دانشیار دانشکده علوم دانشگاه اصفهان ـ خیابان هزار جریب ـ اصفهان ـ ایران و گروه زیست فناوری سلولی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشکده زیست فناوری جهاد دانشگاهی ـ پژوهشگاه رویان
احتمال نقش تنظیمی miR-146a بر ژنهای دخیل در مسیرهای داخل سلولی سرطان معده القا شده توسط هلیکوباکتر پیلوری بر اساس یافتههای بیوانفورماتیکی
بهاره آدمی1، کامران قائدی2، اردشیر طالبی3
چکیده سابقه و هدف سرطان معده چهارمین سرطان شایع دنیا و دومین عامل مرگ و میر محسوب میشود. عوامل محیطی و هم چنین عوامل ژنتیکی، نقش به سزایی در ابتلا و پیشرفت این بیماری ایفا میکنند. مهمترین این عوامل هلیکوباکتر پیلوری است که در اکثر بافتهای سرطانی قابلرؤیت است. با ورود میکرو RNA ها به حوزه یافتههای ژنتیکی، این مولکولهای قدرتمند جایگاه خود را در حوزه ژنتیک بیماریها باز کردند. miRNAها، مولکولهای کوچک غیرکدکنندهای هستند که در پروسههای متعدد سلولی از قبیل تمایز و مرگ سلولی شرکت دارند. در این مطالعه، با استفاده از پایگاه دادههای بیوانفورماتیک ژنهای دخیل در مسیرهای سیگنالینگ سلولی مؤثر در فرآیند سرطانی شدن سلولها و ارتباط آن با miR-146a بررسیشده است. مواد و روشها این مطالعه از نوع تئوریکال بیوانفورماتیکی بوده و به صورت نظری با مراجعه به پایگاه داده Target Scan ، miRTar Base و 0/2 miR Walk انجام پذیرفت. پس از به دست آوردن پروتئینهایی که تحت تأثیر miR-146a قرار میگیرند، بررسی نهایی در پایگاه David بهمنظور دستیابی به مسیرهای سیگنالینگ انجام گرفت که بهتفصیل به شرح آن پرداخته میشود. یافتهها بر اساس نتایج به دست آمده، miR-146a احتمالاً میتواند با تأثیر بر پروتئینهایی از قبیل P53 ، BCL2 ، اعضای خانواده RASو پروتئینهای دخیل در مسیر JAK-STAT ، miRNA کلیدی در جلوگیری از پیشرفت بیماری باشد. نتیجه گیری با توجه به این نتایج میتوان گفت miR-146a احتمالاً میتواند از طریق افزایش متاستاز و حمله بافتی و هم چنین کاهش چسبندگی بین سلولی و مهار مرگ سلولی، به عنوان مارکر تاییدی تشخیصی و پیشآگهیدهنده پیشرفت سرطان مورد استفاده قرار گیرد. کلمات کلیدی:سرطانهای معده، میکروRNAها، هلیکوباکتر
تاریخ دریافت: 26/7 /95 تاریخ پذیرش : 12/10/95
1- کارشناس ارشد میکروبیولوژی ـ دانشکده علوم دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان ـ اصفهان ـ ایران 2- مؤلف مسؤول: PhD بیولوژی مولکولی ـ دانشیار دانشکده علوم دانشگاه اصفهان ـ خیابان هزار جریب ـ اصفهان ـ ایران و گروه زیست فناوری سلولی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشکده زیست فناوری جهاد دانشگاهی ـ پژوهشگاه رویان ـ اصفهان ـ ایران ـ کدپستی: 73441-81746 3- متخصص آسیبشناسی ـ استاد دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان ـ اصفهان ـ ایران
مقدمه سرطان معده(Gastric cancer)، به سرطانی گفته میشود که منشا شروع آن از معده است(1). شایعترین فرم آن آدنوکارسینوما نام دارد که منشا آن سلولهای درونیترین لایه دیواره معده یا لایه موکوزی است(2). این سرطان به دلیل شیوع و مرگ و میر بالای آن و نیز به دلیل پیشرفت سریع و تشخیص دیر هنگام برای درمان، جزو سرطانهای مهم که ارتباط مستقیم با مرگ بیمار دارد دستهبندی میشود(4، 3). سرطان معده به عنوان چهارمین سرطان شایع جهان و دومیـن بدخیمـی کشنـده معرفی شده است (6، 5). از دیدگاه اپیدمیولوژی، تشخیص و درمان آن در مناطق مختلف جغرافیایی ایران تفاوت چشمگیری دارد، شمال و شمال غرب کشور جزو مناطق پرخطر و جنوب و جنوب شرق کشور جزو مناطق کمخطر محسوب میشوند. در این میان، پرخطرترین و کمخطرترین استانها به ترتیب اردبیل و خوزستان گزارش شدهاند(7). سرطان معده یک بیماری چند عاملی ناشی از عوامل محیطی و وراثتی است که تمامی این عوامل سبب بروز و پیشرفت سرطان میشوند(8). از جمله این عوامل میتوان به ویژگیهای ژنتیکی میزبان, عوامل عفونی(عفونت با هلیکوباکتر پیلوری) و عادات غذایی مانند مصرف الکل و سیگار اشاره نمود(11-9). طبق آمار سازمان بهداشت جهانی(WHO = World Health Organization)، هلیکوباکتر پیلوری به عنوان کارسینوژن تیپ ۱ دستهبندی میشود(12). این باکتری اسپیرال گرم منفی با قطر حدود ۵/۰ میکرومتر و با دارا بودن تنوع بالایی از فاکتورهای بیماریزا مانند cagA ، vacA و جزیره پاتوژنیسیته(cagPAI) که باعث ایجاد الگوهای مختلف ایمنی در بدن فرد میشود, خطر ابتلا به سرطان معده در فرد آلوده به این باکتری را افزایش میدهد(16-13). در پی عفونت فرد با هلیکوباکترپیلوری، شاهد تغییر پروفایل بیانی RNA های کوچکی به نام میکروRNA هستیم که تأثیر به سزایی بر پروتئینهای هدف خود دارند و مسیر سلولی را از روند طبیعی خود خارج میکنند(17). میکروRNA ها گروه جدیدی از RNAهای غیر کدکننده و تکرشتهای به طول تقریباً ۲۰ الی ۲۵ نوکلئوتید هستند که در گیاهان و جانوران یافت شده و نقش محوری در تنظیم فرآیندهای سلولی مانند رشد، تمایز و مرگ سلولی دارند. هم چنین میتوان شاهد نقش آنها به عنوان آنکوژن و آنکومیر بود(19، 18). این مولکولهای زیستی در تحقیقات بسیاری به عنوان مارکرهای زیستی معرفی شدهاند و نقش آنها در تشخیص زود هنگام سرطانهای مختلـف و هـم چنیـن درمان سرطانها تائید شده است (21، 20). تاکنون بالغ بر ۹۰۰ میکروRNA در پستانداران شناساییشده که نقش خود را در تنظیم و کنترل بیان ژنها در سطح پس از رونویسی، اعمال میکنند. به طوری که با تخریب و یا مهار ترجمه mRNA ، از بیان پروتئینها جلوگیری به عمل میآورند(22). میکروRNAها نخستین بار در سال ۱۹۹۳ توسط ویکتور آمبروس و همکاران طی مطالعه ژن lin-4 در طی تکوین کرم C. elegans شناسایی شدند. 1% ژنوم انسان کدکننده میکروRNA است و ۳۰- ۱۰ درصد ژنها نیز کدکننده پروتئینهای هدف این میکروRNAها میباشند(23). ژن اکثر میکروRNAهای شناخته شده به صورت واحدهای مستقل رونویسی در ژنوم قرارگرفتهاند (24). بیوژنز میکروRNA در هسته آغاز و در سیتوپلاسم پایان میپذیرد. این پردازش شامل مراحل رونویسی، پردازش در هسته، خروج از هسته، پردازش در سیتوپلاسم و نهایتاً همراه شدن میکروRNA بالغ با کمپلکس RISC است که بسته به میزان پایداری ترمودینامیکی انتهای 5' یکی از دو رشته آن به عنوان رشته راهنما در کمپلکس RISC باقیمانده و رشته دیگر تجزیه میشود(26، 25). بررسیهای متعدد به نقش بارز میکروRNA ها در تعداد زیادی از بیماریهای انسانی از جمله عقبافتادگیهای ذهنی، بیماریهای متابولیک، بیماریهای قلبی، بیماریهای عصبی از جمله اماس و انواع سرطانها اشاره دارد(29-27). has-miR-146a توسط ژن MIR146a کد میشود و اولین بار به عنوان یکتنظیمکنندهسیستمایمنیبدنکشفشد که پاسخپستاندارانبهعفونتهایمیکروبی را تحت تأثیر قرار میداد(30). miR-146a در سرطانهـای زیادی ازجمله سرطان سینه، تخمدان، رحم، کلون، ریه، کبد، مغز، پروستات، پانکراس، تیروئید و مری دیده میشود(32، 31). این miRNA در مراحل اولیه سرطان معده قابل شناسایی است. miR-146a دارای ژنهای هدف زیادی است که از جمله آنها میتوان به ژنهای STAT3 ، Rho ، Ras ، ERK1 ، BAX ، BCL2 ، P53 و Cdc42 اشاره کرد(34، 33).
تأثیر miR-146a بر فرآیندهای سلولی متاستاز، رگزایی و آپوپتوز: آپوپتوز یک فرآیند طبیعی سلولی است که درنتیجه آن میزان رشد و نمو و تکثیر سلولهای بدن کنترل میشود. فعالیت بیش از حد آپوپتوز سبب ایجاد بیماریهایی مانند پارکینسون و آلزایمر میشود و کاهش فعالیت آن، سرطانی شدن سلولها را در پی دارد(35). ژنهای درگیر در فرآیند آپوپتـوز به دو دسته تقسیم میشوند: ژنهـایی کـه در ایجـاد آپوپتـوز نقـش دارنـد (pro –apoptotic)و ژنهایی که مانع ایجاد آپوپتوز مـیشـوند (anti- apoptotic). هر دو دسته ژنهـای دخیـل در آپوپتـوز، توانایی تنظیم توسط میکروRNAها را دارند. هر میکروRNA بهتنهایی میتواند هر دو نقـش pro-apoptotic و anti-apoptotic را داشـته باشد که این نقش بر اساس نوع سلول و نوع ژن درگیر تعیـین میشود(36). در مسیر آپوپتوز مهار شده توسط miR-146a ، شاهد تغییر در پروتئین P53 هستیم. P53 یکی از ژنهای بازدارنده توموری است که در اکثر سرطانهای انسانی دچار جهش میشود. این ژن به نام نگهبان ژنوم شناخته میشود که به نقش حیاتی آن در سرکوب تومور، توقف چرخه سلولی، القای آپوپتوز و مهار رگ زایی اشاره دارد(37). BCL2 اولین بار به عنوان یک پروتوآنکوژن در لنفومای فولیکولار سلولهای B شناخته شد و پس از آن به عنوان یکی از اعضای مهم فرآیند آپوپتوز معرفی شد(38). اعضای این خانواده به دو دسته ۱- ضد آپوپتوز که شامل BCL2 و BCL-XL میباشند، ۲- اعضای پروآپوپتوز که شامل BAX و BAK میباشند، تقسیم میشود. این پروتئینها با اتصال به غشای خارجی میتوکندری و مهار اعضای خانواده پرو آپوپتوتیک BCL2 ، باعث حفظ تمامیت غشای میتوکندری و مهار آپوپتوز میشود(39)(شکل ۱).
شکل 1: ژنهای دخیل در به تاخیر انداختن مرگ سلولی تصاویر به صورت شماتیک از مسیر DAVID که در شکل شماره 4 آورده شده برگرفته شده است.
طی بررسیهای پیشین انجام شده اثرات مختلف فعالسازی پروتئین Rho در سلولهای سرطانی مشاهده شده است.از مهمترین نقشهای آن مهار مرگ سلولی و کمک به افزایش طول عمر سلول سرطانی است. پروتئین Rho از اعضای خانواده بزرگ Rasاست. اعضای این خانواده در بیش از ۳۰ درصد سرطانهای انسانی دچار جهش میشوند که نتیجه آن سرکوب مرگ سلولی و کمک به طول عمر سلولی به دلیل از دست رفتن قطبیت سلولی است و در مرحله بعد از آن شاهد حمله سلولهای توموری به نقاط دیگر به دلیل از بین بردن پروتئینهای چسبندگی هستیم(41، 40). متاستاز که به مفهوم رشد، تکثیر و تهاجم سلولهای توموری در مکانهای متفاوت بدن است، شامل مراحل گوناگون به شرح زیر است: ۱- تهاجم ۲- ورود به لومن رگهای خونی ۳- بقاء در جریان خون، ۴- توقف در محل اندام ثانویه ۵- خروج از خون به بافت پارانشیمی اندام هدف ۶- تشکیل ریز متاستاز و ۷- تشکیل کلنی متاستازی(44-42). از جمله پروتئینهای مهم در اتصال بین سلولی، ای-کادهرینها هستند. ای - کادهرین گلیکوپروتئین غشایی وابسته به کلسیم است که ژن کدکننده آن روی کروموزوم 16q22.1 قرار دارد. نقش مهم آن در چسبندگی بین سلولی و تقسیم و تمایز در بافتهای اپیتلیال به اثبات رسیده است(45). جهش آن سبب افزایش خاصیت تهاجمی سلولهای سرطانی میشود. سلول توموری به ۲ صورت متفاوت وارد مرحله تهاجم میشود: ۱- تهاجم مزانشیمی(Mesenchymal invasion) ۲- تهاجم آمیبی که وابسته به پروتئینهای Rho/Rock است. خانواده Rho-GTPase در مراحل مختلف ایجاد و در پیشرفت سرطان شامل ترانسفورماسیون سلولی، بقا، تهاجم، متاستاز و رگزایی نقش مهمی ایفا میکنند(48-46). افزایش بیان RhoA ،Rac1 و Cdc42 با سرطانزایی و پیشرفت تومورهای متعدد انسانی مرتبط است(48). فعال شدن Rac منجر به پلیمریزاسیون اکتین شده که این امر خود منجر به افزایش چسبندگیهای موضعی میشود. ایجاد چســبندگیهای موضعی نیز به نوبه خود باعث فعال شدن Rac میشود که یک حلقه پس نورد مثبت را ایجاد میکند. هنگامی که تنظیم این حلقه از کنترل خارج شــود، تحرک و تهاجم سلول افزایش مییابد. این نظریه بیانکننده این مطلب است که افزایش فعالیت Rac در واریانتهای متاستاتیک سلولی افزایش مییابد(49)(شکل ۲).
شکل ۲: ژنهای دخیل در مسیر تهاجم و حمله بافتی - تصاویر به صورت شما تیک از مسیر DAVID که در شکل شماره ۴ آورده شده برگرفته شده است.
در مسیر متاستاز شاهد فرآیند رگزایی(Angiogenesis) هستیم. از آن جا که سلولهای توموری رشد سریعتر و کنترل نشدهای نسبت به سلولهای طبیعی دارند، برخی از آنها که دور از رگهای خونی قرار میگیرند دچار هیپوکسی یا کمبود اکسیژن میشوند. ازاینرو شروع به فرآیند رگ زایی در درون و اطراف تومور میکنند تا اکسیژن موردنیاز سلولها را تأمین کنند (50). از جمله پروتئینهای مهم در فرآیند رگ زایی که تحت تأثیر miR-146a بیان آن دچار تغییر میشود، میتوان به پروتئین COX2 اشاره کرد که پس از تحریک بیان توسط miR-146a ، توانایی ایجاد رگهای جدید را دارند. هم چنین نشان داده شده است که میکروRNA های در گردش که توسط سلولهای توموری آزاد میشوند، ممکن است در فرآیندهای رگزایی و تنظیمات ایمونولوژی سلولهای توموری دوردست دخالت کنند. آنزیم سیکلواکسیژناز یا پروستاگلاندین اندوپراکسید H سنتتاز(PGHs)، با التهاب و رگزایی در سرطان ارتباط دارد.COX2 یک آنزیم القایی است که طی پدیدههای پاتولوژیک چون التهاب، به میزان قابلتوجهی افزایش مییابد. رگهای خونی ایجاد شده طی این فرآیند، پیچیدگی فضایی بیشتری داشته و مورفولوژی آنها مدام در حال تغییر است که موجب تسهیل ورود سلول توموری به خون میشود)51(. افزایش بیان COX2 در سرطان معده و ریه نشان داده شده است که عملکرد آن مهار مرگ سلولهای توموری است(53، 52). هم چنین در مسیر رگزایی یکی از ژنهای هدف miR-146a ,STAT3 است. STAT3 یا signal transducter and activator of transcription 3 ، یک فاکتور رونویسی در انسان است که توسط ژن STAT3 کد میشود که در رگزایی نقش دارد(54). این فاکتور در پاسخ به سایتوکینها، فاکتورهای رشد و اعضای خانواده STAT3 ، توسط receptor associated kinase فسفریله میشود و به فرم همو یا هترو دایمر به هسته انتقال مییابد و به عنوان فعالکننده فاکتور رونویسی عمل میکند. EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) و رسپتـور تیروزیــن کینـــــازها مثل C-Met باعث فسفریلاسیون STAT3 میشوند. فسفریله شدن STAT3 باعث فعال شدن VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) شده که نتیجه آن رگزایی در سلولهای توموری است. نکته جالب این که اینترلوکینهایی مثل IL-8 که در انتهای آمینی خود دارای توالیگلوتامیک اسید- لوسین- آرژنین(Glu-Leu-Arg) هستند، سبب تقویت فرآیند رگزایی شده و اینترلوکینهای فاقد این توالی مثل IL-4 مهارکننده رگزایی میباشند(55)(شکل ۳). هدف از این پژوهش، دستیابی به ژنهای هدف miR-146a با استفاده از روش بیوانفورماتیکی است که بتوانند بیشترین اثرگذاری را در مسیرهای منتهی شده به پیشرفت سرطان داشته باشند تا بدین وسیله بتوان از این miRNA در تشخیص به موقع سرطان استفاده نمود.
شکل ۳ : ژنهای القاء شده توسط miR-146a در مسیر رگزایی - تصاویر بهصورت شماتیک از مسیر DAVID که در شکل شماره ۴ آورده شده برگرفته شده است.
مواد و روشها مبنای انجام این مطالعه تئوریکال بیوانفورماتیکی بوده و طی ۳ مرحله که شامل جمعآوری دادهها، بررسی دادههای به دست آمده در پایگاههای معتبر بیوانفورماتیکی و نهایتاً بررسی یافتهها بود، انجام پذیرفت.
جمعآوری دادهها: به منظور مطالعه اهداف میکروRNAها، سایتهای اینترنتی وجود دارند که بر اساس میزان جفت بازهایی که بین میکرو RNA و mRNA هدف برقرار میشود، ژنهای هدف آن میکرو RNA را پیشبینی میکند(جدول 1). به منظور پیشبینی و کاندید کردن میکرو RNA های دخیل در تمایز سلولهای سرطانی، ابتدا فهرستی از میکرو RNA هایی که در سرطان معده دخیل بوده و حداقل در مطالعهها مطرح شده بودند، از پایگاه داده PhenomiR تهیه گردید. در این میان miR-146a به عنوان یک میکرو RNA که در سرطان معده وابسته به هلیکوباکتر پیلوری افزایش بیان داشته، انتخاب شد.
بررسی میانکنش بین mRNA-miRNA از طریق پایگاه داده miRWalk 2.0,TargetScan,miRTarBase و DAVID : با استفاده از پایگاه داده miR Walk 2/0 میانکش مهاری ایـن لیسـت میکـروRNA بـر روی تنظیمکنندههای مثبت و منفی تمایز سلولهای سرطانی، صورت گرفت. پایگاه miRWalk 2.0 یک پایگاه پیشبینی میانکنش miRNA-mRNA است که توسط گروه بیوانفورماتیک دانشگاه هایدل برگ آلمان طراحی شده است و با آدرس http: //www. umm. uni-heidelberg. de/apps/zmf/miRWalk 2.0/ به صورت رایگان، در دسترس عموم است. در این پایگاه علاوه بر مشاهده پیشبینی میان کنشهای بهدستآمده میتوان با مقایسه همزمان نتایج حاصل از یازده پایگاه دیگر امکان انجام میانکنش را بهطور دقیقتری مورد بررسی قرار داد. ژنهای هدف پیشبینیشده میکروRNA در پایگاههای miRWalk 2.0 و هم چنین پایگاههای miRNA ، miRMap ، miRDB ، mirbridge ، miRanda ، Microt4 RNAhybrid ، 22 RNA ، PITA ، Pictar2 ، Map و Targetscan نشان داده میشوند. در پایگاه miRWalk2/0 در صورتیکه هر یک از 11 پایگاه بیوانفورماتیکی احتمال تأثیر بر روی یک mRNA خاص توسط یک miRNA را پیشبینی کند، در مقابل آن عدد 1 و در غیر این صورت عدد صفر داده میشود که با جمع این اعداد عدد نهایی 11 به میانکش بین mRNA-miRNA داده میشود که نشاندهنده تعداد پایگاههایی است که امکان انجام آن میانکنش را پیشبینی کردهاند. هم چنین با بررسی در پایگاه داده TargetScan به آدرس http://www. targetscan.org/vert_71/ به بررسی ژنهای پیشبینیشده میکروRNA مورد نظر میپردازیم. بر اساس امتیازهای داده شده هر چه اعداد منفیتر باشند، امتیاز ارزش بیشتری دارد. بر این اساس از ژنهای کاندید، یک جدول امتیاز تهیه میشود. در ادامه با مراجعه به سایت miRTarBase ، ژنهای هدف ارزیابیشده را جستجو کرده و با لیست قبلی مقایسه شد. در مرحله بعد ژنهای هدف هم در بافت سالم هم در بافت سرطانی در سایت UniGene چک شده و با مراجعه به پروفایل بیانی، آنهایی را که دارای امتیاز ۲۰ یا بیشتر هستند انتخاب نموده و سپس در پایگاه بررسی مولکولی، مسیرهای سیگنالی به نام DAVID وارد شدند. پایگاه داده DAVID چندین مسیر سیگنالینگ KEGG را در اختیار ما مـیگذارد. شکل ۴ نمای کلی از مسیرهای سیگنالینگ به دست آمده از پایگاه DAVID و ژنهای هدف miR-146a را نشان میدهد.
جدول 1: فهرستی از پایگاههای اطلاعاتی مربوط به پیشبینی ژنهای هدف
Method
ویژگی نرمافزار مورد استفاده در سایت
آدرس سایت اینترنتی
TargetScan
پایگاه اطلاعاتی ژنهای هدف mirRNA ها در مهرهداران که در ناحیه 5' حفظ شدهاند
http://genes.mit.edu/tscan/ targetscanS2005.html
Phenomi
فراهم آوردن اطلاعات در مورد بیان متفاوت microRNA در بیماریها و دیگر فرآیندهای بیولوژیکی
http://mips.helmholtz-muenchen.de/phenomir/
miRwalk2/0
میانکش مهاری بر روی تنظیمکنندههای مثبت و منفی تمایز سلولهای سرطانی صورت گرفته
عملکرد زیستی و ارتباطات تنظیمی را بین گروهی از microRNA های شناخته شده و ژنهای کدکننده پروتئین تعیین میکند
http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/
UniGene
بررسی ژنهای هدف هم در بافت سالم هم در بافت سرطانی و بررسی پروفایل بیانی آنها
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene
DAVID
بررسی مولکولی مسیرهای سیگنالی KEGG
https://david.ncifcrf.gov/
شکل ۴: نمای کلی از مسیرهای سیگنالینگ به دست آمده از پایگاه DAVID و ژنهای هدف miR-146a که با علامت ستاره مشخصشده است. - تصویر برگرفته شده از پایگاه دادهDAVID به آدرس https://david.ncifcrf.gov)/(
یافتهها شناسایی miR-146a بهعنوان عامل اثرگذار در سرطان معده وابسته به هلیکوباکترپیلوری: یافتههای به دست آمده از پایگاه داده miRWalk2/0 و مسیرهای سیگنالینگ به دست آمده از مسیر DAVID نشان داد که تغییر در بیان miR-146a ناشی از عفونت هلیکوباکترپیلوری میتواند با تأثیر بر پروتئینهای هدف خود در طی سیکل سلولی، سلول را از مسیر اصلی خود منحرف کرده و باعث پیشرفت سلول در مسیر توقف مرگ سلولی، افزایش رگ زایی و متاستاز شود. در جدول ۲ نمونهای از امتیازات داده شده به ژنهای هدف miR-146a طبق پایگاه داده miRWalk2/0 گزارش شده است. هم چنین در جدول ۳ مسیرهای به دست آمده از پایگاه داده DAVID و p-value آن نشان داده شده است. نکته قابلتوجه در مورد این miRNA این است که اولین بار به عنوان یکتنظیمکنندسیستمایمنیبدنکشف شدکهپاسخپستاندارانبهعفونتهایباکتریایی را تحت تأثیر قرار میداد، هم چنین تغییر بیان این miRNA در مراحل اولیه سرطان معده قابلتشخیص است.
مطالعه مکانیسم تأثیرگذاری miR-146a : بررسیهای بیوانفورماتیکی صورت گرفته نشان داد که miR-146a اثر خود را از طریق تأثیر بر پروتئینهای P53 و BCL-XL که در فرآیند مرگ سلولی ایفای نقش میکنند، اعمال میکند. miR-146aبا هدف قرار دادن ژنهای pro-apoptotic موجب کارکرد anti-apoptotic میشود، هم چنین با تحریـک تکثیر سلولی سبب مهار آپوپتوز میشوند. طی سرطانی شدن سلولهای بافت معده و کلونیزاسیون هلیکوباکترپیلوری در آن، شاهد موتاسیون در ژن P53 که یک تنظیمکننده چرخه و یکی از ژنهای بازدارنده توموری است که در اکثر سرطانهای انسانی دچار جهش میشود هستیم(37). هلیکوباکترپیلوری هم چنین با فعالسازی پروتئین ERK1 (از اعضای MAPK سیگنالینگ) از طریق ژن cagA نقش خود را ضد فرآیند آپوپتوز سلولهای اپیتلیال معده از طریق بیان ژن BCL2 ایفا میکند(39). نتایج به دستآمده حاکی از آن است که miR-146a بـا اتصال به mRNA ژن Rho که جزو پروتئینهایی است که طی سرطانی شدن سلولها دچار جهش میشود، باعث از دست رفتن قطبیت سلول شده و در مرحله بعد از آن شاهد حمله سلولهای توموری به نقاط دیگر به دلیل از بین بردن پروتئینهای چسبندگی هستیم(41، 40). پس از این که بیان miR-146a دچار تغییر شد، با تأثیر بر پروتئین COX2 که از جمله پروتئینهای مهم در فرآیند رگزایی است، مانع هیپوکسی سلولهای توموری میشود، به بیان دیگر وظیفه اکسیژنرسانی به بافت سرطانی برای پیشرفت آن را ایفا میکند.
جدول 2: احتمال میانکنش میان mRNA-miRNA بر اساس پایگاه داده miRWalk 2/0
Data base
P53
BCL2
Rho
COX2
STAT3
miRWalk2/0
8
9
8
9
10
جدول 3: مسیرهای سیگنالینگ به دست آمده از پایگاه داده DAVID و p-value* آنها برگرفته شده از مسیر DAVID
KEGG Pathway
p-Value*
1
Pathway in cancer
6-10 * 1/4
2
JAK-STAT signaling pathway
2-10 * 6/1
3
Adherence junction
3-10 * 3/1
4
TGFß signaling pathway
2-10 * 6/6
در پایگاه miRWalk2/0 در صورتیکه هر یک از ۱۲ پایگاه بیوانفورماتیکی احتمال مهار یک mRNA به خصوص توسط یک miRNA خاص را پیشبینی کند، در مقابل آن عدد ۱ و در غیر این صورت عدد ۰ داده میشود. در نهایت با جمع این اعداد امتیاز نهایی گزارش میشود که نشاندهنده تعداد پایگاههایی است که امکان انجام آن میانکنش را پیشبینی کردهاند و پیشبینیکننـده تاثیر مهاری miRNA بر روی mRNA هدف هستند.
بحث یافتههـای حاصـل از ایـن مطالعه نشاندهنده چگونگی تأثیر miR-146a در مسیرهای داخل سلولی از جمله رگزایی، تأخیر در مرگ سلولی و کاهش چسبندگی سلول بر پروتئینهای این مسیرها هستند که به تبع آن منجر به پیشرفت سرطان معده میشوند. سرطان معده یکی از سرطانهایی است که در چندین سال اخیر در کشور ما و به خصوص در اصفهان و مناطق شمال غرب کشورمان شیوع بالایی پیداکرده است و آلودگی به هلیکوباکتر پیلوری نیز در کشورمان مشاهده میشود که آلودگی به این باکتری خود یک فاکتور خطر سرطان معده محسوب میشود. از آن جا که در سالهای اخیر miRNAs به عنوان ابزارها و هدفهای درمانی و یا بیومارکر بیماریها و سرطانهای مختلف معرفیشدهاند؛ انجام مطالعهها در این زمینه میتواند به عنوان مطالعههای پایهای در جهت مشخص شدن بهتر شبکه سرطان و miRNAs دخیل در ایجاد سرطان و درنتیجه کشف هدفهای درمانی مناسب و استفاده از آن در علم فارماکوژنومیک به منظور مهار یا شناسایی مسیرهای سرطانی و کشف بیومارکرهایی که بتوانند نشاندهنده فعالیت سرطان باشند، حائز اهمیت است. مطالعهها نشان میدهد که پیشبینیهای بیوانفورماتیک در این مطالعه با تحقیقاتی که تاکنون انجام شده مطابقت دارد. یافتههای حاصل از این پژوهش حاکی از آن است که بررسیهای بیوانفورماتیکی و استفاده از پایگاههای داده معتبری چون 0/2 miRWalk و DAVID و دستیابی به پروتئینهایی که نقش به سزایی در اعمال نقش miR-146a به عنوان آنکوژن دارند و چرخه سلولی را از مسیر طبیعی خود منحرف کرده و به سمت سرطانی شدن سوق میدهند، میتواند این miR-146a را به عنوان یک بیومارکر در پیشگیری و تشخیص سرطان معده معرفی کند. طی تحقیقی که در سال ۲۰۱۲ توسط مو و همکاران انجام گرفت به بررسی تعداد زیادی از میکروRNA های دخیل در سرطانهای مختلف پرداختند و نقش آنها را به عنـوان مارکرهای زیستی و درمان مورد بررسی قراردادند (56). نقویان و همکاران در سال ۲۰۱۵ به بررسی miR-141 و miR-200 در بیماری مولتیپل اسکلروزیس با روشRT-q PCR و هم چنین بررسیهای بیوانفورماتیکی پرداختند(28). هم چنین هنردوست و همکاران در سال ۲۰۱۴ با استفاده از روش Real Time PCR و استفاده از دادههای بیوانفورماتیکی، miR-326 و miR-26a را به عنوان دو نشانگر بالقوه برای تشخیص فاز عود و بهبود در بیماران مبتلا به مولتیپل اسکلروزیس معرفی کردند(29). سلیمی و همکاران و هم چنین ذبیحی و همکاران در سال ۲۰۱۶ به بررسی رابطه بین پلیمورفیسمها به عنوان فاکتور خطر در سرطان سینه در جمعیت اصفهان با استفاده از روشهای مولکولی و هم چنین بررسیهای بیوانفورماتیکی پرداختند(58، 57(. از طرفی دیگر تا به حال بررسی بیان این اجزا در سرطان معده در کشور ما انجام نشده و الگوی آن مشخص نیست. لذا بررسی این اجزا ضروری است. هم چنین شناسایی ژنهای هدف miR-146a با استفاده از مطالعههای بیوانفورماتیک برای استفاده از این اهداف ژنی برای درمان نیز ضروری است. مطالعهها نشان میدهد که پیشبینیهای بیوانفورماتیکی انجام شده در این مطالعه با مطالعههای قبلی انجام شده مطابقت دارد. لی و همکاران در سال ۲۰۱۰ و لیوات در سال ۲۰۰۹ نشان دادند که بیان miR-146a در افراد مبتلابه سرطان معده وابسته به هلیکوباکتر پیلوری افزایش مییابد(60، 59). در مطالعهای که در سال ۲۰۱۵ توسط مین و همکاران صورت گرفت اذعان داشتند که افزایش بیان miR-146a در سرطان دهان، سبب پیشرفت این بیماری هم در انسان و هم در مدل موش میشود(61). فلاح و همکاران نقش این عناصر را در ردههای سلولی خونساز بررسی کردند و بیان داشتند که افزایش القای بیان miR-146a توانایی تمایز به سمت سلولهای T را دارند (62). هم چنین کاظمزاده و همکاران به بررسی نقش miR-146a در مالتیپل میلوما پرداختند و نشان دادند که miR-146a میتواند به عنوان یک سرکوبگر تومور در لکوسیتها عمل کند و کاهش بیان آن در سلولهای میلومایی در پیدایش و یا پیشرفت مالتیپل میلوما مؤثر است(63). نور محمد و همکاران در سال ۲۰۱۴ به رابطه بین بیان miR-222 در سرطان معده با استفاده از مطالعههای بیوانفورماتیکی پرداختند و به مسیرهای داخل سلولی القا شده توسط این میکروRNA اشاره کردند(64). علاوه بر عوامل باکتریایی که سبب پیشرفت بیماری میشود، یک سری از عوامل میزبان نیز سبب پیشرفت سرطان میشود. جاتنر و همکاران در سال ۲۰۰۳ نشان دادند ژن COX آنزیم کلیدی در ساخت پروستاگلاندین است و تولید آن در سلولهای اپیتلیال آلوده به هلیکوباکتر پیلوری افزایش مییابد که به عنوان یک فاکتور خطر و عامل پیشرفت بیماری محسوب میشود(65). بلاسکونویچ و همکاران نشان دادند که فعالیت STAT3 سبب دگرگونی سلولی میشود که نتیجه آن مهار آپوپتوز و افزایش شمار رگ زایی سلولها است و مطالعههای به دستآمده از تاثیر miR-146a را تایید میکند(66). طی بررسیهای بیوانفورماتیکی انجام شده در مسیر آپوپتوز ژنهای BCL2 ، P53 و Rho به عنوان ژن هدف miR-146a معرفی شدند که با مطالعههای قبلی انجام شده مطابقت دارد. چوی و همکاران در سال ۲۰۰۲ نشان دادند هلیکوباکتر پیلوری با فعالسازی پروتئین ERK1 (از اعضای MAPK سیگنالینگ) از طریق ژن cagA نقش خود را ضد فرآیند آپوپتوز سلولهای اپیتلیال معده از طریق بیان ژن BCL2 ایفا میکند(67). در زمینه بررسی متیلاسیون ای- کادهرین در جمعیت ایرانـی و توسط محققین ایرانی، تاکنون ۳ مطالعه مشابه در سرطانهـای اســپورادیک روده بــزرگ، پــستان و کارســینومای ســلولهــای سنگفرشی دهان انجام شده است. کردی و همکاران در سال ۲۰۱۰ بررسی متیلاسیون برای ژن ای-کادهرین در مبـتلایان بـه سـرطان کارسـینومای سلولهای سنگفرشی بافت دهـان را تایید کردند(68). شرق و همکاران در سال ۲۰۱۱ متیلاسیون ژن ای- کادهرین در بیماران مبتلابه سرطان پستان را در جمعیت تبریز به اثبات
رسانیدند که با بررسیهای بیوانفورماتیکی انجامشده در ارتباط با سرطان معده وابسته به هلیکوباکتر پیلوری القاشده توسط miR-146a ، مطابقت دارد(69). با توجه به روند رو به رشد سرطان معده در ایران و هم چنین در استان اصفهان، امید است یافتهها و نتایج به دست آمده از این تحقیق، راهکاری برای فراهم آوردن پیشگیری و درمان این بیماری و هم چنین بازگشایی مسیری جهت تحقیقات آتی پژوهشگران باشد. پیشنهادها جهت بررسی بیشتر در مورد بررسی ژنهای هدف miR-146a در شرایط آزمایشگاهی و شرایط داخل بدن و هم چنین بررسی سطح بیان miR-146a و نیز اهداف احتمالی آن درروند تمایز سلولهای سرطانی در شرایط آزمایشگاه، تحقیقات بیشتر برای دستیابی به رابطهای بین بیان ژن miR-146a و مراحل مختلف سرطان معده و همچنین تحقیقات برای دستیابی به داروهای مهارکننده ژنهای هدف miR-146a ازجمله پیشنهادها برای تحقیقات آینده، پیش رو است.
نتیجهگیری با توجه به نتایج به دست آمده میتوان گفت که افزایش بیان miR-146a با تحریک پروتئینهایی مانند P53STAT3، Rhoو COXسلول را از مسیر بیولوژیک طبیعی خود خارج کرده به سمت پیشرفت سرطان سوق میدهد. از این رو میتوان از این میکروRNA به عنوان پتانسیل دارویی و بیومارکر تائیدی تشخیصی در سرطان معده برای پیشگیری و درمان استفاده کرد.
Adami B, Ghaedi K, Talebi A. In silico studies revealed a crucial role for miR-146a on progression of Helicobacter pylori induced gastric cancer . Sci J Iran Blood Transfus Organ 2017; 14 (1) :65-76 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1067-fa.html
آدمی بهاره، قائدی کامران، طالبی اردشیر. احتمال نقش تنظیمی miR-146a بر ژنهای دخیل در مسیرهای داخل سلولی سرطان معده القا شده توسط هلیکوباکتر پیلوری بر اساس یافتههای بیوانفورماتیکی. فصلنامه پژوهشی خون. 1396; 14 (1) :65-76