جلد 13، شماره 4 - ( زمستان 1395 )
جلد 13 شماره 4 صفحات 323-314 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Zarei M, Bashash D. Induction of G1 Cell Cycle Arrest and Increased Sub-G1 Population upon Treatment of Nalm-6 Cells with Synthetic Inhibitor of hTERT. bloodj 2016; 13 (4) :314-323
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1019-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1019-fa.html
زارعی محدثه، بشاش داوود. القاء توقف چرخه سلولی در مرحله G1 و افزایش درصد Sub-G1 متعاقب تیمار سلولهای Nalm-6 با مهارکننده سنتتیک hTERT. فصلنامه پژوهشی خون. 1395; 13 (4) :314-323
میدان قدس ـ خیابان دربند ـ تهران ـ ایران ـ کدپستی: 1971653312
متن کامل [PDF 527 kb]
(3298 دریافت)
| چکیده (HTML) (5756 مشاهده)
مقدمه
لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL)، شایعترین سرطان دوران کودکی بوده و حدود 30% از سرطانهای این دوران را به خود اختصاص میدهد. هر چند بیشترین شیوع ALL مربوط به سنین 2 تا 5 سال میباشد، با این حال، احتمال ابتلا به این لوسمی در افراد جوان و مسن نیز وجود دارد(1). علیرغم میزان بالای پاسخ به درمان در این بیماری، مقاومت به درمانهای متداول و عود بیماری، هم چنان به عنوان یک معضل مهم مطرح است(2). بدیهی است که درک کامل مکانیسمهایی که سبب مقاومت در برابر داروهای شیمیدرمانی میشوند، میتوانند سبب معرفی درمانهای جدید در این بیماری شود(3). اگر چه ماهیت کلینیکی سرطانها بسیار هتروژن میباشد، اما اکثر تومورها در تعداد محدودی از ویژگیها هم چون توانایی تکثیر نامحدود، رشد غیر قابل کنترل، تهاجم به بافتها و انتشار متاستاتیک مشترک هستند(4). بسیاری از مطالعه‌ها نشان دادهاند که کسب توانایی تکثیر نامحدود در سلولهای سرطانی که عمدتاً ناشی از فعالیت آنزیم تلومراز است، مهمترین مرحله در پیشرفت سرطان میباشد(5). تلومراز، آنزیمی است که بعد از همانندسازی فعال شده و باعث افزودن تعداد نسبتاً زیادی نوکلئوتید به انتهای کروموزومها میشود. این آنزیم که یک کمپلکس چند پروتئینی با ساختار ریبونوکلئوپروتئین است، دارای فعالیت ترانس کریپتاز معکوس(RT) بوده و قادر است از رویRNA ، مولکول DNAتولید کند(8-6). مشخص شده است که آنزیم تلومراز در 90% از بدخیمیها افزایش بیان دارد، این در حالی است که در سلولهای نرمال این آنزیم بیان نشده و غیرفعال میباشد. مطالعه‌های بسیاری نشان میدهد که هدف قرار دادن فعالیت تلومراز در بسیاری از تومورها سبب تداخل در عملکرد تلومر و در نتیجه مرگ سلولی میشود(9)؛ از این رو میتوان از مهارکنندههای تلومراز به عنوان اهداف درمانی امیدوار کننده در مهار رشد و تکثیر سرطان بهره جست.
در میان این دسته از داروها، BIBR1532 به عنوان مهارکننده اختصاصی hTERT توجه ویژهای را به خود اختصاص داده است(10). مطالعه‌ها نشان دادهاند که مهار تلومراز با استفاده از BIBR1532 در بسیاری از سلولهای سرطانی هم چون پروستات، پستان، ریه و فیبروسارکوما منجر به کاهش طول تلومر و القاء مرگ سلولی میشود(11). هم چنین اثر سایتوتوکسیک مستقیم این دارو در کوتاه مدت، بدون تاثیر بر سلولهای نرمال، بر روی سلولهای لوسمی میلوئیدی حاد و لوسمی لنفوئیدی مزمن نیز به صورت وابسته به دوز و زمان نشان داده شده است(12). نتایج حاصل از مطالعه اخیر توسط شی و همکاران نشان داد که استفاده از این دارو در سرطان سینه سبب القاء آپوپتوز از طریق مهار تلومر و توقف چرخه سلولی در مرحله G1 میشود(13). با توجه به این که مشخص شده است که بیان آنزیم تلومراز در مبتلایان به ALL افزایش دارد، لذا در این مطالعه بر آن شدیم تا کارآیی استراتژی مبتنی بر استفاده از داروهای آنتیتلومراز را در رده سلولی Nalm-6 (Pre-B ALL cell) بررسی کنیم.
مواد و روش‌ها
کشت سلولی و تیمار دارویی:
در این مطالعه تجربی، سلولهای Nalm-6 (سلولهای رده لوسمی لنفوبلاستیک حاد) به صورت سوسپانسیون در محیط کشت RPMI1640 حاوی 2 میلیمولار از ال-گلوتامین، 10%FBS ، پنیسیلین به میزان U/mL100 و استرپتومایسین به میزان µg/mL 100 در دمای 37 درجه سانتیگراد و فشار 5% از CO2کشت داده شدند. برای تیمار دارویی سلولها از داروی BIBR1532 (آمریکا-بیوسانس) که به صورت پودر میباشد، استفاده شد. محلول ذخیره BIBR1532 در غلظت mM1 و به واسطه حل کردن این دارو در DMSOاستریل تهیه شد. محلول ذخیره را در میکروتیوبها تقسیم کرده و آن‌ها را در دمای20- درجه سانتیگراد تا زمان مصرف نگهداری کردیم. به منظور تعیین اثرات بهینه BIBR1532 ، دو متغیر دوز و زمان در نظر گرفته شد؛ بدین ترتیب که سلولهای سرطانی Nalm-6 با غلظتهای 10، 30 و 60 میکرومولار از دارو طی مدت زمانهای 24، 36 و 48 ساعت تیمار شدند. در این مطالعه، سلولهای تیمار نشده با دارو به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شده است. در ضمن به منظور افزایش بهرهوری کار و بررسی مقایسهای، تمامی آزمایشها برای هر دوز و زمان به صورت تریپلیکیت انجام شد.
اندازهگیری فعالیت متابولیک سلولی:
برای بررسی اثر مهاری داروی BIBR1532 بر روی فعالیت متابولیک سلولی، تعداد 10000 سلول در هر میلیلیتر در حضور یا عدم حضور دارو به مدت 24، 36 و 48 ساعت انکوبه شدند.
بعد از اتمام زمان تیمار، محلول MTT در غلظت mg/mL5 به سلولهای درون چاهکهای پلیت 96 خانه اضافه شد و به مدت 3 ساعت دیگر در 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از طی زمان انکوباسیون، پلیت حاوی سلولها با دور g 1000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی چاهکها خالی گردید و 100 میکرولیتر محلول DMSO به هر چاهک اضافه شد. در ادامه، جذب نوری نمونهها در طول موج 570 نانومتر اندازهگیری شد.
بررسی میزان ساخت DNA :
اثر مهاری BIBR1532بر روی تکثیر سلولهای Nalm-6 از طریق تعیین میزان مشارکت برموداکسی‌یوریدین در DNA سلولهای Nalm-6 با استفاده از BrdU-based cell proliferation ELISA kit طبق دستورالعمل کیت اندازهگیری شد. به طور خلاصه، تعداد 5000 سلول در هر چاهک درون پلیت 96 تایی در حضور یا عدم حضور BIBR1532 کشت داده شدند. 12 ساعت مانده به انتهای زمان انکوباسیون، 10 میکرولیتر محلول BrdU که در کیت موجود میباشد، به سلولها افزوده شد؛ در ادامه و با استفاده از محلول FixDenat ، سلولها فیکس شده و DNA آن‌ها دناتوره گشت. سلولها با آنتیبادی علیه BrdU که با آنزیم پراکسیداز کنژوگه میباشد، به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شده و در انتهای این زمان، 100 میکرولیتر سوبسترای TMB افزوده شد. پس از گذشت 30 دقیقه در دمای اتاق و آن هم به منظور پایان دادن به عملکرد آنزیم پراکسیداز، از محلول اسید سولفوریک 1 مولار استفاده شد. در انتها، میزان رنگ ایجاد شده در هر چاهک با استفاده از دستگاه الایزا ریدر در طول موج nm 450 خوانده شد. در نهایت و برای محاسبه اثر مهاریBIBR1532 بر روی تکثیر و بررسی میزان کاهش ساخت DNA سلولهای Nalm-6 تیمار شده از فرمول زیر استفاده شد:
در این فرمول، OD exp و OD contبه ترتیب بیانگر جذب نوری سلولهای تیمار شده و سلولهای تیمار نشده (کنترل) میباشد.
استخراج RNA و ساخت cDNA:
برای استخراج RNA از محلول TriPure Isolation (رُوش) Reagent طبق دستورالعمل کیت استفاده شد. پس از تیمار سلولهای Nalm-6 با BIBR1532 و متعاقب گذشت 24 ساعت، RNA سلولها استخراج و کمیت آن‌ها با روش اسپکتروفتومتری با استفاده از دستگاه Nanodrop ND-1000 اندازهگیری شد. در ادامه کار، برای انجام واکنش رونویسی معکوس و جهت ساخت cDNA از (فرمنتاز) RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit استفاده شد.
حجم مورد نظر برای انجام این واکنش µL 20 بود و محتویـات آن شامـل µL4 از بافر PCR 5X، µL2 از dNTP ، µL1 از راندم هگزامر، µL1 آب تیمار شده با DEPC ، µL1 مهار کننده RNase (U/µL 20)، µL 1 ترانـس کریپتاز معکوس M-MULV( U/µL200) و µg 1 از RNA مـورد آزمـایـش بـه ازای هـر واکنـش مـیباشد.
محتوی مذکور به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد، 5 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد و 1 ساعت در دمای 42 درجه سانتیگراد انکوبه شد و در نهایت، واکنش ساخت cDNA به واسطه انکوباسیون 5 دقیقهای در دمای 70 درجه سانتیگراد پایان پذیرفت. cDNA ساخته شده در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
جدول 1: توالی آغازگرهای مورد استفاده در آزمایش Real-time PCR
اندازهگیری کمی بیان ژنها با روش Real-time PCR :
آزمایش Real-time PCR در دستگاه Light-cycler (رُوش) و در حجم 20 میکرولیتر انجام شد. به ازای هر واکنش، µL 10 از SYBR Premix Ex Taq (تاکارا)، µL 2 از cDNA ، µL 5/0 از هریک از آغازگرها(pmol 10) و µL 7 آب عاری از نوکلئاز استفاده شد. شرایط دمایی مورد استفاده شامل یک مرحله فعالسازی اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه و در ادامه، 45 چرخه برای دناتوراسیون (5 ثانیه در 95 درجه سانتیگراد) و آنیلینگ/اکستنشن توام (20 ثانیه در 60 درجه سانتیگراد) میباشد. برای بررسی اختصاصیت محصول تکثیر شده، منحنی ذوب مورد بررسی قرار گرفت. همزمان HPRT (هایپوگزانتین گوانین فسفوریبوزیل ترانسفراز) برای نرمالیزه کردن بیان ژنها مورد استفاده قرار گرفت. در انتها و برای محاسبه نسبی تعداد نسخه mRNA تکثیر شده از فرمول –êêct 2 استفاده شد(جدول 1).
بررسی فعالیت چرخه سلولی:
ابتدا تعداد 106 سلول به همراه 2 میلیلیتر محیط کشت RPMI1640 حاوی 10% FBS ، در چاهکهای پلیت 6 خانهای ریخته شد. در ادامه، سلولها با دوزهای 10، 30 و 60 میکرومولار از داروی BIBR1532 تیمار و به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. پس از پایان انکوباسیون، سلولها را با دور rpm/min2000 سانتریفیوژ کرده و در محلول PBS معلق نمودیم. سپس سلولها به وسیله اتانول 70% تثبیت شدند و در ادامه پس از افزودن mL1 محلول PI master mix که حاوی µL 950 از PBS وµL 40 از معرف PI میباشد، به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. در نهایت، الگوی رنگپذیری DNAبا استفاده از دستگاه فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفته و دادهها با استفاده از نرم افزار WINMDIآنالیز شدند.
آنالیز آماری:
برای تجزیه و تحلیل دادهها از نرم افزار آماری SPSS نسخه 18 استفاده شد. اختلاف معنادار بین متغیرهای آزمایش با استفاده از آزمون t دو دامنه تعیین شد. هم چنین به منظور مقایسه بین گروه کنترل و نمونههای آزمایش شده از آزمون دانت استفاده گردید. مقادیر 05/0 p< از نظر آماری معنادار در نظر گرفته شده است.
یافته‌ها
BIBR1532 به صورت وابسته به دوز و زمان باعث کاهش فعالیت متابولیک سلولهای Nalm-6 میشود:
به منظور بررسی اثر BIBR1532 بر فعالیت متابولیک سلولهای Nalm-6 از روش MTT استفاده شد. طی بررسیهای صورت گرفته بر روی سلولهای تیمار شده، در زمانهای 24، 36 و 48 ساعت مشخص گردید که داروی BIBR1532 سبب کاهش فعالیت متابولیکی سلولهای تیمار شده نسبت به سلولهای تیمار نشده (کنترل) میشود. در سلولهای تیمار شده، با افزایش غلظت داروی BIBR1532 فعالیت متابولیک سلولها به صورت وابسته به دوز کاهش مییابد. هم چنین نتایج به دست آمده نشان داد که با افزایش زمان مواجهه سلولها با دارو نیز میزان تاثیرگذاری سایتوتوکسیک این مهارکننده تشدید میشود. غلظت µM10 دارو اثر چشمگیری در کاهش فعالیت متابولیکی سلولهای Nalm-6 ندارد، این در حالی است که دوز µM30 از دارو طی مدت زمان 24، 36 و 48 ساعت به ترتیب این شاخص را به 90%، 84% و 78% کاهش میدهد(نمودار 1). هم چنین با افزایش غلظت دارو به µM60 شاهد کاهش بیشتر فعالیت متابولیک به ترتیب به میزان 81%، 73% و 63% در زمانهای ذکر شده بودیم. با توجه به نتایج به دست آمده میتوان نتیجه گرفت که داروی BIBR1532 هم به طور وابسته به دوز و هم به طور وابسته به زمان سبب مهار فعالیت متابولیکی سلولهای Nalm-6 میشود.
نمودار 1: بررسی اثر BIBR1532 بر فعالیت متابولیک سلولهای Nalm-6 به طور وابسته به دوز و زمان. سلولهای Nalm-6 در تعداد 10000 سلول در پلیت 96 خانهای تحت تأثیر مقادیر مختلف BIBR1532 قرار گرفته و به مدت 24، 36 و 48 ساعت انکوبه شدند. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از سه ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه و p value به دستآمده(* ، بیانگر 05/0 p< و و **، بیانگر 01/0 p<) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل بود.
BIBR1532 به طور وابسته به دوز و زمان سبب کاهش ساخت DNA میشود:
به منظور بررسی اثر آنتیپرولیفراتیو داروی BIBR1532
بر روی سلولهای لوسمی لنفوبلاستیک حاد Nalm-6 ، از آزمون BrdU استفاده شد. طی بررسیهای وابسته به دوز در زمانهای 24 و 48 ساعت پس از تیمار سلولها با داروی BIBR1532 بر روی سلولهای Nalm-6 ، مشخص گردید که این دارو هم به طور وابسته به دوز و هم وابسته به زمان سبب مهار تکثیر سلولهای Nalm-6 میگردد. در غلظت µM 30 از دارو، میزان ساخت DNA و تکثیر سلولها در زمانهای 24 و 48 ساعت به ترتیب 7 و 15 درصد کاهش یافت(نمودار 2). در همین راستا، به ترتیب کاهش 21 و 23 درصدی میزان ساخت DNA در غلظت µM60 در زمانهای مذکور، بیانگر اثر آنتیپرولیفراتیو وابسته به دوز و زمان دارو میباشد(نمودار 2). با توجه به نتایج به دست آمده میتوان نتیجه گرفت که BIBR1532 علاوه بر اعمال اثر سایتوتوکسیک مشخص شده در آزمون MTT ، دارای خاصیت آنتیپرولیفراتیو نیز است.
نمودار2: اثر داروی BIBR1532 بر روی ساخت DNA در رده سلولی Nalm-6 به طور وابسته به دوز و زمان. سلولهای Nalm-6 در تعداد 5000 سلول در پلیت 96 خانهای تحت تأثیر مقادیر مختلف BIBR1532 قرار گرفته و به مدت 24 و 48 ساعت انکوبه شدند. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از سه ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه و p value به دستآمده (*، بیانگر 05/0 p<) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل بود.
BIBR1532 موجب توقف چرخه سلولی در مرحله G1 و افزایش جمعیت سلولی در Sub-G1 میشود:
برای تعیین این که آیا اثر مهاری داروی BIBR1532 میتواند منسوب به تغییرات در چرخه سلولی باشد، سلولهای Nalm-6 با دوزهای µM10، µM30 و µM 60 برای 24 ساعت تیمار داده شده و با استفاده از روش فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج به دست آمده نشان داد که در سلولهای Nalm-6 افزایش غلظت BIBR1532 موجب افزایش مختصر درصد سلولها در مرحله G1 میشود(نمودار 3). بدین ترتیب که درصد سلولها در مرحله G1در گروه کنترل 30% و در دوزهای µM10 ، µM30 و µM60 طی تیمار 24 ساعته به ترتیب 32% ، 37% و 43% میباشد. هم چنین، نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که دوز µM60 از دارو سبب کاهش معنادار جمعیت سلولی در مرحله G2/M نیز میشود؛ به طوری که تیمار 24 ساعته سلولها با کاهش 50 درصدی سلولهای این مرحله نسبت به جمعیت سلولی فاز G2/M در گروه کنترل همراه میباشد.
نمودار 3: BIBR1532 سبب توقف چرخه سلولی در مرحله G1 و کاهش جمعیت سلولی G2/Mمیشود. افزایش درصد سلولهای Nalm-6 در مرحله G1 و هم چنین کاهش معنادار جمعیت سلولهای مرحله G2/M طی تیمار 24 ساعته با داروی BIBR1532 نشاندهنده اعمال اثر مهاری دارو در الگوی چرخه سلولی میباشد. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از سه ران کاری مختلف (mean ± SD) محاسبه و p value به دستآمده (*، بیانگر 05/0 p< و **، بیانگر 01/0 p<) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل بود.
علاوه بر این، درصد سلولهای وارد شده به مرحله Sub-G1 که بیانگر سلولهای آپوپتوتیک است نیز به طور قابل توجه و آن هم به طور وابسته به دوز افزایش یافته است(نمودار 4). با توجه به نتایج به دست آمده میتوان نتیجه گرفت که اثرات مهاری اعمال شده توسط داروی BIBR1532 در رده سلولی Nalm-6 احتمالاً از طریق فعال کردن مسیر آپوپتوتیک میباشد.
نمودار 4:BIBR1532 جمعیت سلولی Sub- G1 را افزایش میدهد. افزایش این پیک به منزله افزایش آپوپتوز در سلولها تلقی شده و میتوان نتیجه گرفت که داروی BIBR1532 به طور وابسته به دوز سبب القاء آپوپتوز در سلولهای Nalm-6 میشود. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از سه ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه و p valueبه دست آمده(*، بیانگر 05/0 p< و **، بیانگر 01/0 p<) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل بود.
با افزایش غلظت BIBR1532 میزان رونویسی از ژنهای پروآپوپتوتیکBad ، Bax ، p73 و p21افزایش مییابد:
به منظور آن که بدانیم آیا اثر سایتوتوکسیک دارو از طریق فعال شدن مسیر آپوپتوز رخ میدهد، میزان فعالیت رونویـسی برخی از ژنهای پروآپوپتوتیک مهم هم چونBad ، Bax ،p73 و p21 اندازهگیری شد. تیمار سلولهای Nalm-6 با دوزهای 30 و 60 میکرومولار BIBR1532 طی مدت زمان 24 ساعت، به طور چشمگیری سبب افزایش بیان mRNA ژنهای p73 ، p21 ، Bad و Bax میشود(نمودار 5). نتایج حاصل نشان داد که غلظت 60 میکرومولار دارو سبب افزایش 5 برابری رونویسی از ژن p21 و هم چنین افزایش تقریباً 5/4 برابری mRNA ژنهای Bax و p73 شد. با توجه به نتایج دادهها میتوان نتیجه گرفت که داروی BIBR1532 به طور وابسته به دوز سبب افزایش بیان ژنهای پروآپوپتوتیک میشود.
نمودار 5: افزایش میزان رونویسی از ژنهای پروآپوپتوتیکBad ، Bax ، p73 و p21 طی تیمار با BIBR1532. سلولهای Nalm-6 با دوزهای معین از BIBR1532 ( µM30 و µM60) به مدت 24 ساعت تیمار شدند. در ادامه و بعد از استخراج RNA و ساخت cDNA ، میزان بیان mRNA هر یک از ژنها با استفاده از روش RQ-RT-PCR اندازهگیری شد. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از سه ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه و p value به دست آمده (*، بیانگر 05/0 p< و **، بیانگر 01/0 p<) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل بود.
بحث
مطالعه‌ها نشان داده است که p73 میتواند به ژنهای هدف p53 متصل شده و به واسطه فعال کردن برخی ژنهای پروآپوپتوتیک هدف مثل Bax و p21 ، سبب افزایش مرگ برنامهریزی شده در سلول شود(14). هم چنین مشخص شده است کهp21 خود نیز به عنوان یک کیناز مهارگر وابسته به چرخه سلولی، در هنگام القاء آسیب به DNA سلول افزایش یافته و سبب مهار چرخه سلولی در مرحله G1 میشود(16، 15). بـا تـوجه بـه ایـن نکتـه که تکثیر نامحدود سلولها، که عمدتـاً از طریـق حفظ طـول تلومر اتفاق میافتد، مشخصه اصلی بسیاری از سرطانها است، لذا امروزه هدف قرار دادن مکانیسمهای مسئول حفظ طول تلومر به عنوان یک هدف درمانی خاص مورد توجه وافر قرار گرفته است(5). در این مطالعه و برای ارزیابی اثر BIBR1532 در لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL) و هم چنین جهت درک مکانیسم دقیقی از سایتوتوکسیسیتی این دارو، سلولهای Nalm-6 مشتق از pre-B ALL با غلظتهای مختلف از این مهارکننده تیمار شد. بر اساس نتایج حاصل از این مطالعه مشخص گردید که بر خلاف دوز پایین دارو(µM 10) که طی گذشت مدت زمان کوتاه قادر به مهار رشد و کاهش درصد زندهمانی سلولها نمیباشد، دوزهـای بـالای دارو (≤ 30 میکرومولار) قادرند بر روی درصد زندهمانی و هم چنین قدرت تکثیر سلولها تاثیر مهاری قابل ملاحظهای بگذارند. مطالعه‌ها نشان دادهاند که مهار تلومراز با استفاده از داروی BIBR1532 در بسیاری از سلولهای سرطانی هم چون پستان، ریه، کندروسارکوما و لوسمی پرومیلوستیک حاد منجر به کاهش طول تلومر و القاء مرگ سلولی میشود(21-17). الدالی و همکارانش نیز مشخص کردند که اگر چه BIBR1532 دارای اثر آنتی پرولیفراتیو بر روی سلولهای بیماران مبتلا به AML و CLL و همین طور سل لاینهای مشتق شده از این بیماریها میباشد، اما بر روی سلولهای طبیعی هماتوپوئتیک هیچ اثر سایتوتوکسیکی نداشت(12).
نتایج حاصل از این مطالعه هم چنین نشان داد که BIBR1532 میتواند الگوی چرخه سلولی را در رده سلولی Nalm-6تغییر دهد؛ بدین ترتیب که افزایش جمعیت سلولی در فاز Sub-G1 متعاقب تیمار سلولها، بیانگر القاء آپوپتوز و کاهش سلولهای G2/M تائیدی بر اثر آنتیپرولیفراتیو دارو میباشد. شی و همکاران نیز نشان دادند که استفاده هم زمان از داروی BIBR1532 و Paclitaxel سبب افزایش آپوپتوز و کاهش پرولیفراسیون در سلولهای سرطانی سینه میشود؛ با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه نشان داده شد که استفاده ازBIBR1532 در سرطان سینه سبب القاء آپوپتوز از طریق مهار تلومر و تـوقف چرخه سلولی در مرحله G1 (مستقل از وضعیت ER ، HER-2 و (p53 میشود(13). هم چنین طی مطالعه‌های صورت گرفته بر روی سلولهای سرطانی اندومتریال مشخص شده است که این مهار کننده سبب القاء آپوپتوز و جلوگیری از متاستاز این سلولها نیز میشود(22).
در مـواقعـی که آسیب DNA شدید باشد، سلول آسیب
دیده از طریق راهاندازی مسیر آپوپتوز خود را تخریب می‌کند. تحقیقات صورت گرفته نشان میدهد p73 که از جمله اعضاء خانواده p53 میباشد، دارای نقش کلیدی در فعال کردن مرگ برنامهریزی سلولی میباشد(15). در واقع، متعاقب بروز آسیب DNA، فاکتور رونویسی p73 میتواند با اتصال به DNAبرخی از ژنهای پروآپوپتوتیک هم چون Bax و p21 سبب فعال شدن مسیر آپوپتوتیک در سلول شود(15، 10). بهعلاوه گزارش شده است که p73 میتواند با محدود کردن میزان رونویسی از ژن hTERT منجر به مهار فعالیت آنزیم تلومراز نیز گردد(16، 14). هم چنین p21 نیز که یک فاکتور رونویسی شناخته شده وابسته به p53 میباشد، میتواند با القاء توقف چرخه سلولی در مرحله G1و یا القاء آپوپتوز، مقدمات مربوط به ترمیم DNA و یا تخریب سلول آسیبدیده را فراهم آورد(23). مطابق با مطالب اشاره شده، نتایج به دست آمده از این مطالعه نیز حاکی از این است که توقف چرخه سلولی در مرحله G1و افزایش مقدار DNA در Sub-G1 با افزایش رونویسی از ژن پروتئینهای پروآپوپتوتیک هم چون p73 ، p21 ، Bax و Bad همراه میباشد. مشابه با نتایج به دست
آمده در این مطالعه، پارک نشان داد که استفاده از داروی BIBR1532 در سلولهای مقاوم به سیسپلاتین سبب مهار hTERT و در نتیجه افزایش بیان Bax ، آزاد شدن سیتوکروم C و در نهایت آپوپتوز میشود(24).
نتیجه‌گیری
با انجام این مطالعه مشخص شد داروی BIBR1532 سبب مهار فعالیت متابولیک و ساخت DNA به طور وابسته به دوز و زمان در سلولهای Nalm-6 میشود. هم چنین این دارو باعث افزایش بیان ژنهای p21 و p73 و متعاقب آن افزایش جمعیت سلولی در مرحله G1 و کاهش درصد سلولی در مرحله G2/M میشود. به علاوه جمعیت سلولی در پیک Sub-G1 که نشاندهنده آپوپتوز است، نیز افزایش یافت که این یافته با افزایش بیان ژنهای پروآپوپتوتیک Bax و Bad تأیید شد. با توجه به نتایج به دست آمده در این تحقیق، میتوان به افزوده شدن داروهای مبتنی بر استراتژی آنتیتلومرازی به رژیم درمانی بیماران لوسمیک به عنوان راهکار درمانی امیدبخش امیدوار بود.
متن کامل: (7074 مشاهده)
القاء توقف چرخه سلولی در مرحله G1 و افزایش درصد Sub-G1 متعاقب تیمار
سلولهای Nalm-6 با مهارکننده سنتتیک hTERT
محدثه زارعی1، داوود بشاش2
چکیده
سابقه و هدف
به دلیل نقش تلومراز در تکثیر نامحدود اکثر سلولهای سرطانی از جمله بدخیمیهای خونی، مهار تلومراز به عنوان روش مناسبی جهت درمان سرطانها مطرح میباشد. هدف از مطالعه، بررسی اثر BIBR1532 که یک مهارکننده سنتتیک hTERT میباشد، بر روی فعالیت متابولیک، میزان ساخت DNA ، تغییرات چرخه سلولی و بیان ژنهای p21، p73، Bax و Bad در سلولهایNalm-6 (رده سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد) بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه تجربی به منظور بررسی اثر BIBR1532 ، سلولها در حضور غلظتهای مختلف دارو کشت داده شدند و متعاقباً آزمونهای BrdU cell proliferation assay ، Microculture Tetrazolium Test،Flowcytometeric cell cycle arrest و Quantitative real-time انجام شد.
یافته‌ها
نتایج به دست آمده نشان داد که BIBR1532 دارای اثر مهاری بر فعالیت متابولیک و ساخت DNA سلولهای رده Nalm-6به طور وابسته به دوز و زمان میباشد. هم چنین نتایج حاکی از افزایـش بیـانmRNA ژنهایBad ، Bax ،p73 و p21 بود که خود متعاقباً با توقف چرخه سلولی در مرحله G1 و افزایش مرحله Sub-G1 همراه میباشد.
نتیجه گیری
از آن جایی که تیمار با داروی BIBR1532 در رده سلولی Nalm-6 سبب القاء توقف چرخه سلولی و فعال شدن مسیر آپوپتوز میگردد، لذا میتوان از افزوده شدن درمانهای مبتنی بر داروهای آنتیتلومراز به عنوان یک استراتژی جدید در درمان مبتلایان به لوسمی لنفوبلاستیک حاد بهره جست.
کلمات کلیدی: لوسمی لنفوبلاستیک حاد، BIBR1532 ، تلومراز
تاریخ دریافت : 14/11/94
تاریخ پذیرش : 17/6 /95
1- کارشناس ارشد خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ گروه هماتولوژی ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ گروه هماتولوژی ـ میدان قدس ـ خیابان دربند ـ تهران ـ ایران ـ کدپستی: 1971653312
سلولهای Nalm-6 با مهارکننده سنتتیک hTERT
محدثه زارعی1، داوود بشاش2
چکیده
سابقه و هدف
به دلیل نقش تلومراز در تکثیر نامحدود اکثر سلولهای سرطانی از جمله بدخیمیهای خونی، مهار تلومراز به عنوان روش مناسبی جهت درمان سرطانها مطرح میباشد. هدف از مطالعه، بررسی اثر BIBR1532 که یک مهارکننده سنتتیک hTERT میباشد، بر روی فعالیت متابولیک، میزان ساخت DNA ، تغییرات چرخه سلولی و بیان ژنهای p21، p73، Bax و Bad در سلولهایNalm-6 (رده سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد) بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه تجربی به منظور بررسی اثر BIBR1532 ، سلولها در حضور غلظتهای مختلف دارو کشت داده شدند و متعاقباً آزمونهای BrdU cell proliferation assay ، Microculture Tetrazolium Test،Flowcytometeric cell cycle arrest و Quantitative real-time انجام شد.
یافته‌ها
نتایج به دست آمده نشان داد که BIBR1532 دارای اثر مهاری بر فعالیت متابولیک و ساخت DNA سلولهای رده Nalm-6به طور وابسته به دوز و زمان میباشد. هم چنین نتایج حاکی از افزایـش بیـانmRNA ژنهایBad ، Bax ،p73 و p21 بود که خود متعاقباً با توقف چرخه سلولی در مرحله G1 و افزایش مرحله Sub-G1 همراه میباشد.
نتیجه گیری
از آن جایی که تیمار با داروی BIBR1532 در رده سلولی Nalm-6 سبب القاء توقف چرخه سلولی و فعال شدن مسیر آپوپتوز میگردد، لذا میتوان از افزوده شدن درمانهای مبتنی بر داروهای آنتیتلومراز به عنوان یک استراتژی جدید در درمان مبتلایان به لوسمی لنفوبلاستیک حاد بهره جست.
کلمات کلیدی: لوسمی لنفوبلاستیک حاد، BIBR1532 ، تلومراز
تاریخ دریافت : 14/11/94
تاریخ پذیرش : 17/6 /95
1- کارشناس ارشد خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ گروه هماتولوژی ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ گروه هماتولوژی ـ میدان قدس ـ خیابان دربند ـ تهران ـ ایران ـ کدپستی: 1971653312
مقدمه
لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL)، شایعترین سرطان دوران کودکی بوده و حدود 30% از سرطانهای این دوران را به خود اختصاص میدهد. هر چند بیشترین شیوع ALL مربوط به سنین 2 تا 5 سال میباشد، با این حال، احتمال ابتلا به این لوسمی در افراد جوان و مسن نیز وجود دارد(1). علیرغم میزان بالای پاسخ به درمان در این بیماری، مقاومت به درمانهای متداول و عود بیماری، هم چنان به عنوان یک معضل مهم مطرح است(2). بدیهی است که درک کامل مکانیسمهایی که سبب مقاومت در برابر داروهای شیمیدرمانی میشوند، میتوانند سبب معرفی درمانهای جدید در این بیماری شود(3). اگر چه ماهیت کلینیکی سرطانها بسیار هتروژن میباشد، اما اکثر تومورها در تعداد محدودی از ویژگیها هم چون توانایی تکثیر نامحدود، رشد غیر قابل کنترل، تهاجم به بافتها و انتشار متاستاتیک مشترک هستند(4). بسیاری از مطالعه‌ها نشان دادهاند که کسب توانایی تکثیر نامحدود در سلولهای سرطانی که عمدتاً ناشی از فعالیت آنزیم تلومراز است، مهمترین مرحله در پیشرفت سرطان میباشد(5). تلومراز، آنزیمی است که بعد از همانندسازی فعال شده و باعث افزودن تعداد نسبتاً زیادی نوکلئوتید به انتهای کروموزومها میشود. این آنزیم که یک کمپلکس چند پروتئینی با ساختار ریبونوکلئوپروتئین است، دارای فعالیت ترانس کریپتاز معکوس(RT) بوده و قادر است از رویRNA ، مولکول DNAتولید کند(8-6). مشخص شده است که آنزیم تلومراز در 90% از بدخیمیها افزایش بیان دارد، این در حالی است که در سلولهای نرمال این آنزیم بیان نشده و غیرفعال میباشد. مطالعه‌های بسیاری نشان میدهد که هدف قرار دادن فعالیت تلومراز در بسیاری از تومورها سبب تداخل در عملکرد تلومر و در نتیجه مرگ سلولی میشود(9)؛ از این رو میتوان از مهارکنندههای تلومراز به عنوان اهداف درمانی امیدوار کننده در مهار رشد و تکثیر سرطان بهره جست.
در میان این دسته از داروها، BIBR1532 به عنوان مهارکننده اختصاصی hTERT توجه ویژهای را به خود اختصاص داده است(10). مطالعه‌ها نشان دادهاند که مهار تلومراز با استفاده از BIBR1532 در بسیاری از سلولهای سرطانی هم چون پروستات، پستان، ریه و فیبروسارکوما منجر به کاهش طول تلومر و القاء مرگ سلولی میشود(11). هم چنین اثر سایتوتوکسیک مستقیم این دارو در کوتاه مدت، بدون تاثیر بر سلولهای نرمال، بر روی سلولهای لوسمی میلوئیدی حاد و لوسمی لنفوئیدی مزمن نیز به صورت وابسته به دوز و زمان نشان داده شده است(12). نتایج حاصل از مطالعه اخیر توسط شی و همکاران نشان داد که استفاده از این دارو در سرطان سینه سبب القاء آپوپتوز از طریق مهار تلومر و توقف چرخه سلولی در مرحله G1 میشود(13). با توجه به این که مشخص شده است که بیان آنزیم تلومراز در مبتلایان به ALL افزایش دارد، لذا در این مطالعه بر آن شدیم تا کارآیی استراتژی مبتنی بر استفاده از داروهای آنتیتلومراز را در رده سلولی Nalm-6 (Pre-B ALL cell) بررسی کنیم.
مواد و روش‌ها
کشت سلولی و تیمار دارویی:
در این مطالعه تجربی، سلولهای Nalm-6 (سلولهای رده لوسمی لنفوبلاستیک حاد) به صورت سوسپانسیون در محیط کشت RPMI1640 حاوی 2 میلیمولار از ال-گلوتامین، 10%FBS ، پنیسیلین به میزان U/mL100 و استرپتومایسین به میزان µg/mL 100 در دمای 37 درجه سانتیگراد و فشار 5% از CO2کشت داده شدند. برای تیمار دارویی سلولها از داروی BIBR1532 (آمریکا-بیوسانس) که به صورت پودر میباشد، استفاده شد. محلول ذخیره BIBR1532 در غلظت mM1 و به واسطه حل کردن این دارو در DMSOاستریل تهیه شد. محلول ذخیره را در میکروتیوبها تقسیم کرده و آن‌ها را در دمای20- درجه سانتیگراد تا زمان مصرف نگهداری کردیم. به منظور تعیین اثرات بهینه BIBR1532 ، دو متغیر دوز و زمان در نظر گرفته شد؛ بدین ترتیب که سلولهای سرطانی Nalm-6 با غلظتهای 10، 30 و 60 میکرومولار از دارو طی مدت زمانهای 24، 36 و 48 ساعت تیمار شدند. در این مطالعه، سلولهای تیمار نشده با دارو به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شده است. در ضمن به منظور افزایش بهرهوری کار و بررسی مقایسهای، تمامی آزمایشها برای هر دوز و زمان به صورت تریپلیکیت انجام شد.
اندازهگیری فعالیت متابولیک سلولی:
برای بررسی اثر مهاری داروی BIBR1532 بر روی فعالیت متابولیک سلولی، تعداد 10000 سلول در هر میلیلیتر در حضور یا عدم حضور دارو به مدت 24، 36 و 48 ساعت انکوبه شدند.
بعد از اتمام زمان تیمار، محلول MTT در غلظت mg/mL5 به سلولهای درون چاهکهای پلیت 96 خانه اضافه شد و به مدت 3 ساعت دیگر در 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از طی زمان انکوباسیون، پلیت حاوی سلولها با دور g 1000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی چاهکها خالی گردید و 100 میکرولیتر محلول DMSO به هر چاهک اضافه شد. در ادامه، جذب نوری نمونهها در طول موج 570 نانومتر اندازهگیری شد.
بررسی میزان ساخت DNA :
اثر مهاری BIBR1532بر روی تکثیر سلولهای Nalm-6 از طریق تعیین میزان مشارکت برموداکسی‌یوریدین در DNA سلولهای Nalm-6 با استفاده از BrdU-based cell proliferation ELISA kit طبق دستورالعمل کیت اندازهگیری شد. به طور خلاصه، تعداد 5000 سلول در هر چاهک درون پلیت 96 تایی در حضور یا عدم حضور BIBR1532 کشت داده شدند. 12 ساعت مانده به انتهای زمان انکوباسیون، 10 میکرولیتر محلول BrdU که در کیت موجود میباشد، به سلولها افزوده شد؛ در ادامه و با استفاده از محلول FixDenat ، سلولها فیکس شده و DNA آن‌ها دناتوره گشت. سلولها با آنتیبادی علیه BrdU که با آنزیم پراکسیداز کنژوگه میباشد، به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شده و در انتهای این زمان، 100 میکرولیتر سوبسترای TMB افزوده شد. پس از گذشت 30 دقیقه در دمای اتاق و آن هم به منظور پایان دادن به عملکرد آنزیم پراکسیداز، از محلول اسید سولفوریک 1 مولار استفاده شد. در انتها، میزان رنگ ایجاد شده در هر چاهک با استفاده از دستگاه الایزا ریدر در طول موج nm 450 خوانده شد. در نهایت و برای محاسبه اثر مهاریBIBR1532 بر روی تکثیر و بررسی میزان کاهش ساخت DNA سلولهای Nalm-6 تیمار شده از فرمول زیر استفاده شد:
در این فرمول، OD exp و OD contبه ترتیب بیانگر جذب نوری سلولهای تیمار شده و سلولهای تیمار نشده (کنترل) میباشد.
استخراج RNA و ساخت cDNA:
برای استخراج RNA از محلول TriPure Isolation (رُوش) Reagent طبق دستورالعمل کیت استفاده شد. پس از تیمار سلولهای Nalm-6 با BIBR1532 و متعاقب گذشت 24 ساعت، RNA سلولها استخراج و کمیت آن‌ها با روش اسپکتروفتومتری با استفاده از دستگاه Nanodrop ND-1000 اندازهگیری شد. در ادامه کار، برای انجام واکنش رونویسی معکوس و جهت ساخت cDNA از (فرمنتاز) RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit استفاده شد.
حجم مورد نظر برای انجام این واکنش µL 20 بود و محتویـات آن شامـل µL4 از بافر PCR 5X، µL2 از dNTP ، µL1 از راندم هگزامر، µL1 آب تیمار شده با DEPC ، µL1 مهار کننده RNase (U/µL 20)، µL 1 ترانـس کریپتاز معکوس M-MULV( U/µL200) و µg 1 از RNA مـورد آزمـایـش بـه ازای هـر واکنـش مـیباشد.
محتوی مذکور به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد، 5 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد و 1 ساعت در دمای 42 درجه سانتیگراد انکوبه شد و در نهایت، واکنش ساخت cDNA به واسطه انکوباسیون 5 دقیقهای در دمای 70 درجه سانتیگراد پایان پذیرفت. cDNA ساخته شده در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
جدول 1: توالی آغازگرهای مورد استفاده در آزمایش Real-time PCR
| ژن | آغازگر جلوبرنده (5'-3') |
آغازگر معکوس (5'-3') |
سایز (bp) |
| HPRT | TGGACAGGACTGAACGTCTTG | CCAGCAGGTCAGCAAAGAATTTA | 111 |
| p21 | CCTGTCACTGTCTTGTACCCT | GCGTTTGGAGTGGTAGAAATCT | 130 |
| p73 | GTCAAGCCGGGGGAATAATGA | CTCAGCAGATTGAACTGGGC | 108 |
| Bax | CGAGAGGTCTTTTTCCGAGTG | GTGGGCGTCCCAAAGTAGG | 242 |
| Bad | CCCAGAGTTTGAGCCGAGTG | CCCATCCCTTCGTCGTCCT | 249 |
اندازهگیری کمی بیان ژنها با روش Real-time PCR :
آزمایش Real-time PCR در دستگاه Light-cycler (رُوش) و در حجم 20 میکرولیتر انجام شد. به ازای هر واکنش، µL 10 از SYBR Premix Ex Taq (تاکارا)، µL 2 از cDNA ، µL 5/0 از هریک از آغازگرها(pmol 10) و µL 7 آب عاری از نوکلئاز استفاده شد. شرایط دمایی مورد استفاده شامل یک مرحله فعالسازی اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه و در ادامه، 45 چرخه برای دناتوراسیون (5 ثانیه در 95 درجه سانتیگراد) و آنیلینگ/اکستنشن توام (20 ثانیه در 60 درجه سانتیگراد) میباشد. برای بررسی اختصاصیت محصول تکثیر شده، منحنی ذوب مورد بررسی قرار گرفت. همزمان HPRT (هایپوگزانتین گوانین فسفوریبوزیل ترانسفراز) برای نرمالیزه کردن بیان ژنها مورد استفاده قرار گرفت. در انتها و برای محاسبه نسبی تعداد نسخه mRNA تکثیر شده از فرمول –êêct 2 استفاده شد(جدول 1).
بررسی فعالیت چرخه سلولی:
ابتدا تعداد 106 سلول به همراه 2 میلیلیتر محیط کشت RPMI1640 حاوی 10% FBS ، در چاهکهای پلیت 6 خانهای ریخته شد. در ادامه، سلولها با دوزهای 10، 30 و 60 میکرومولار از داروی BIBR1532 تیمار و به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. پس از پایان انکوباسیون، سلولها را با دور rpm/min2000 سانتریفیوژ کرده و در محلول PBS معلق نمودیم. سپس سلولها به وسیله اتانول 70% تثبیت شدند و در ادامه پس از افزودن mL1 محلول PI master mix که حاوی µL 950 از PBS وµL 40 از معرف PI میباشد، به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. در نهایت، الگوی رنگپذیری DNAبا استفاده از دستگاه فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفته و دادهها با استفاده از نرم افزار WINMDIآنالیز شدند.
آنالیز آماری:
برای تجزیه و تحلیل دادهها از نرم افزار آماری SPSS نسخه 18 استفاده شد. اختلاف معنادار بین متغیرهای آزمایش با استفاده از آزمون t دو دامنه تعیین شد. هم چنین به منظور مقایسه بین گروه کنترل و نمونههای آزمایش شده از آزمون دانت استفاده گردید. مقادیر 05/0 p< از نظر آماری معنادار در نظر گرفته شده است.
یافته‌ها
BIBR1532 به صورت وابسته به دوز و زمان باعث کاهش فعالیت متابولیک سلولهای Nalm-6 میشود:
به منظور بررسی اثر BIBR1532 بر فعالیت متابولیک سلولهای Nalm-6 از روش MTT استفاده شد. طی بررسیهای صورت گرفته بر روی سلولهای تیمار شده، در زمانهای 24، 36 و 48 ساعت مشخص گردید که داروی BIBR1532 سبب کاهش فعالیت متابولیکی سلولهای تیمار شده نسبت به سلولهای تیمار نشده (کنترل) میشود. در سلولهای تیمار شده، با افزایش غلظت داروی BIBR1532 فعالیت متابولیک سلولها به صورت وابسته به دوز کاهش مییابد. هم چنین نتایج به دست آمده نشان داد که با افزایش زمان مواجهه سلولها با دارو نیز میزان تاثیرگذاری سایتوتوکسیک این مهارکننده تشدید میشود. غلظت µM10 دارو اثر چشمگیری در کاهش فعالیت متابولیکی سلولهای Nalm-6 ندارد، این در حالی است که دوز µM30 از دارو طی مدت زمان 24، 36 و 48 ساعت به ترتیب این شاخص را به 90%، 84% و 78% کاهش میدهد(نمودار 1). هم چنین با افزایش غلظت دارو به µM60 شاهد کاهش بیشتر فعالیت متابولیک به ترتیب به میزان 81%، 73% و 63% در زمانهای ذکر شده بودیم. با توجه به نتایج به دست آمده میتوان نتیجه گرفت که داروی BIBR1532 هم به طور وابسته به دوز و هم به طور وابسته به زمان سبب مهار فعالیت متابولیکی سلولهای Nalm-6 میشود.
نمودار 1: بررسی اثر BIBR1532 بر فعالیت متابولیک سلولهای Nalm-6 به طور وابسته به دوز و زمان. سلولهای Nalm-6 در تعداد 10000 سلول در پلیت 96 خانهای تحت تأثیر مقادیر مختلف BIBR1532 قرار گرفته و به مدت 24، 36 و 48 ساعت انکوبه شدند. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از سه ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه و p value به دستآمده(* ، بیانگر 05/0 p< و و **، بیانگر 01/0 p<) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل بود.
BIBR1532 به طور وابسته به دوز و زمان سبب کاهش ساخت DNA میشود:
به منظور بررسی اثر آنتیپرولیفراتیو داروی BIBR1532 بر روی سلولهای لوسمی لنفوبلاستیک حاد Nalm-6 ، از آزمون BrdU استفاده شد. طی بررسیهای وابسته به دوز در زمانهای 24 و 48 ساعت پس از تیمار سلولها با داروی BIBR1532 بر روی سلولهای Nalm-6 ، مشخص گردید که این دارو هم به طور وابسته به دوز و هم وابسته به زمان سبب مهار تکثیر سلولهای Nalm-6 میگردد. در غلظت µM 30 از دارو، میزان ساخت DNA و تکثیر سلولها در زمانهای 24 و 48 ساعت به ترتیب 7 و 15 درصد کاهش یافت(نمودار 2). در همین راستا، به ترتیب کاهش 21 و 23 درصدی میزان ساخت DNA در غلظت µM60 در زمانهای مذکور، بیانگر اثر آنتیپرولیفراتیو وابسته به دوز و زمان دارو میباشد(نمودار 2). با توجه به نتایج به دست آمده میتوان نتیجه گرفت که BIBR1532 علاوه بر اعمال اثر سایتوتوکسیک مشخص شده در آزمون MTT ، دارای خاصیت آنتیپرولیفراتیو نیز است.نمودار2: اثر داروی BIBR1532 بر روی ساخت DNA در رده سلولی Nalm-6 به طور وابسته به دوز و زمان. سلولهای Nalm-6 در تعداد 5000 سلول در پلیت 96 خانهای تحت تأثیر مقادیر مختلف BIBR1532 قرار گرفته و به مدت 24 و 48 ساعت انکوبه شدند. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از سه ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه و p value به دستآمده (*، بیانگر 05/0 p<) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل بود.
BIBR1532 موجب توقف چرخه سلولی در مرحله G1 و افزایش جمعیت سلولی در Sub-G1 میشود:
برای تعیین این که آیا اثر مهاری داروی BIBR1532 میتواند منسوب به تغییرات در چرخه سلولی باشد، سلولهای Nalm-6 با دوزهای µM10، µM30 و µM 60 برای 24 ساعت تیمار داده شده و با استفاده از روش فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج به دست آمده نشان داد که در سلولهای Nalm-6 افزایش غلظت BIBR1532 موجب افزایش مختصر درصد سلولها در مرحله G1 میشود(نمودار 3). بدین ترتیب که درصد سلولها در مرحله G1در گروه کنترل 30% و در دوزهای µM10 ، µM30 و µM60 طی تیمار 24 ساعته به ترتیب 32% ، 37% و 43% میباشد. هم چنین، نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که دوز µM60 از دارو سبب کاهش معنادار جمعیت سلولی در مرحله G2/M نیز میشود؛ به طوری که تیمار 24 ساعته سلولها با کاهش 50 درصدی سلولهای این مرحله نسبت به جمعیت سلولی فاز G2/M در گروه کنترل همراه میباشد.
نمودار 3: BIBR1532 سبب توقف چرخه سلولی در مرحله G1 و کاهش جمعیت سلولی G2/Mمیشود. افزایش درصد سلولهای Nalm-6 در مرحله G1 و هم چنین کاهش معنادار جمعیت سلولهای مرحله G2/M طی تیمار 24 ساعته با داروی BIBR1532 نشاندهنده اعمال اثر مهاری دارو در الگوی چرخه سلولی میباشد. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از سه ران کاری مختلف (mean ± SD) محاسبه و p value به دستآمده (*، بیانگر 05/0 p< و **، بیانگر 01/0 p<) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل بود.
علاوه بر این، درصد سلولهای وارد شده به مرحله Sub-G1 که بیانگر سلولهای آپوپتوتیک است نیز به طور قابل توجه و آن هم به طور وابسته به دوز افزایش یافته است(نمودار 4). با توجه به نتایج به دست آمده میتوان نتیجه گرفت که اثرات مهاری اعمال شده توسط داروی BIBR1532 در رده سلولی Nalm-6 احتمالاً از طریق فعال کردن مسیر آپوپتوتیک میباشد.
نمودار 4:BIBR1532 جمعیت سلولی Sub- G1 را افزایش میدهد. افزایش این پیک به منزله افزایش آپوپتوز در سلولها تلقی شده و میتوان نتیجه گرفت که داروی BIBR1532 به طور وابسته به دوز سبب القاء آپوپتوز در سلولهای Nalm-6 میشود. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از سه ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه و p valueبه دست آمده(*، بیانگر 05/0 p< و **، بیانگر 01/0 p<) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل بود.
با افزایش غلظت BIBR1532 میزان رونویسی از ژنهای پروآپوپتوتیکBad ، Bax ، p73 و p21افزایش مییابد:
به منظور آن که بدانیم آیا اثر سایتوتوکسیک دارو از طریق فعال شدن مسیر آپوپتوز رخ میدهد، میزان فعالیت رونویـسی برخی از ژنهای پروآپوپتوتیک مهم هم چونBad ، Bax ،p73 و p21 اندازهگیری شد. تیمار سلولهای Nalm-6 با دوزهای 30 و 60 میکرومولار BIBR1532 طی مدت زمان 24 ساعت، به طور چشمگیری سبب افزایش بیان mRNA ژنهای p73 ، p21 ، Bad و Bax میشود(نمودار 5). نتایج حاصل نشان داد که غلظت 60 میکرومولار دارو سبب افزایش 5 برابری رونویسی از ژن p21 و هم چنین افزایش تقریباً 5/4 برابری mRNA ژنهای Bax و p73 شد. با توجه به نتایج دادهها میتوان نتیجه گرفت که داروی BIBR1532 به طور وابسته به دوز سبب افزایش بیان ژنهای پروآپوپتوتیک میشود.
نمودار 5: افزایش میزان رونویسی از ژنهای پروآپوپتوتیکBad ، Bax ، p73 و p21 طی تیمار با BIBR1532. سلولهای Nalm-6 با دوزهای معین از BIBR1532 ( µM30 و µM60) به مدت 24 ساعت تیمار شدند. در ادامه و بعد از استخراج RNA و ساخت cDNA ، میزان بیان mRNA هر یک از ژنها با استفاده از روش RQ-RT-PCR اندازهگیری شد. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از سه ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه و p value به دست آمده (*، بیانگر 05/0 p< و **، بیانگر 01/0 p<) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل بود.
بحث
|
Bad Bax p73 p21
|
|
Control
µM 30 µM 60 |
|
5
4 3 2 1 0 |
مطالعه‌ها نشان داده است که p73 میتواند به ژنهای هدف p53 متصل شده و به واسطه فعال کردن برخی ژنهای پروآپوپتوتیک هدف مثل Bax و p21 ، سبب افزایش مرگ برنامهریزی شده در سلول شود(14). هم چنین مشخص شده است کهp21 خود نیز به عنوان یک کیناز مهارگر وابسته به چرخه سلولی، در هنگام القاء آسیب به DNA سلول افزایش یافته و سبب مهار چرخه سلولی در مرحله G1 میشود(16، 15). بـا تـوجه بـه ایـن نکتـه که تکثیر نامحدود سلولها، که عمدتـاً از طریـق حفظ طـول تلومر اتفاق میافتد، مشخصه اصلی بسیاری از سرطانها است، لذا امروزه هدف قرار دادن مکانیسمهای مسئول حفظ طول تلومر به عنوان یک هدف درمانی خاص مورد توجه وافر قرار گرفته است(5). در این مطالعه و برای ارزیابی اثر BIBR1532 در لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL) و هم چنین جهت درک مکانیسم دقیقی از سایتوتوکسیسیتی این دارو، سلولهای Nalm-6 مشتق از pre-B ALL با غلظتهای مختلف از این مهارکننده تیمار شد. بر اساس نتایج حاصل از این مطالعه مشخص گردید که بر خلاف دوز پایین دارو(µM 10) که طی گذشت مدت زمان کوتاه قادر به مهار رشد و کاهش درصد زندهمانی سلولها نمیباشد، دوزهـای بـالای دارو (≤ 30 میکرومولار) قادرند بر روی درصد زندهمانی و هم چنین قدرت تکثیر سلولها تاثیر مهاری قابل ملاحظهای بگذارند. مطالعه‌ها نشان دادهاند که مهار تلومراز با استفاده از داروی BIBR1532 در بسیاری از سلولهای سرطانی هم چون پستان، ریه، کندروسارکوما و لوسمی پرومیلوستیک حاد منجر به کاهش طول تلومر و القاء مرگ سلولی میشود(21-17). الدالی و همکارانش نیز مشخص کردند که اگر چه BIBR1532 دارای اثر آنتی پرولیفراتیو بر روی سلولهای بیماران مبتلا به AML و CLL و همین طور سل لاینهای مشتق شده از این بیماریها میباشد، اما بر روی سلولهای طبیعی هماتوپوئتیک هیچ اثر سایتوتوکسیکی نداشت(12). نتایج حاصل از این مطالعه هم چنین نشان داد که BIBR1532 میتواند الگوی چرخه سلولی را در رده سلولی Nalm-6تغییر دهد؛ بدین ترتیب که افزایش جمعیت سلولی در فاز Sub-G1 متعاقب تیمار سلولها، بیانگر القاء آپوپتوز و کاهش سلولهای G2/M تائیدی بر اثر آنتیپرولیفراتیو دارو میباشد. شی و همکاران نیز نشان دادند که استفاده هم زمان از داروی BIBR1532 و Paclitaxel سبب افزایش آپوپتوز و کاهش پرولیفراسیون در سلولهای سرطانی سینه میشود؛ با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه نشان داده شد که استفاده ازBIBR1532 در سرطان سینه سبب القاء آپوپتوز از طریق مهار تلومر و تـوقف چرخه سلولی در مرحله G1 (مستقل از وضعیت ER ، HER-2 و (p53 میشود(13). هم چنین طی مطالعه‌های صورت گرفته بر روی سلولهای سرطانی اندومتریال مشخص شده است که این مهار کننده سبب القاء آپوپتوز و جلوگیری از متاستاز این سلولها نیز میشود(22).
در مـواقعـی که آسیب DNA شدید باشد، سلول آسیب
دیده از طریق راهاندازی مسیر آپوپتوز خود را تخریب می‌کند. تحقیقات صورت گرفته نشان میدهد p73 که از جمله اعضاء خانواده p53 میباشد، دارای نقش کلیدی در فعال کردن مرگ برنامهریزی سلولی میباشد(15). در واقع، متعاقب بروز آسیب DNA، فاکتور رونویسی p73 میتواند با اتصال به DNAبرخی از ژنهای پروآپوپتوتیک هم چون Bax و p21 سبب فعال شدن مسیر آپوپتوتیک در سلول شود(15، 10). بهعلاوه گزارش شده است که p73 میتواند با محدود کردن میزان رونویسی از ژن hTERT منجر به مهار فعالیت آنزیم تلومراز نیز گردد(16، 14). هم چنین p21 نیز که یک فاکتور رونویسی شناخته شده وابسته به p53 میباشد، میتواند با القاء توقف چرخه سلولی در مرحله G1و یا القاء آپوپتوز، مقدمات مربوط به ترمیم DNA و یا تخریب سلول آسیبدیده را فراهم آورد(23). مطابق با مطالب اشاره شده، نتایج به دست آمده از این مطالعه نیز حاکی از این است که توقف چرخه سلولی در مرحله G1و افزایش مقدار DNA در Sub-G1 با افزایش رونویسی از ژن پروتئینهای پروآپوپتوتیک هم چون p73 ، p21 ، Bax و Bad همراه میباشد. مشابه با نتایج به دست
آمده در این مطالعه، پارک نشان داد که استفاده از داروی BIBR1532 در سلولهای مقاوم به سیسپلاتین سبب مهار hTERT و در نتیجه افزایش بیان Bax ، آزاد شدن سیتوکروم C و در نهایت آپوپتوز میشود(24).
نتیجه‌گیری
با انجام این مطالعه مشخص شد داروی BIBR1532 سبب مهار فعالیت متابولیک و ساخت DNA به طور وابسته به دوز و زمان در سلولهای Nalm-6 میشود. هم چنین این دارو باعث افزایش بیان ژنهای p21 و p73 و متعاقب آن افزایش جمعیت سلولی در مرحله G1 و کاهش درصد سلولی در مرحله G2/M میشود. به علاوه جمعیت سلولی در پیک Sub-G1 که نشاندهنده آپوپتوز است، نیز افزایش یافت که این یافته با افزایش بیان ژنهای پروآپوپتوتیک Bax و Bad تأیید شد. با توجه به نتایج به دست آمده در این تحقیق، میتوان به افزوده شدن داروهای مبتنی بر استراتژی آنتیتلومرازی به رژیم درمانی بیماران لوسمیک به عنوان راهکار درمانی امیدبخش امیدوار بود.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
