نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله: بيوشيمي انتشار: 1392/6/2
متن کامل: (6440 مشاهده)
اثر آنزیم فعال‌کننده پروترومبین جدا شده از سم مار جعفری ایرانی بر روی هموستاز خون
مهدی بابایی1، حسین ذوالفقاریان2، حسین سلمانی‌زاده1، عباس زارع میرک آبادی3، حافظه علیزاده1
چکیده سابقه و هدف زهر مار جعفری(Echis carinatus) مخلوط پیچیده‌ای از مواد سمی است. این زهر شامل متالوپروتئازهایی است، که فعال‌کننده قویپروترومبین هستند. این ترکیبات بر سیستم انعقاد خون اثر دارند و باعث ایجاد لخته خون می‌شوند. در این مطالعه، مکانیسم اثر سم مار جعفری ایرانی روی پروتئین‌های پلاسمای انسان (پروترومبین یافیبرینوژن) و اثر انعقادی آن مورد بررسی قرار گرفت. هدف از این مطالعه، بررسی خاصیت انعقادی مار جعفری ایرانی و اثرات آن در انعقاد خون و خالص‌سازی عامل مؤثر در انعقاد بود. مواد و روش‌ها در این مطالعه تجربی، زهر خام از گونه مار جعفری ایرانی انتخاب شد. فعال‌کننده پروترومبیناز زهر خام این مار با ترکیبی از روش‌های کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون،تعویض یونی و HPLC فاز معکوس، خالص شد. نمونه خون از 20 فرد سالم گرفته شد و برای آزمایشهای PT و FT مورد استفاده قرار گرفت. یافته‌ها سم خام مار جعفری ایرانی باعث تسریع انعقاد خون شد به طوری که در غلظت زهر mg/mL 1 ، لخته در 64/0 ± 6/8 ثانیه در مقایسه با پلاسمای شاهد(59/0 ± 4/13 ثانیه) تشکیل شد. نتیجه گیری زهر مار جعفری ایرانی شامل فاکتورهای انعقادی است. به نظر می‌رسد فراکسیون تخلیص شده از مار جعفری ایرانی شبیه به پروتئین انعقادی باشد، که قادر به تسریع انعقاد خون انسان در شرایط آزمایشگاهی است. کلمات کلیدی:انعقاد خون، فعال‌کننده پروترومبین(سم مار جعفری)، سم
تاریخ دریافت : 20/10/90 تاریخ پذیرش : 30/1 /91
1- کارشناس ارشد بیوشیمی ـ دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات ـ باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان ـ تهران ـ ایران 2- مؤلف مسؤول: PhD بیوشیمی بالینی ـ استادیار مؤسسه تحقیقاتی واکسن و سرم‌سازی رازی ـ کرج ـ ایران ـ صندوق پستی: 148-31975 3- PhD بیوشیمی ـ مؤسسه تحقیقاتی واکسن و سرم‌سازی رازی ـ بخش جانوران سمی ـ کرج ـ ایران
مقدمه سم مار جعفری، مخلوطی از پروتئینهاست که آبشار انعقادی خون را تحت تاثیر قرار داده و موجب عرق کردن طاقت‌فرسا و خونریزی شدید می‌شود. از جمله این پروتئین‌ها، پروترومبین است که فعال‌سازی پروترومبین برای بلوغ و تبدیل به ترومبین به وسیله فعالیت کمپلکس پروتئولیتیک پروترومبیناز رخ میدهد و شامل یک فاکتور سرین پروتئیناز Xa و کوفاکتورهای فاکتور V و یونهای 2Ca+ و فسفولیپیدها است. تعدادی از فعال‌کنندههای پروترومبین به صورت خارجی در سم مار یافت شدهاند. سم مار جعفری باعث انعقاد خون می‌شود. بیش از 50 ماده مختلف در انعقاد خون مؤثرند. هدف پایانی انعقاد این است که آنزیم ترومبین به وجود آید. این آنزیم است که در پایان فیبرینوژن را به فیبرین تبدیل می‌کند. رشته‌های فیبرین پس از اتصال به یکدیگر، شبکه‌ای در محل آسیب دیده ایجاد می‌کنند(1). بعضی از این مواد که فاکتور انعقادی نام دارند، موجب پیشبرد انعقاد می‌شوند، در حالی که بعضی دیگر با نام فاکتور ضد انعقادی، موجب توقف فرآیند انعقاد می‌شوند. منعقد شدن یا نشدن خون به درجه تعادل این دو گروه ماده بستگی دارد. در حالت طبیعی، مواد ضد انعقادی برتری داشته و خون منعقد نمی‌شود، اما هنگامی که رگی پاره شود مواد انعقادی در ناحیه آسیب دیده فعال شده، بر مواد ضد انعقادی غلبه می‌کنند و در نتیجه یک لخته خون تشکیل می‌گردد .از نظر بالینی سمهای منعقدکننده خون اگر به مقدار زیاد و به تدریج و آهسته وارد جریان خون شوند، خاصیت انعقاد خون را از بین میبرند یعنی خون را دفیبرینه نموده باعث عدم انعقاد خون میگردند. اگر مقدار این سم زیاد باشد و به سرعت وارد جریان خون گردد باعث انعقاد خون در عروق شده و سرانجام مرگ فرا می‌رسد(3، 2). سالانه گزارش‌های زیادی از مارگزیدگی منتشر می‌شود. به همین علت نیز شناسایی و بررسی عوامل موجود در سم مار از اهمیت بسیار زیادی برخوردار بوده و مورد توجه دانشمندان می‌باشد. آنزیم‌های فعال کننده پروترومبین(شبیه به اکارین ) بـه عنـوان یـک ابزار مهم در آزمایشگاهها برای آنالیز خون بیمارانی که دچار بیماری کبدی شدهاند، مورد استفاده قرار میگیرند. ارزش این آنزیم در این است که بر خلاف فاکتور Xa میتواند مستقلاً بدون نیاز به هیچ کوفاکتوری حتی بدون نیاز به فاکتور V بر روی پروترومبین کربوکسیله شده و یا کربوکسیله نشده عمل نماید. بنابراین حتی اگر در فاکتور V اختلالی وجود داشته باشد، میتوان با این آنزیم میزان موجودی پروترومبین را در خون بیماران اندازهگیری نمود. این فعال کننده‌ها به 4 گروه بر مبنای نیازمندی و احتیاج به کوفاکتورهایشان طبقهبندی شدهاند. فعال‌کنندههای پروترومبین گروه A و B متالوپروتئیناز هستند، در حالی که فعال‌کنندههای پروترومبین گروه C و D سرین پروتئیناز می‌باشند. فعال‌کنندههای پروترومبین گروه C به فاکتور موجود در پستانداران یعنی Xa فاکتور کمپلکس V شباهت دارند در حالی که فعال‌کنندههای گروه D به لحاظ ساختمانی و عملکردی مشابه فاکتور Xa اند(8-4). امروزه روش‌های مختلفی برای تشخیص و جداسازی آنزیم‌های سم مار به کار گرفته می‌شود که از جمله معمول‌ترین و پرکاربردترین آن‌ها روش کروماتوگرافی و الکتروفورز است(14-9). این بررسی امکان تشریح و توصیف یک سری جزییات پیرامون اطلاعات موجود درباره فعال‌کنندههای پروترومبین که بر روی هموستاز خون مؤثرند و سؤالاتی را که بی‌پاسخ ماندهاند، به طور برجسته فراهم می‌کند.
مواد و روش‌ها در یک مطالعه تجربی، سم مار جعفری لیوفیلیزه شده از بخش جانوران سمی مؤسسه واکسن و سرم‌سازی رازی تهیه شد و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری گردید. سفادکس G-75 ، DEAE- سفاروز و ستون HPLCC-18 فاز معکوس از فارماسیا(سوئد) خریداری شد. کلسیم کلراید، کیت PT و FT (محصولی از دیاگنوستیک - آمریکا) از شرکت اهورا طب روز تهیه گردید.
نمونه خون: نمونـه خـون از 20 فـرد سالم، جوان و از هر دو جنس (بدون هیچ سابقه بیماری خونی) گرفته شد. نمونه خونی این افراد به مدت 15 دقیقه و در rpm 3000 سانتریفوژ شد، پلاسمای به دست آمده جدا شد و برای آزمایشهای PT و FT مورد استفاده قرار گرفت.
ارزیابی زمان پروترومبین (PT): 100 لاندا از پلاسمای سیتراته(با نسبت 9/1) را به لوله اضافه کرده و 2 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه نمودیم. سپس 200 لاندا ترومبوپلاستین(ویال حاوی ترومبوپلاستین و کلسیم) را به لوله محتوی پلاسما اضافه کرده و به محض دیدن لخته، زمان را متوقف کردیم. زمان نرمال برای این آزمایش 14-12 ثانیه می‌باشد(17-15).
ارزیابی زمان فیبرینوژن(FT): نمونه شامل 8/1 میلی‌لیتر خون بر روی 2/0 تری سدیم سیترات 109/0 مولار (2/3%) بود. خون را به مدت 15 دقیقه در rpm 3000 سانتریفوژ کردیم و پلاسما را به یک لوله پلاستیکی منتقل نمودیم. 1/0 میلی‌لیتر از پلاسما را برداشته و 9/0 میلی‌لیتر از بافر رقیق‌کننده را به آن اضافه کرده و مخلوط نمودیم(رقت 1:10 از پلاسما). 2/0 میلی‌لیتر از پلاسمای رقیق شده را به یک لوله شیشه‌ای منتقل کرده و برای مدت 2 دقیقه در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. پس از گذشت 2 دقیقه از انکوباسیون، مقدار 1/0 میلی لیتر از معرف حاوی ترومبین را به پلاسمای رقیق شده اضافه کرده و هم زمان با دیدن اولین علایم تشکیل لخته، زمان را یادداشت کردیم(21-18).
اندازهگیری میزان پروتئین زهر خام مار جعفری: مقدار پروتئین موجود در محلول زهر خام، با استفاده از BSA (Bovin Serum Albumin) به روش پروتئین سنجی لوری تعیین شد(22).
اندازهگیری فعالیت انعقادی زهر خام: از 10 میلی‌گرم زهر مار جعفری، غلظت mg/mL 1 تهیه گردید. این غلظت برای بررسی خاصیت انعقادی سم مار جعفری، مورد آزمایش PT قرار گرفت. جداسازی و خالص‌سازی عامل فعال‌کننده پروترومبین: خالص‌سازی عامل فعال‌کننده پروترومبین با استفاده از روش‌های کروماتوگرافی انجام گرفت. جهت جداسازی فاکتور انعقادی، 50 میلی‌گرم زهر خام مار جعفری در 4 میلی‌لیتر بافر آمونیوم استات(20 میلی‌مولار با 8/6 pH=) حل شد و به مدت 15 دقیقه در rpm 14000 سانتریفوژ گردید. ناخالصی‌های سم با استفاده از میکروفیلتر 45/0 حذف گردید. پس از تعادل ستون، محلول پروتئینی حاصل به ستون(cm 3 * 200) سفادکس G-75 تزریق شد. ستون ژل کروماتوگرافی با بافر آمونیوم استات با 8/6 pH= به تعادل رسید و با همین بافر بعد از تزریق نمونه شسته شد. جذب هر فراکسیون در طول موج 280 به دست آمد و پیک‌های مربوط به آن رسم شد. تمامی فراکسیون ها 24 ساعت مقابل 10 حجم آب مقطر دیالیز شدند و در 4 درجه سانتی‌گراد تغلیظ گردیدند. پس از تغلیظ، حجم پیک‌ها به دقت اندازهگیری شد. آزمایش PT برای 5 پیک(فراکسیون) با غلظت مشابه، انجام گرفت. در مرحله بعد فراکسیون انعقادی در 4 درجه‌سانتی‌گراد در مقابل بافر تریس-HCl 05/0 میلی‌مولار(2/8 pH=) دیالیز گردید. این فراکسیون به ستون(cm 25 * 5/1)کروماتوگرافی تعویض یونیDEAE ـ سفاروز، وارد شد و ستون با بافر تریس -HCl 05/0 میلی‌مولار(2/8 pH=) به تعادل رسید. ستون را با گرادیانی از غلظت نمک از صفر تا 5/0 میلی‌مولار شستشو دادیم. ساب فراکسیونی که فعالیت انعقادی از خود نشان داد، دیالیز شد و بعد از دیالیز به ستون HPLCC-18 فاز معکوس تزریق گردید. ستون با محلول A (آب،1/0% تری فلورواستیک اسید) به تعادل رسید و با گرادیان غلظتی از محلول B (استونیتریل، 1/0% تری فلورواستیک اسید) از صفر تا 100% با سرعت جریان 3/0 میلی لیتر در دقیقه، طی 55 دقیقه شستشو داده شد(24، 23). در نهایت پیک‌ها در 280 نانومتر مشاهده شدند و فراکسیون دارای فعالیت انعقادی تشخیص داده شد. انحراف معیار(SD) و p-value در مورد داده‌های آزمایشهای انجام شده با استفاده از نرم‌افزار mini tab انجام گرفت، فرض H0 رد و H1 تایید شد و 05/0 p≤ معنادار در نظر گرفته شد. یافته‌ها با توجه به زمان انعقاد پلاسمای نرمال(فاقد زهر)، مشخص شد که زهر خام مار جعفری پلاسما را سریعاً لخته می‌کند، بنابراین این زهر ویژگی انعقادی (procoagulant) دارد. بـا اضافه کردن سم با غلظت mg/mL 1 ، لخته به سرعت تشکیل شد. بدین ترتیب وجود عامل انعقادی در زهر مار جعفری اثبات گردید.
جدول 1: آزمایش PT برای غلظت mg/mL 1 سم مار جعفری ایرانی
غلظت زهر
میانگین PT(s)*
توضیحات
(mg/mL) 1
64/0 ± 6/8
لخته کاملاً تشکیل می‌شود.
Normal PT (بدون وجود زهر)
59/0 ± 4/13
لخته کاملاً تشکیل می‌شود.
* 05/0 p value < ، 4 n=
در مرحله بعد آزمایش PT و FT نرمال برای 6 نمونه خـون انجـام گرفـت و نتایـج مـدت زمان میانگین آن برای آزمایش s 8/12 = PT (001/0 p<) و s 7/13 = FT (01/0 p<) به دست آمد.
آزمایش PT را با غلظت mg/mL1 بر روی پلاسمای
خون 6 نمونه انجام دادیم. نتایج میانگین مدت زمان آزمایش PT در این حالت 2/9 ثانیه(005/0 p<) به دست آمد.
جداسازی سم اکیس کاریناتوس به وسیله کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون: با استفاده از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون، 5 پیک (فراکسیون) به دست آمد که آن‌ها را به ترتیب F1 تاF5 نام‌گذاری کردیم. طبق نمودار 1، فراکسیون‌های F1 تاF5شامل پروتئین‌هایی است که به ترتیب از وزن مولکولی بالا به پایین از ستون ژل کروماتوگرافی خارج می‌شوند. فراکسیونF1 بزرگترین و حاوی بیشترین میزان پروتئین بود.
بررسی فعالیت انعقادی فراکسیون‌های به دست آمده از ژل کروماتوگرافی: با انجام آزمایش PT بر روی فراکسیون‌های F1-F5، فراکسیون انعقادی مشخص شد. فراکسیون F1 خاصیت انعقادی بیشتری نسبت به سایر فراکسیون‌ها داشت. زمان تشکیل لخته با وجود فراکسیون F1 در پلاسما 34/18 ثانیه (02/0 p< و 16/1 ±SD=) بود. این زمان برای فراکسیون F2 در حدود 5/35 ثانیه (04/0p < و 41/2SD = ±) و برای سایر فراکسیون‌ها بیشتر از 5 دقیقه به دست آمد.
نمودار 1: ژل کروماتوگرافی mg 50 زهر خام با استفاده از سفادکس 75-G
نمودار 2: جذب تفکیک فراکسیون F1 توسط کروماتوگرافی تبادل یونی
نمودار 3: جداسازی ساب فراکسیون F1B به وسیله HPLC
جداسازی ساب فراکسیون‌های F1 حاصل از ژل فیلتراسیون به وسیله کروماتوگرافی تعویض یونی: فـراکسیون F1 کـه خـاصیـت انعقـادی داشــت، بـرای جداسـازی بیشتر بر روی ستونDEAE (DE-52)- سفـاروز برده شد. از کروماتوگرافی تعویض یونی F1 ، 8فراکسیون F1A تا F1H به دست آمد(نمودار 2).
بررسی خواص انعقادی ساب فراکسیون‌های F1 : خاصیـت انعقـادی سـاب فـراکسیون‌هـای F1 بـا انجام آزمایش PT بررسی شد(جدول 2). طبق جدول 2، ساب فراکسیون‌های F1A و F1B بیشترین خاصیت انعقادی را دارند، به طوری که حتی F1B زمان انعقاد پایین‌تری نسبت به سم خام داشت.
جداسازی ساب فراکسیون F1B به وسیله کروماتوگرافی HPLC : با استفاده از HPLC ، 5 پیک به دست آمد، که فراکسیون‌های F1B1 تا F1B5 نامیده شدند(نمودار 3). پیک‌هـای بـه دست آمده در این مرحله مجزا بودند و فراکسیون اول، بیشینه مقدار جذب را داشت. این فراکسیون‌ها با استفاده از آزمایش PT، ارزیابی شدند.
جدول 2: زمان فعالیت انعقادی ساب فراکسیون‌های F1
متوسط PT*
نمونه
s 14
Fraction F1 A
s 8
Fraction F1 B
s 70
Fraction F1 C
s 52
Fraction F1 D
s 90
Fraction F1 E
s 56
Fraction F1 F
بیشتر از 5 دقیقه
Fraction F1 G
s 95
Fraction F1 H
05/0 p-value < ، 4 n=*
بررسی فعالیت انعقادی فراکسیون‌هایF1B : با استفاده از آزمایش PT بر روی فراکسیون‌های F1B1 تا F1B5 مشخص شد، فراکسیون چهارم(یعنی فراکسیون F1B4) خاصیت انعقادی دارد. با اضافه کردن این فراکسیون به پلاسما، لخته در 3 ثانیه تشکیل شد(05/0 p<)، به طوری که زمان انعقاد پلاسما با اضافه کردن این فراکسیون به 3 ثانیه کاهش یافت. در نتیجه فراکسیون F1B4 را میتوان فراکسیون انعقادی در نظر گرفت.
بحث این تحقیق روشی مؤثر و تکرارپذیر را جهت جداسازی فاکتورهای انعقادی و ضد انعقادی موجود در زهر مار جعفری ایران ارایه میدهد. زهر مارهای خانواده ویپریده از جمله مار جعفری، منبع غنی از ترکیبات جدیدی است که کاربردهایی در پزشکی و بیوشیمی دارد(26). به نظر می‌رسد که سم مار جعفری ایران، در انعقاد خون تاثیر داشته باشد، که ممکن است باعث برخی اختلالات هموستاتیک در قربانیان شود. با توجه به مزیت‌های آزمایشهای انعقادی به خصوص آزمایش PT (زمان کمتر پاسخ‌دهی و مدل‌سازی بهتر شرایط in vivo)، نشـان داده شـد کـه زهـر مار جعفری در حالت کلی، خاصیت انعقادی زیادی دارد. از اعداد به دست آمده از آزمایشهای انجام گرفته بر روی 6 نفر میتوان نتیجه گرفت که همه افراد مورد آزمایش سالم بودند چون زمان به دست آمده برای هر یک ازآنها در محدوده طبیعی زمان آزمایشهای PT ، 14-10 ثانیه و FT ، 15-5 ثانیه بود. برای بررسی خاصیت انعقادی سم مار جعفری، آزمایش PT را در حضور غلظت mg/mL1 بر روی پلاسمای خون 6 نمونه انجام دادیم. نتایج میانگین مدت زمان آزمایش PT در این حالت باز هم نمایانگر خاصیت انعقادی زهر خام مار جعفری ایرانی بود(ثانیه2/9 PT=). بدین ترتیب وجود عامـل انعقـادی در زهـر مار جعفری اثبات شده و این زهر جهت جداسازی عامل انعقادی انتخاب شد. با بررسی نتایج بالا، در می‌یابیم که سم مار جعفری باعث تسریع انعقاد خون می‌شود، زیرا در هنگام اضافه کردن سم مار جعفری به پلاسما، زمان آزمایش PT آن نسبت به حالت طبیعی آزمایش PT کاهش می‌یابد. محدوده نرمال برای مقادیر فیبرینوژن در پلاسمای انسان معمولاً بین mg/dL 400-200 می‌باشد. در مواردی که سطح فیبرینوژن در پلاسما از حداقل محدوده نرمال پایین‌تر رفته باشد، میتوان یکی از حالت‌های فیبرینولیز، مارگزیدگی، DIC و سایر حالاتی که در آن‌ها مقدار فیبرینوژن خون کاهش می‌یابد را در نظر گرفت. طبق داده‌های به دست آمده در هر یک از این آزمایش‌ها، میتوان نتیجه گرفت که در صورت مار گزیدگی و یا با وجود غلظت‌های سم، مقداری فیبرینوژن تخریب شده و در نتیجه فیبرینولیز اتفاق می‌افتد(30-25). فراکسیون‌های به دست آمده از ژل کروماتوگرافی، دارای خواص متفاوتی هستند(نمودار 1). این تفاوت عمل در فراکسیون‌های F1 تا F5 به دلیل وجود آنزیم‌های متفاوت در این فراکسیون‌هاست. به طوری که در فراکسیون F1 ، آنزیم‌های انعقادی(فعال‌کننده پروترومبین نظیر اکارین) وجود دارد و فراکسیون‌های دیگر میتواند شامل آنزیم‌های ضد انعقادی(نظیر PLA2) و پروتئین‌های دیگر باشد. در سـال 1996، دیسـوک و همکارانـش بـا تــرکیبی از روش‌هـای ژل کـروماتوگرافی و کروماتوگرافـی تعویــض یونی، موفق به خالص‌سازی آنزیم CA-1 در محدوده kD 62 از زهر مارجعفری شدند. مراحل انجام تحقیق تا حدود زیادی با کار تحقیقاتی ما مطابقت داشت(13). در اثر مار گزیدگی و یا تزریق سم مار جعفری به پلاسما، زمان انعقاد خون پایین می‌آید. این حالت در مورد فراکسیون F1 به طور واضح صدق نکرد، با توجه به این که فعالیت انعقادی، کاهش در زمان انعقاد در مقایسه با نمونه کنترل می‌باشد. همان طوری که مشخص است فراکسیون F1 خاصیت انعقادی بیشتری دارد، به طوری که فراکسیون F1 زمان انعقاد پایین‌تری نسبت به فراکسیون F2 و F3 داشت. از طرفی دیگر ساب فراکسیون به دست آمده از کروماتوگرافی تعویض یونی(F1B)، به سرعت زمان انعقاد را کاهش میدهد و لخته ایجاد می‌کند. این کاهش مدت زمان آزمایش PT، در ساب فراکسیون F1B4 حاصل از HPLC نیز مشاهده شد. با انجام آزمایش PT بر روی فراکسیون‌های حاصل از HPLC ، مشخص می‌شود که هر چه پروتئین مورد نظر خالص‌تر باشد، تاثیر آن در انعقاد خون شدیدتر می‌شود. زهر مار ایرانی(Agkistrodon halys) توسط قربان‌پور و همکارانش مورد بررسی قرار گرفت(23). توسط ژل فیلتراسیون، زهر خام به پنج پیک تقسیم شد(AH1-AH5). همه فراکسیون‌ها برای انعقاد مورد آزمایش قرار گرفتند و فراکسیون AH1 برای انعقاد مثبت بود. خالص‌سازی بیشتر توسط کروماتوگرافی تبادل یونی انجام شد. در این مرحله نیز فراکسیون AH14 فعالیت انعقادی نشان داد. خالص‌سازی نهایی توسط HPLC انجام شد که AH143 با وزن مولکولی kD 30 ، فعالیت پروتئولیتیکی انعقاد نشان داد. این تحقیق تا حدود زیادی با کار تحقیقاتی انجام گرفته و نتایج به دست آمده برای انعقاد مطابقت داشت. آنزیم CA-1، فعال کننده پروترومبین است که از سم مار جعفری توسط دیسوک و همکارانش جداسازی شد و باعث تسریع انعقاد خون گردید. عمل این آنزیم شبیه به آنزیم استخراجی ما می‌باشد(13).
نتیجه‌گیری در این بررسی زهر مار جعفری به دلیل وجود فعالیت‌های انعقادی انتخاب شد و با توجه به روش‌های کروماتوگرافی، پروتئین‌های مختلف موجود در آن خالص‌سازی و جداسازی گردید. در نهایت عامل فعال‌کننده پروترومبین، پروتئینی که باعث تسریع انعقاد خون می‌شود، خالص‌سازی شد. عمل این پروتئین تا حدود زیادی شبیه به اکارین است، که میتوان از این آنزیم در اعمال جراحی و برای آنالیز خون بیمارانی که دچار بیماری کبدی شدهاند، استفاده کرد.
تشکر و قدردانی از کارکنان محترم مؤسسه رازی به ویژه بخش سروتراپی و جانوران سمی کمال تشکر را دارم. از آقای مهندس عسکری و خانم دکتر خامه چیان به خاطر راهنمایی‌هایشان سپاسگزارم.
Babaie M, Zolgagharian H, Salmanizadeh H, Zare Mirakabadi A, Alizadeh H. Effect of a protrombin activator isolated from Iranian Echis carinatus venom on hemostasis. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2013; 10 (2) :173-181 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-773-fa.html
بابایی مهدی، ذوالفقاریان حسین، سلمانی‌زاده حسین، زارع میرک آبادی عباس، علیزاده حافظه. اثر آنزیم فعال‌کننده پروترومبین جدا شده از سم مار جعفری ایرانی بر روی هموستاز خون. فصلنامه پژوهشی خون. 1392; 10 (2) :173-181
