های کنترل می‌شود. در سلول‌های Nalm-6 میانگین جذب نوری در غلظت‌های 2 و 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره به میزان زیادی با گروه کنترل متفاوت است(05/0 p<). در سلول‌های Reh نیز غلظت‌های 2 و 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره دارای اختلاف قابل توجه نسبت به گروه کنترل می‌باشد(01/0 p<)(نمودار 4). داده‌ها در نمودار 4 به صورت mean ± SD ، حاصل از حداقل سه آزمون جداگانه گزارش شدند.
بحث
نتایج حاصل از این مطالعه بیانگر اثر مهاری عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا بر رده‌های سلولی Nalm-6 و Reh می‌باشد. همان طور که در نتایج مربوط به آزمون MTT نشان داده شده است، در هر دو رده سلولی، عصاره گیاه جونیپروس اکسلسا از غلظت 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر به بالا دارای اثر کشندگی قابل توجه‌ای نسبت به گروه‌های کنترل بوده و بیشترین اثر مهاری در تیمار 72 ساعت مشاهده شد. به طوری که کاهش در میزان سلول‌های زنده، به ویژه در غلظت‌های بالاتر مشهود است. در بررسی‌هایی که قبلاً صورت گرفت، اثر مهاری عصاره دانه و شاخه‌های گیاه جونیپروس اکسلسا بر روی رده‌های سلولی دیگر از جمله HeLa ، KB و MDA-MB-468 در غلظت‌های بیشتر از 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره‌ها نشان داده شده است(18). این در حالی است که در مطالعه حاضر غلظت‌های کمتر از 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر بررسی و اثرات مهارکنندگی مشاهده شده است. هم چنین در مطالعه دیگری نیز اثر ضد توموری عصاره دانه‌های گیاه جونیپروس اکسلسا بررسی شد که مهار 86 درصدی تومور در مقایسه با داروی کنترل وین کریستین را گزارش نمودند(11). در مطالعه دیگری اثر مهاری ماده مؤثره گیاه جونیپروس اکسلسا بر رده‌های سلولی CCRF-CEM و CEM-ADR5000 مورد بررسی قرار گرفته و IC50 معادل 44-41 میکروگرم بر میلی‌لیتر گزارش شده است(19). در مطالعه اسماعیلی و همکاران، اثر کشندگی عصاره گیاه جونیپروس اکسلسا بر دیگر سلول‌های سرطانی از جمله HepG-2 ، MCF-7 و A-549 بررسی و IC50 معادل µg/mL 30 > گزارش شده است(20).
در مطالعه حاضر نتایج حاصل از آزمون فلوسیتومتری نیز نشان داد که غلظت µg/mL 3 عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا تاثیر بسیار قابل توجه‌ای(7 الی 5/7 برابر نسبت به گروه‌های کنترل) بر روی آپوپتوز هر دو رده سلولی گذاشته است، که این میزان آپوپتوز با کاهش معنادار درصد سلول‌های زنده در آزمون MTT مطابقت دارد. هم چنین در این مطالعه میزان فعالیت کاسپاز 3 نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. افزایش فعالیت کاسپاز 3 در سلول‌های تیمار شده با عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا، نسبت به گروه‌های کنترل نیز حاکی از افزایش القای فرآیند آپوپتوز در هر دو رده سلولی مورد مطالعه می‌باشد. همان طور که در نمودار 4 نشان داده شده است، کاسپاز 3 در سلول‌های تیمار شده با عصاره، فعالیت بیشتری نسبت به گروه‌های کنترل داشته است. به طوری که در هر دو رده سلولی، در غلظت 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر افزایش تقریباً 2/2 برابری و در غلظت 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر افزایش 6/2 برابری فعالیت کاسپاز نسبت به گروه کنترل مشاهده شد.
در مطالعه اُچ و همکاران، گونه‌های جونیپروس به عنوان منبعی جایگزین برای ترکیبات پودوفیلوتوکسین (PDP) و دئوکسی پودوفیلوتوکسین(dO-PDP) در نظر گرفته شدند و اثر کشندگی PDP و عصاره اتانولی برگ‌های گونه‌های جونیپروس علیه چندین رده سلولی سرطانی هم چون CCRF-CEM ،CEM-C1 و J45.01 ارزیابی شد. نتایج این مطالعه ارتباط احتمالی بین میزان PDP و اثر کشندگی عصاره اتانولی برگ‌های جونیپروس را نشان داده است و محدوده IC50 نیز از 3/0 الی 4/5 میکروگرم بر میلی‌لیتر گزارش شده است(21). عصاره الکلی بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا نیز می‌تواند هم چون سایر گونه‌های جونیپروس به عنوان منبعی از PDP و dO-PDP بوده و اثرات کشندگی عصاره این گیاه ناشی از این ترکیبات باشد.
نتیجه‌گیری
در این مطالعه برای اولین بار اثر کشندگی و آپوپتوتیک عصاره بخش‌های هوایی گیاه جونیپروس اکسلسا بر روی
رده‌های سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد نشان داده شده است. لذا می‌توان عصاره این گیاه را به عنوان ماده‌ای با اثرات کشندگی بر روی رده‌های Nalm-6 و Reh پیشنهاد کرد. لازم است تحقیقات بیشتری در زمینه شناخت مکانیسم سلولی و مولکولی این عصاره بر روی رده‌های سلولی فوق صورت پذیرد، هم چنین این عصاره می‌تواند به عنوان جایگزین بالقوه در مطالعه‌های مرتبط با یافتن داروهای جدید در درمان بیماری لوسمی لنفوبلاستیک حاد مورد استفاده قرار گیرد.
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
