|
پلی‌مورفیسم G2677T/A ژن MDR1 در کودکان مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد
|
ندا مخبریان   ، فروزنده محجوبی ، راضیه پوراحمد |
| مربی دانشگاه علوم پزشکی شاهرود |
|
| واژه‌های کلیدی: کلمات کلیدی : لوسمی لنفوبلاستیک حاد، مقاومت دارویی، پروتئین MDR1 |
|
|
متن کامل [PDF 251 kb]
(1657 دریافت)
| چکیده (HTML) (7730 مشاهده)
|
نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله:
ژنتيك
انتشار: 1393/4/1
|
|
|
|
|
|
|
متن کامل: (1268 مشاهده) |
پلی‌مورفیسم G2677T/A ژن MDR1 در کودکان مبتلا به لوسمی
لنفوبلاستیک حاد
ندا مخبریان1، فروزنده محجوبی2، راضیه پوراحمد3
چکیده
سابقه و هدف
مهمترین علت مقاومت دارویی، پمپ‌های وابسته به ATP مانند MDR1هستند که باعث خروج دارو از سلول‌ها می‌شوند. ژن MDR1بسیار پلی‌مورفیک می‌باشد و به نظر می‌رسد این پلی مورفیسم‌ها بر روی بیان ژن و در نتیجه پاسخ به درمان مؤثر است. هدف از این مطالعه، بررسی پلی‌مورفیسم G2677T/Aژن MDR1 و ارتباط آن با پاسخ به درمان درکودکان مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه توصیفی تحلیلی، پلی‌مورفیسم G2677T/Aژن MDR1در 44 کودک مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد و 40 فرد سالم توسط روش ARMS-PCRو هم چنین ارتباط این پلی‌مورفیسم با پاسخ به درمان نیز مورد بررسی قرار گرفت.
یافته‌ها
4/36% بیماران ژنوتیپ TT،41% ژنوتیپ GT و 6/13% ژنوتیپ GG ، 5/4% ژنوتیپ AG ، 25/2% ژنوتیپ AT و 25/2% ژنوتیپ AA داشتند. در حالی که در افراد نرمال 35% ژنوتیپ TT، 5/37% ژنوتیپGT، 4% ژنوتیپ GG، 5/7% ژنوتیپ AG ، 5% ژنوتیپ AT و 5% ژنوتیپ AA دیده شد. گروه کنترل و بیماران از نظر فراوانی آلل‌ها و ژنوتیپ تفاوت معناداری با هم نداشتند. هم چنین بین دو گروه ژنوتیپ از نظر پاسخ به درمان نیز تفاوت معناداری دیده نشد.
نتیجه گیری
به نظر می‌رسد که بین پلی‌مورفیسم G2677T/A با پاسخ به درمان ارتباط وجود ندارد و نقش این پلی‌مورفیسم در بیان ژن MDR1در لوسمی لنفوبلاستیک حاد کودکان و پاسخ به درمان مورد سؤال می‌باشد.
کلمات کلیدی: لوسمی لنفوبلاستیک حاد، مقاومت دارویی، پروتئین MDR1
تاریخ دریافت : 20/7/92
تاریخ پذیرش : 3/10/92
1- مؤلف مسؤول: کارشناس ارشد ژنتیک ـ مربی دانشگاه علوم پزشکی شاهرود ـ میدان هفت تیرـ شاهرود ـ ایران ـ کدپستی: 3614773955
2- PhD ژنتیک ـ استادیار پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری ـ تهران ـ ایران
3- PhD ژنتیک ـ استادیار دانشگاه شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران
مقدمه
لوسمی لنفوبلاستیک حاد ، شایع‌ترین نوع لوسمی در کودکان است(1). بروز سالانه این نوع لوسمی بیش از چهل مورد در هر یک میلیون کودک است(2). طبق تحقیقات انجام شده در ایران، این نوع لوسمی بیشترین درصد را در بین کل سرطان‌های کودکان زیر 15 سال شامل میشود(3). یکی از مشکلات درمان بیماران مبتلا به سرطان، مقاومت دارویی است به طوری که این بیماران نسبت به داروهای مختلف که مکانیسم اثر متفاوتی دارند مقاوم می‌شوند(4). مکانیسم‌های متعددی در ایجاد مقاومت دارویی نقش دارند که از آن جمله می‌توان به خروج دارو از سلول به کمک پمپ‌های وابسته به ATP ، تغییر در ژن‌ها و پروتئین‌های کنترل‌کننده آپوپتوز(مانند P53)، فعال شدن مسیرهای دخیل در ترمیم DNA ، خنثی شدن داروها در درون سلول و تغییر در توبولین و میکروتوبول‌ها اشاره کرد(5). پروتئین‌های(ABC transporter = ATP Binding Cassette transporter ) به ATP باند شده و با استفاده از انرژی آن بسیاری از مواد را از طریق غشای پلاسمایی و هم چنین غشاهای درون سلولی مانند رتیکولوم اندوپلاسمیک پراکسیزوم و میتوکندری منتقل می‌کنند(6). در انسان 48 ژن ABC transporterوجود دارد که این ژن‌ها بر اساس تشابه اسیدهای آمینه و سازماندهی دومین‌هایشان، به هفت زیر گروه تقسیم می‌شوند(7). –p گلیکوپروتئین(P-glycoprotein) با وزن مولکولی 170 کیلو دالتون، عمومی‌ترین ABC transporterروی غشا است که توسط ژن MDR1که بر روی کروموزوم 7 قرار دارد، کد دهی میشود. عملکرد اصلی این پروتئین، خروج مواد سمی از سلول و محافظت سلول در برابر مواد سمی است. علاوه بر آن تعدادی مواد هیدروفوبیک و داروهای ضد سرطان مانند اتوپوزاید، داکسوروبیسین و وین بلاستین را نیز به خارج از سلول انتقال می‌دهد(8). ژن MDR1 با 28 اگزون و طول 120 کیلو باز بر روی کروموزوم شماره 7 قرار دارد (7q21.12). تاکنون حدود 50 نوع چند شکلی (Polymorphism (SNP)) در این ژن گزارش شده است که از آن میان به نظر می‌رسد پلی‌مورفیسم G2677T/A در اگزون 26 بر بیان ژن MDR1 و در نتیجه بر مقاومت دارویی و پاسخ به درمان مؤثر می‌باشد(12-9). چون شیمی درمانی، یکی از درمان‌های مهم و جدی در کنترل لوسمی است، بنابراین بررسی علت‌یابی عدم موفقیت شیمی درمانی و تعیین مکانیسم‌های مولکولی مرتبط با آن در بیماران مبتلا از اهمیت بالایی برخوردار است. در نهایت می‌توان از این نتایج برای پایه‌گذاری مارکر ژنتیکی جهت ارزیابی بیماران در زمان درمان و پس از درمان استفاده کرد و با استفاده از مولکول‌های دارویی ساده جهت منحرف کردن فعالیت این ژن‌ها در بیمارانی که در معرض مقاومت دارویی هستند، به درمان هر چه بهتر این بیماران در آینده کمک نمود .در این مطالعه فراوانی آلل‌های مختلف پلی‌مورفیسم G2677T/A در کودکان مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد و ارتباط آن با پاسخ به درمان مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه توصیفی تحلیلی، بعد از اخذ رضایت‌نامه کتبی، از 44 کودک مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد(45% دختر، 55% پسر با میانگین سنی 72/6 سال) و 40 فرد سالم (65% دختر و 35% پسر با میانگین سنی 46/11 سال) به عنوان گروه کنترل نمونه خون محیطی در لوله‌های حاوی EDTA گرفته شد.DNA نمونه خون محیطی بیماران و گروه کنترل توسط کیت ژن فناوران استخراج گردید و لوله‌های حاوی DNA تا زمان انجام واکنش PCRدر دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. بررسی کمی و کیفی DNA استخراج شده با روش اسپکتروفوتومتری و الکتروفورز روی ژل آگارز 5/1% انجام گردید. برای تشخیص پلی‌مورفیسم G2677T/A در اگزون 26 ، از روش ARMS PCR در 2 مرحله و 8 آغازگر استفاده شد(جدول 1). در مرحله اول واکنشPCR ، برای تعیین ژنوتیپ‌های TT ، AT ، AA با حجم نهایی µL 25 شامل DNA حدود ng 50-15، Taq DNA polymeras بـه میزان µL 5/0، بافر x 1 به میزان µL 5/2 ، dNTPs به میزان mM 4/0 ، MgCl2 به میزان mM5/1 و µL 5/0 از هر آغازگر (TG2677R1 ، AG2677F1 ، 2677R1 ، 2677F1) انجام شد. شرایط دمایی ARMS PCR در مرحله اول عبارت بـود
جدول 1: توالی آغازگرهای مورد استفاده برای ARMAS-PCR
| نام |
توالی آغازگر |
طول |
محصول |
| 2677F1 |
5'GAAAATAGAAGCATGAGTTGGAAGA3' |
25 جفت باز |
447 جفت باز |
| 2677R1 |
5'CTGGCTTTGCTACTTTCTGTAAGTTT3' |
26 جفت باز |
447 جفت باز |
| A2677F1 |
5'CACTGAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGCTA3' |
30 جفت باز |
216 جفت باز |
| T2677R1 |
5'TATTTAGTTTGACTCACCTTCCCTGA3' |
26 جفت باز |
287 جفت باز |
| 2677F2 |
5'TCAGAAAATAGAAGCATGAGTTGTGA3' |
26 جفت باز |
453 جفت باز |
| 2677R2 |
5'GAACTGGCTTTGCTACTTTCTGTAAG3' |
26 جفت باز |
453 جفت باز |
| G2677F2 |
5'CACTGAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGATG3' |
30 جفت باز |
219 جفت باز |
| T2677R2 |
5'TATTTAGTTTGACTCACCTTCCCGGA3' |
26 جفت باز |
290 جفت باز |
از: مرحله واسرشت اولیه(Denaturation) 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه (یک سیکل)، مرحله واسرشت 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، مرحله اتصال(Annealing) 57 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، مرحله طویل سازی(Extension) 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 40 ثانیه(مرحله 2 تا 4 ، 35 سیکل تکرار شد)، مرحله طویل‌سازی نهایی72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه (یک سیکل). در مرحله دوم برای تعیین ژنوتیپ‌های TT ، GT ، GG از مخلوط PCR به حجم نهایی µL 25 شامل DNA حدود ng 50-15،Taq DNA polymeras به میزان µL 5/0 ، بافر x1 به میزان µL 5/2 ، dNTPs به میزان mM 4/0 ، MgCl2 به میزان mM5/1 و µL 5/0 از هر آغازگر(TG2677R2 ، 2677R2 G2677F2 ، 2677F2) استفاده شد. شرایط دماییARMS PCR در مرحله دوم عبارت بود از: مرحله واسرشت اولیه 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه(یک سیکل)، مرحله واسرشت94 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، مرحله اتصال 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، مرحله طویل‌سازی 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 40 ثانیه(مرحله 2 تا 4 ،35 سیکل تکرار شد)، مرحله طویل‌سازی نهایی 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه(یک سیکل).
پس از تکثیر قطعات، الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز 5/1% انجام شد و سپس با استفاده از اتیدیوم بروماید رنگ‌آمیزی شد.
محصولات حاصل از ARMS-PCR در مرحله اول عبارتند از قطعات 287 جفت باز، 447 جفت باز برای ژنوتیپTT ، قطعات 216 جفت باز، 447 جفت باز، 287 جفت باز برای ژنوتیپ AT و قطعات 447 جفت باز، 216 جفت باز برای ژنوتیپ AA و در مرحله دوم قطعات عبارتند از: قطعات 290 جفت باز و 453 جفت باز برای ژنوتیپ TT ، قطعات 219 جفت باز، 453 جفت باز و 290 جفت باز برای ژنوتیپ GT و قطعات 453 جفت باز و 219 جفت باز برای ژنوتیپ GG . از نرم‌افزار SPSS نسخه 16 برای ثبت داده‌ها و آنالیز آماری استفاده شد. برای بررسی فراوانی ژنوتیپ و اختلاف آن در گروه کنترل و بیمار و هم چنین بررسی رابطه ژنوتیپ با پاسخ به درمان از آزمون‌های کای‌دو و دقیق فیشر استفاده گردید. حدود اطمینان در تمامی آزمایش‌ها 95% در نظر گرفته شد و 05/0 p< معنادار محسوب شد.
یافته‌ها
فراوانی آلل و ژنوتیپ در بیماران و گروه کنترل محاسبه و مقایسه گردید. فراوانی آلل T ، A ، G در کودکان مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد به ترتیب عبارت بود از 58% ، 6/5% و 4/36% و در گروه کنترل این فراوانی برابر با 25/56% ، 25/11% و 5/32% بود. دو گروه از نظر فراوانی آللT ، A ، G اختلاف معناداری نشان ندادند. ژنوتیـپTT در 16نفر(4/36%)، ژنوتیپ GT در 18
جدول 2: فراوانی ژنوتیپ پلی‌مورفیسم G2677T/A ژن MDR1 در بیماران مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد و گروه کنترل
ژنوتیپ
گروه |
TT
تعداد (درصد) |
GT
تعداد (درصد) |
GG
تعداد (درصد) |
AG
تعداد (درصد) |
AT
تعداد (درصد) |
AA
تعداد (درصد) |
| مبتلا به سرطان |
16 (4/36) |
18 (41) |
6 (6/13) |
2 (5/4) |
1 (25/2) |
1 (25/2) |
| کنترل |
14 (35) |
15 (5/37) |
4 (10) |
3 (5/7) |
2 (5) |
2 (5) |
| p-value |
896/0 |
749/0 |
432/0 |
454/0 |
464/0 |
464/0 |
جدول 3: فراوانی ژنوتیپ‌های پلی‌مورفیسم G2677T/A ژن MDR1 در بیماران پاسخ‌دهنده به درمان و گروه مقاوم به درمان
ژنوتیپ
گروه |
TT
تعداد (درصد) |
GT
تعداد (درصد) |
GG
تعداد (درصد) |
AG
تعداد (درصد) |
AT
تعداد (درصد) |
AA
تعداد (درصد) |
| پاسخ‌دهنده |
12 (4/36) |
14 (5/42) |
4 (1/12) |
1 (3) |
1 (3) |
1 (3) |
| غیر پاسخ‌دهنده |
4 (4/36) |
4 (4/36) |
2 (2/18) |
1 (9) |
0 (0) |
0 (0) |
| p-value |
635/0 |
504/0 |
473/0 |
442/0 |
75/0 |
750/0 |
نفر(41%) ، ژنوتیپ GG در 6 نفر(6/13%)، ژنوتیپ AG در 2 نفر(5/4%)، ژنوتیپ AT در 1 نفر(25/2%) و ژنوتیپ AA در 1 نفر(25/2%) از بیماران مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد مشاهده شد. فراوانی ژنوتیپ C1236T ژن MDR1در گروه کنترل عبارت بود از، ژنوتیپ TT در 14نفر(35%)، ژنوتیپ GT در 15 نفر(5/37%)، ژنوتیپ GG در 4 نفر (10%)، ژنوتیپ AG در3 نفر(5/7%)، ژنوتیپ AT در 2 نفر(5%) و ژنوتیپ AA در 2 نفر(5%). بین بیماران مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد و گروه کنترل از نظر فراوانی ژنوتیپی اختلاف معناداری دیده نشد(جدول 2).
شاخص بیماری نشاندهنده فاز بیماری از نظر پاسخ به دارو است. بر این اساس بیماران به دو گروه پاسخ‌دهنده به درمان و غیر پاسخ‌دهنده به درمان طبقهبندی شدند. گروه پاسخ‌دهنده به درمان به بیمارانی اطلاق میشود که پس از دریافت دارو، به مدت 6 ماه هیچگونه عود بیماری در آنها گزارش نشده باشد. هم چنین تعداد سلولهای بلاست مغز استخوان در آنها کمتر از 5%، تعداد نوتروفیلها بیش از 109 × 5/1 و تعداد پلاکتها بیش از 106 × 100 بوده و هیچ نشانی از سلولهای لوسمی در سایر نواحی بدن گزارش نشده باشد. گروه غیر پاسخ دهنده شامل بیمارانی اسـت کـه در طـی 6 مـاه پـس از دریافت دارو دچار عود
بیماری شده باشند. از 44 بیمار 11 نفر(25%) به درمان پاسخ نداده بودند و 33 نفر(75%) پاسخ داده بودند. بین گروه پاسخ‌دهنده به درمان و آن‌هایی که به درمان پاسخ نداده بودند، از نظر فراوانی ژنوتیپ اختلاف آماری معناداری دیده نشد(جدول 3).
بحث
مقاومت دارویی چند گانه نسبت به داروهای مختلف ضد سرطان یکی از مشکلات اساسی در درمان سرطان‌ها از جمله لوسمی است(14، 13). علی‌رغم پیشرفت در درمان بیماران مبتلا به لوسمی، در بین 60% تا 80% بیماران لوسمی لنفوبلاستیک حاد که تقریبا" درمان نسبی می‌یابند، علی‌رغم موفقیت شیمی درمانی در مراحل آغازین فقط در 10% تا 20% بیماران لوسمی لنفوبلاستیک حاد، سرطان کاملاً از بین می‌رود در ما بقی موارد، بعد از کسب یک بهبودی نسبی با شیمی درمانی، سرطان دوباره عود می‌کند(15). چون شیمی درمانی، یکی از درمان‌های مهم و جدی در کنترل لوسمی است، بنابراین بررسی علت‌یابی عدم موفقیت شیمی درمانی و تعیین مکانیسم‌های مولکولی مرتبط با آن در بیماران مبتلا، از اهمیت بالایی برخوردار است. یکی از مکانیسم‌های مقاومت دارویی، خروج دارو از سلول توسط پمپ‌های وابسته به ATP است و MDR1از شناخته شده‌ترین آن‌هاست. ژن MDR1بسیار پلی‌مورفیک است و این پلی‌مورفیسم می‌تواند روی بیان ژن و توالی اسیدهای آمینه در پروتئین‌ها و کارکرد آنها اثر بگذارد(10). در تحقیق حاضر هدف بررسی فراوانی پلی‌مورفیسم G2677T/A ژن MDR1 در کودکان مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد بود و هم چنین ارتباط این پلی‌مورفیسم و پاسخ به درمان مورد بررسی قرار گرفت. در این تحقیق اختلاف آماری معناداری از نظر پلی‌مورفیسم G2677T/A بین گروه کنترل و بیمار مشاهده نشد. بین پلی‌مورفیسم G2677T/A و پاسخ به درمان نیز ارتباط آماری معناداری پیدا نشد. کوین اوریاما و همکاران نیز هیچ اختلاف آماری معناداری از نظر فراوانی پلی‌مورفیسم G2677T/A در دو گروه بیمار و سالم نیافتند(16). وندرهولت و همکاران نشان دادند که واریانت‌های آللی مختلف MDR1با عملکرد این پروتئین همراه نبوده و هیچ گونه ارتباطی با مقاومت به درمان ندارد(17). مشابه این یافته‌ها در مطالعه‌های سایر محققین بر روی بیماران مبتلا به سرطان‌های دیگر نیز گزارش شده است(18). در حالی که گرین و همکاران نشان دادند که فراوانی ژنوتیپ G2677T/A با مقاومت به درمان ارتباط داشته به گونه‌ای که بیماران لوسمی با ژنوتیپ 2677G/G بقای کمتری نسبت به دیگر ژنوتیپ‌ها دارند(19). در این رابطه ونگ و همکارانش در یک مطالعه متا آنالیز نشان دادند که این پلی‌مورفیسم با خطر در بروز برخی سرطان‌ها همراه بوده است(20). شایع‌ترین پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی، G2677T است و منجر به تعویض اسید آمینه آلانین (Ala) به سرین (Ser) میشود که در ناحیه داخل غشایی قرار دارد. موتاسیون 2677G>T/A ، منجر به یکی از دو تغییر آمینو اسیدی میشود که باهم متفاوت هستند.G2677T که در آن اسید آمینه سرین جایگزین آلانین میشود و فراوانی بیشتری نسبت به پلی‌مورفیسم G2677A دارد که در آن ترئونین جایگزین آلانین میشود. در این نوع پلی‌مورفیسم، تغییر نوکلئوتیدی باعث تبدیل شدن یک اسید آمینه به یک نوع دیگر میشود. این تغییر نوکلئوتیدی باعث توقف
ریبوزوم، تاخیر در حرکت tRNA و در نتیجه باعث تغییر تاخوردگی پروتئین میشود. این جایگاه توقف در ناحیه‌ای قبل از ناحیه بین غشایی دومین نهم و دومین دهم پروتئین P-گلیکوپروتئین رخ می‌دهد. این تغییر در موقعیت 893، روی فعالیت آدنوزین تری فسفاتازی ناشی از ورود دارو مؤثر است. تاخوردگی هم زمان دو دومین با فعالیت آدنوزین تری‌فسفاتازی MDR1 برای عملکرد پروتئین ضروری است. باید توجه داشت که بیان و عملکرد MDR علاوه بر پلی‌مورفیسم، به عوامل دیگری مانند تقویت ژنی و دمتیلاسیون پروموتر نیز بستگی دارد. با توجه به نتایج مطالعه‌های انجام شده، نقش این پلی‌مورفیسم در بیان ژن MDR1 و پاسخ به درمان هنوز مورد سؤال است. لذا به نظر می‌رسد علاوه بر بررسی بیشتر و مطالعه حجم نمونه بیشتر باید جنبه‌های دیگر مانند تقویت ژنی نیز در این بیماران مورد بررسی قرار بگیرد. سؤالهای زیادی در ارتباط با سازوکارهای مقاومت سلولهای سرطانی به شیمی درمانی باید پاسخ داده شود و بررسیهای بیشتری در مورد شناخت سازوکارهای مقاومت چند دارویی در آزمایشهای بالینی باید صورت پذیرد. بنابراین واضح است که هنوز درک بهتری از سازوکارهای دخیل در مقاومت دارویی به منظور تکوین استراتژیهای درمانی جدید لازم می‌باشد.
نتیجه‌گیری
در این مطالعه بین گروه کنترل و بیماران از نظر فراوانی آلل‌ها و ژنوتیپ تفاوت معناداری وجود نداشت. هم چنین بین بیماران پاسخ دهنده به درمان و بیماران مقاوم به درمان از نظر فراوانی ژنوتیپ تفاوت معناداری دیده نشد.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله از پرسنل محترم مرکز هماتولوژی و انکولوژی بیمارستان کودکان مفید و پرسنل محترم آزمایشگاه ژنتیک پزشکی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک جهت همکاری صمیمانه در انجام تحقیق قدردانی می‌گردد.
|
|
| ارسال پیام به نویسنده مسئول |
|
|
|
| ارسال نظر درباره این مقاله |
|
|
|
