The Scientific Journal of Iranian Blood Transfusion Organization
فصلنامه پژوهشی خون
Sci J Iran Blood Transfus Organ
Medical Sciences
http://bloodjournal.ir
91
journal91
1027-9520
1735-8248
fa
jalali
1387
10
1
gregorian
2009
1
1
5
4
online
1
fulltext
fa
تاثیر اینترون 1 ژن بتاگلوبین انسانی بر روی بیان موقت فاکتور 9 انعقادی فعال انسانی در ردهای از سلولهای پستانداران
The function of intron-1 of human beta globin gene on the expression of biologically active human factor IX in a mammalian cell line
بيولوژي
Biology
پژوهشي
Research
<p> چکید ه </p><p> <strong><i> سابقه و هدف </i></strong></p><p> <strong> تاثیر حضور اینترونها در افزایش بیان ژنها در سلولهای پستانداران نشان داده شده است. در این مطالعه کارایی اینترون 1 ژن بتاگلوبین انسانی بر بیان موقت </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور 9 انسانی در رده سلولی تخمدان هامستر چینی( </strong><strong>CHO </strong><strong>) تحت کنترل پروموتر سیتومگالوویروس نشان داده شد. </strong></p><p> <strong><i> مواد وروشها </i></strong></p><p> <strong> مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. در این پژوهش اینترون 1 ژن بتاگلوبین انسانی بین اگزونهای 1 و 2 </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور 9 انسانی وارد شد. </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور 9 واجد اینترون و </strong><strong>cDNA </strong><strong>طبیعی فاکتور 9 به صورت جداگانه، در پایین دست پروموتر سیتومگالو ویروس در دو پلاسمید بیانی </strong><strong>pcDNA3 </strong><strong>همسانهسازی شدند. پس از تایید ساختار مولکولی، سازههای نوترکیب ساخته شده برای ترانسفکشن سلولهای </strong><strong>CHO </strong><strong>مورد استفاده قرار گرفتند. محیط کشت سلولهای ترانسفکت شده به منظور آشکارسازی بیان پروتئین نوترکیب فاکتور 9 انسانی، جمعآوری و مورد آزمون یک مرحلهای انعقاد بر روی پلاسمای فاقد فاکتور 9 قرار گرفت. سپس به منظور تایید صحت بیان </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور 9 در سلولهای نوترکیب، حضور آن با آزمون رونوشتبرداری معکوس تایید شد. </strong></p><p> <strong><i> یافتهها </i></strong></p><p> <strong> مقایسه اولیه زمانهای انعقاد به دست آمده از محیطهای کشت سلولهای ترانسفکت شده با هر دو پلاسمید نوترکیب در مقایسه با نمونههای کنترل منفی، بیانگر فاکتور 9 به میزان 16 تا 62 درصد توسط هر دو گروه سلولهای دگرگون شده بود. هم چنین مقایسه نتایج حاصل از فعالیت انعقادی سلولهای واجد سازههای نوترکیب، نشانگر افزایش فعالیت فاکتور 9 بیان شده به میزان 1 تا 28 درصد در محیط کشت سلولهای دگرگون شده با سازه واجد اینترون نسبت به سلولهای دگرگون شده با سازه فاقد اینترون بود. هم چنین آزمون رونوشتبرداری معکوس، صحت فرآیند اسپلایسینگ و بیان فاکتور 9 از سلولهای نوترکیب را تایید نمود. </strong></p><p> <strong><i> نتیجه گیری </i></strong></p><p> <strong> در این تحقیق تاثیر مثبت حضور اینترون 1 بتا گلوبین بر میزان بیان فاکتور 9 انسانی نشان داده شد. در عین حال با ساخت پلاسمیدهای بیان کننده فاکتور 9 انسانی، ابزار مناسبی برای بررسی پایداری سلولهای ترانسفکت شده برای تولید فاکتور 9 در محیط انتخابی به صورت سیستماتیک فراهم شد. </strong></p><p> <strong><i> کلمات کلیدی </i>: فاکتور 9 ، بتاگلوبینها، اینترونها، سلولهای CHO </strong></p>
<p> <strong> Abstract </strong><strong></strong></p><p> <strong><i>Background and Objectives</i></strong></p><p> Several studies have shown the positive effects of introns on the expression of heterologous genes in mammalian hosts. In this study, transient expression increment of hFIX in the presence of intron-1 of human beta-glubin was studied.</p><p> </p><p> <strong><i>Materials and Methods</i></strong></p><p> The intron-1 of human beta-glubin (hBG) was introduced into the human factor IX cDNA in donor/acceptor site between exons 1 and 2. The constructed hFIX mini-gene and a native hFIX were inserted separately in two expression vectors next to the CMV promoter. After verification, the two recombinant plasmids with and without intron were used to transfect Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. The cultured media taken from the tansfected cells were examined for coagulation activity with a single step clotting test performed on FIX-deficient plasma. Then, to confirm the expression of recombinant hFIX by transfected cells, RT-PCR test was conducted.</p><p> </p><p> <strong><i>Results</i></strong></p><p> The preliminary data obtained from the expression analysis of the two groups of transfected cells in comparison with the cells with parental plasmid (as negative control) indicate of an increase of about 16 to 62% in coagulation activity of both groups of transfected cells. The same data show an enhanced hFIX coagulation activity of about 1 to 28% in the culture media taken from the cells with intron-containing hFIX-cDNA. Furthermore, RT-PCR confirmed correct splicing process and expression of hFIX from both transfected cells.</p><p> </p><p> <strong><i>Conclusions</i></strong></p><p> The positive function of hBG intron 1 on the expression of hFIX in CHO cells was shown. Besides, the constructed plasmids have provided tools for analysis of the stability of the transfected cells for production of biologically active hFIX in a systematic approach. </p><p> <strong>�</strong></p><p> <strong><i>Key words</i></strong><strong><i> : </i></strong><strong></strong>Factor IX, beta- Globins, Introns, cho cells</p><p> </p>
فاکتور 9 , بتاگلوبینها, اینترونها, سلولهای CHO
Factor IX, beta- Globins, Introns, cho cells
209
223
http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-34-2&slc_lang=fa&sid=1
A.A.
Mashadrized
علیاکبر
مشهدریزه
9100319475328460010335
9100319475328460010335
No
A.
Zomorodipour
علیرضا
زمردیپور
zomorodi@nigeb.ac.ir
9100319475328460010336
9100319475328460010336
Yes
S.J.
Hosseini
سیدجواد
حسینی
9100319475328460010337
9100319475328460010337
No
F.
Sabouni
فرزانه
صابونی
9100319475328460010338
9100319475328460010338
No