Journal of Iranian Blood Transfusion

fa بهینه‌سازی جداسازی اگزوزوم‌های مشتق از پلاکت با استفاده از سانتریفیوژ متوالی در روش رسوب‌دهی با پلیمر Optimization of Platelet-Derived Exosome Isolation Using Multiple Centrifugation Steps Based on Polymer-precipitation عمومى General پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده سابقه و هدف  اگزوزوم‌ها دسته‌ای از وزیکول‌های خارج سلولی هستند که از طریق مسیر اندوزومال آزاد می‌شوند و قطری بین 150-30 نانومتر دارند. محتوای آن‌ها شامل ماکرومولکول‌های زیستی از جمله DNA ، RNA و پروتئین‌ها می‌باشد. اگزوزوم‌های مشتق از پلاکت، فراوان‌ترین نانوذرات جریان خون هستند. از آن جا که یافتن روشی ساده و کارآمد برای جداسازی این وزیکول‌ها بسیار با اهمیت است، در این پژوهش روش مؤثری بر مبنای رسوب پلیمری جهت جداسازی اگزوزوم‌های پلاکتی معرفی شده است.  مواد و روش‌ها در این مطالعه تجربی، نمونه‌های کنسانتره پلاکتی تهیه شده به روش پلاسمای غنی از پلاکت پس از یک روز ذخیره‌سازی، از سازمان انتقال خون ایران تهیه شد. در پایان روز 3، دو دستورالعمل مختلف در دورهای سانتریفیوژ و بر مبنای رسوب پلیمری، جهت جداسازی اگزوزوم‌های پلاکتی استفاده شد. اندازه ذرات جدا شده توسط تفرق دینامیکی نور یا DLS مقایسه شد (n=2). هم‌چنین غلظت ذرات جدا شده با روش بردفورد تعیین شد (n=2) و آنالیز وسترن بلات برای نشانگر اگزوزومی CD63 انجام شد. یافته‌ها نتایج حاصل از تحلیل DLS نشان داد که در دستورالعمل A، ذرات جداشده دارای توزیع اندازه گسترده‌تری بودند و بیش از 73% ذرات در محدوده خارج از اندازه اگزوزوم (بزرگتر از 150 نانومتر) قرار داشتند. در مقابل، در دستورالعمل B که شامل مراحل سانتریفیوژ در چند دور متوالی و رو به افزایش بود، 100% ذرات در بازه اندازه 30 تا 150 نانومتر (محدوده اگزوزوم) قرار گرفتند و توزیع اندازه بسیار یکنواخت‌تری مشاهده شد. هم‌چنین، نتایج روش بردفورد نشان‌دهنده میانگین غلظت پروتئین ذرات استخراج شده، معادل mg/mL 0.424 ± 0.12 در دستورالعمل A و mg/mL 0.19 ± 2.62 در دستورالعمل B بود. تجزیه و تحلیل وسترن بلات نیز بیان پروتئین  نشانگر اگزوزومی CD63 را در ذرات جداشده تأیید کرد.  نتیجه گیری             در این مطالعه مشخص شد که انجام چند مرحله سانتریفیوژ متوالی در روش رسوب پلیمری، نقش مؤثری در جداسازی اگزوزوم‌های خالص‌تر با اندازه یکنواخت دارد. این مطالعه روش بهینه شده‌ای را جهت جداسازی اگزوزوم‌های خالص‌تر بر مبنای رسوب پلیمری معرفی می‌کند.</div> <div style="text-align: justify;">A B S T R A C T Background and Objectives Exosomes are a subclass of extracellular vesicles (EVs) released via the endosomal pathway, ranging in diameter from 30 to 150 nm. They carry a diverse of biological macromolecules such as DNA, RNA, and proteins. Platelet-derived exosomes are the most abundant nanoparticles in the bloodstream. Given the need for simple and efficient isolating techniques, this study evaluates a method based on polymer precipitation for exosome isolation. Materials and Methods This experimental interventional study utilized platelet concentrate samples prepared by the platelet-rich plasma method, obtained from the Iranian Blood Transfusion Organization after one day after collection. On day three of storage, two different protocols differing in centrifugation steps and based on polymer precipitation were used to isolate platelet exosomes. The size of the isolated particles was compared by dynamic light scattering (DLS) (n=2). Additionally, the concentration of the isolated particles was determined using the Bradford assay (n=2), and Western blot analysis was performed for presence of the exosomal marker CD63. Results DLS analysis showed that Protocol A produced particles with a broader size distribution, with over 73% of particles exceeding the accepted exosome size range (>150 nm). In contrast, Protocol B which included multiple consecutive centrifugation steps, 100% of particles were within the 30-150 nm range, demonstrating more uniform size distribution. Bradford assay results showed that the average protein concentration of the extracted nanoparticles was 0.424±0.12 mg/mL for protocol A compared to 2.62±0.19 mg/ml for protocol B. Western blot analysis confirmed the expression of exosomal marker CD63 in the isolated particles. Conclusions  Our findings demonstrate that performing multiple consecutive centrifugation steps into the polymer-precipitation method significantly enhances the purity and size of isolated platlet exosomes. This study introduces an optimized protocol for isolating high-quality exosomes based on polymer-precipitation.  </div> وزیکول‌های خارج سلولی, اگزوزوم‌ها, پلاکت‌ها, تفرق دینامیکی نور Keywords: Extracellular Vesicles, Exosomes, Platelets, Dynamic Light Scattering 0 0 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-980-3&slc_lang=fa&sid=1 Mobina Nazari مبینا نظری 9100319475328460027565 9100319475328460027565 No مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون Mahshid Mohammadipour مهشید محمدی پور m.mohammadipoor@tmi.ac.ir 9100319475328460027566 9100319475328460027566 Yes استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون Seyyede Fatemeh Shams سیده فاطمه شمس 9100319475328460027567 9100319475328460027567 No استادیار دپارتمان خون‌شناسی آزمایشگاهی و بانک خون ـ دانشکده پزشکی ـ دانشگاه علوم پزشکی مشهد Mahsa Salehi مهسا صالحی 9100319475328460027568 9100319475328460027568 No استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون