چکیده سابقه و هدف سلول‌های بنیادی خون بند ناف، با تعداد بالای سلول، کاندیداهای مناسبی برای پیوند در بیماری‌های خوش‌خیم و بدخیم می‌باشند. اما اکثراً تعداد محدودی دارند بنابراین تکثیر این سلولها در محیط آزمایشگاه با بیوراکتور سوسپانسیونی هم‌زن‌دار انجام شد. مواد و روش‌ها در یک مطالعه کاربردی، سلول‌های تک هسته‌ای خون بند ناف به میزان 106 × 07/1 سلول در میلی‌لیتر در حجم 206 میلی‌لیتر در بیوراکتور سوسپانسیونی با هم‌زن رفت و برگشتی و گروهی دیگر با همان تعداد در 2 میلی‌لیتر محیط کشت داخل فلاسک کشت داده شدند. دوره کشت هر دو گروه 14 روز به طول انجامید. در روزهای 0 ، 3 ، 7 و 14 ، نمونه‌گیری انجام شده و سلولها مورد آنالیز قرار گرفتند. یافته‌ها در ابتدای کشت، سلول‌های تمایز یافته حذف(روز 3) و سپس تا هفته دوم، افزایش یافتند(به ترتیب در بیوراکتور از 106 * 42/0 در هر میلی‌لیتر به 106 * 2/1 و در کشت استاتیک از 106 * 6/0 به 106 * 9/2 رسیدند). سلول‌های CD34+ پس از 14 روز، در بیوراکتور 86/6 برابر و در کشت استاتیک 07/1 برابر بود و نیز قدرت تشکیل کلنی در بیوراکتور به طور معناداری افزایش داشت. نتیجه گیری سلول‌های بنیادی خونساز در این بیوراکتور با حفظ خواص بنیادی تکثیر می‌یابند. با این وجود، احتمالاً به دلیل افزایش استرس برشی(Shear stress) در محیط، تعداد کل سلولها افزایش نمی‌یابد و نیازمند مطالعه‌های بیشتر می‌باشد. کلمات کلیدی: خون بند ناف، سلول‌های بنیادی خونساز ، بیوراکتور
تاریخ دریافت : 31/2/91 تاریخ پذیرش : 29/6/91
1- کارشناس ارشد زیست‌شناسی سلولی و مولکولی ـ گروه سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی ـ پژوهشکده فناوری و زیست‌شناسی سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران 2- مؤلف مسؤول: PhD ایمونولوژی ـ استادیار گروه زیست پزشکی ترمیمی ـ پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 4644-19395
3- کارشناس ارشد زیست‌شناسی تکوینی ـ گروه سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی ـ پژوهشکده فناوری و زیست‌شناسی سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران 4- کارشناس علوم آزمایشگاهی ـ گروه سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی ـ پژوهشکده فناوری و زیست‌شناسی سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران 5- کارشناس بیوتکنولوژی ـ گروه سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی ـ پژوهشکده فناوری و زیست‌شناسی سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران
مقدمه سلول‌های بنیادی خونساز(HSCs)که توان خود نوزایی (S.R = Self Renewal) و پتانسیل بالایی در تبدیل به سلول‌های خونی و غیر خونی دارند، از جمله کاندیدهای مناسب برای درمان بسیاری از بیماری‌های خونی چون لوسمی، تالاسمی، کم خونی‌های مادرزادی، نقص‌های سیستم خونساز و سیستم ایمنی، بیماری‌های غیر خونی چون آلزایمر، آسیب‌های مغزی ـ نخاعی و سایر بیماری‌ها می‌باشند(1). این سلولها در مغز استخوان، خون محیطی، کبد جنینی و خون بند ناف یافت می‌شوند(2). از میان تمامی منابع ذکر شده، خون بند ناف به دلیل سهولت جمع‌آوری، عدم وجود خطر برای فرد دهنده، کاهش رد ایمونوژنیک و GVHD (Graft Versus Host Disease) در فرد گیرنده و عدم آلودگی به ویروس‌های CMV و EBV نسبت به سایر منابع بهتر است(5-3). با این وجود محدودیت عمده این خون، تعداد کم سلولها است که معمولاً پاسخگوی نیاز افراد بالغ نیست(7، 6). به عبارتی برای درمان مناسب، تعداد حداقل 107 * 3-1 از سلول هسته‌دار به ازای هر کیلو وزن بدن مورد نیاز است(8). امروزه استفاده از روش‌هایی چون پیوند 2 واحد خون بند ناف و یا ازدیاد سلولها با روش‌های تکثیر سلولی(Ex vivo Expansion) بر این مشکل غلبه کرده‌اند(10، 9). از جمله محدودیت‌های کشت استاتیک می‌توان به عدم یکنواختی در توزیع مواد غذایی و گازها در مایع کشت، محدودیت در کنترل O2 ، pH و متابولیت‌ها و باز بودن شرایط کشت اشاره نمود(11). امروزه با استفاده از بیوراکتورها می‌توان به ازدیاد کنترل شده سلول ها با کمترین دست‌ورزی اقدام نمود. عملکرد بیوراکتورها با توجه به نوع سلولها و شکل بیوراکتور و هم‌زن آن متفاوت است و به منظور ازدیاد سلول‌های غیر چسبنده(از جمله HSC ها)، از بیوراکتور سوسپانسیونی هم‌زن‌دار از نوع چرخشی (Stirrer) استفاده می‌شود(12). در این نوع بیوراکتورها، هم‌زن در یک سطح افقی حرکت چرخشی داشته و جریان دورانی را در محیط کشت ایجاد می‌نماید که منجر به افزایش استرس برشی(Shear Stress) می‌شود (15-13). در این مطالعه به منظور کاهش استرس بر سلولها، از یک بیوراکتور سوسپانسیونی مجهز به هم‌زن مغناطیسی با حرکت رفت و برگشتی استفاده گردید تا اثر تغییر هم‌زن در افزایش تعداد سلولها، پتانسیل تشکیل کلنی و نیز بیان ژن‌های بنیادینگی نیز مورد بررسی قرار گیرد. هم‌چنین سلولها در کشت استاتیک و بیوراکتور با یکدیگر نیز مقایسه شدند.
مواد و روش‌ها 1- جداسازی و کشت سلول‌های تک هسته‌ای خون بند ناف: مطالعه انجام شده از نوع کاربردی بود. واحدهای خون بند ناف از بانک عمومی خون بند ناف رویان تهیه گردید. اهداکنندگان خون بند ناف، مادران سالم(بر اساس پرسشنامه پزشکی فاقد بیماری‌های زمینه‌ای و ژنتیکی و بر اساس آزمایش‌های سرولوژی، عاری از بیماری‌های ویروسی CMV ، HTLV I/II ، HBV ، HCV ، HIV و سیفلیس) با دوره حاملگی کامل بودند. به منظور حذف گلبول‌های قرمز، هر 5 میلی‌لیتر خون کامل با 1 میلی‌لیتر هیدروکسی اتیل استارچ(آلمان - GmbH) مخلوط و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. سپس سلول‌های تک هسته‌ای خون بند ناف (UCB-MNC) با استفاده از شیب غلظت لنفودکس(دیاگنوستیکا) جدا گردید(16). سلول‌های جدا شده توسط محیط حاوی 10% سرم جنین گاو(Fetal Bovin Serum)(گیبکو) شستشو داده شدند و تعداد و میزان سلول‌های زنده (Viability) با استفاده از لام نئوبار و تریپان بلو 4/0% تعیین گردید. تعداد 106×1سلول در میلی‌لیتر، به محیط کشت IMDM شامل FBS (10%)، ال‌گلوتامین(آلمان، گیبکو)(mM 2) و پنی‌سیلین/ استرپتومایسین (آلمان، گیبکو)(U/mL 100/ng/mL 100) اضافه گردید. سپس به محیط کشت Flt3L و SCF هر کدام به میزان ng/mL 150 G-CSF و GM-CSF به میزان ng/mL 15 ، اینترلوکین 3 و TPO به میـزان ng/mL 10 و EPO بـه میـزان ng/mL 30 (همـه از شرکت R&D آمریکا) اضافه و کشت به مدت 14 روز انجام گرفت.
شکل 1: A : هم‌زن fish tail به کار رفته در بیوراکتور. B : بیوراکتور سوسپانسیونی
در کشت استاتیک، سلولها در حجم 2 میلی‌لیتر به پلیت 6 خانه منتقل و در انکوباتور با دمای ºC 37 و 5% CO2 کشت شدند. در طول 14 روز، 3 بار تعویض محیط انجام شد. در کشت با استفاده از بیوراکتور، سلولها در حجم 200 میلی‌لیتر در بیوراکتور سوسپانسیونی با ظرفیت 500 میلی‌لیتر، با قابلیت کنترل pH، O2 و دما کشت داده شدند(دستگاه MINIFOR، شرکت لامبدا، سوئیس). در این سیستم از هم‌زن صفحه‌ای(fish tail disc) با حرکت بالا و پایین با سرعت Hz 1 استفاده گردید(شکل 1). کنترل دما و pH به ترتیب بر روی 37 درجه سانتی‌گراد و 2/7(با دقت 1/0) تنظیم شد. کنترل O2 حل شده در محیط با سنسور دیگری انجام گردید. تنظیم pH و O2 از طریق وارد کردن گاز CO2 و O2 در محیط صورت گرفت. تعویض محیط در هر دو گروه به صورت هفتگی انجام شد و برای آنالیز سلولها، نمونه‌برداری در روزهای 0، 3، 7 و 14 انجام گرفت.
بررسی ایمونوفنوتیپ سلولها: به منظور بررسی ایمونوفنوتایپینگ سلول‌های کشت‌یافته، در هر دو روش تعداد 106 سلول مورد استفاده قرار گرفت. 10 میکرولیتر از آنتی‌بادی‌های Mouse IgG1 Isotype Control-FITC (فارمین‌ژن)، Mouse IgG1 Isotype Control-RPE (داکو) و Mouse IgG1 Isotype Control-PE-Cy5 (بیوساینس) هم‌زمان به 105 سلول در 100 میکرولیتر PBS در لوله پلی‌استیرن به عنوان ایزوتایپ کنترل سه رنگ و 10 میکرولیتر از آنتی‌بادی‌های Mouse Anti Human CD34-FITC (فارمین‌ژن)، Mouse Anti Human CD38-PE-Cy5 (بیوساینس) و Mouse Anti Human CD 90-RPE (داکو) به همان تعداد سلول در لوله‌ای دیگر به عنوان آزمایش سه رنگ اضافه شد.در لوله پلی‌استیرن دیگری نیز به 105 سلول، 10 میکرولیتر از آنتی‌بادی‌های Mouse IgG1 Isotype Control-PE-Cy5 , Mouse IgG1 Isotype Control-PE (eBioscience 12-4015) به عنوان کنترل دو رنگ و 10 میکرولیتر از آنتی‌بادی‌های Mouse Anti ، Mouse Anti Human CD 34-FITC Human CD 133-PE (ebioscience 12-1338-73) به این تعداد سلول در لوله بعدی به عنوان آزمایش دو رنگ به طور هم زمان اضافه شد. جهت تصحیح میزان هم‌پوشانی رنگ‌های فلورسنس در دستگاه فلوسایتومتر نیز 10 میکرولیتر از آنتی‌بادی‌های CD38-PE.Cy5، CD133-PE، CD90-RPE و CD34-FITC به 105 سلول در چهار لوله جداگانه به صورت تک رنگ اضافه شد. پس از30 دقیقه انکوباسیون در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و اتاق تاریک، 1 میلی‌لیتر از محلول PBS جهت شستشو به لوله‌ها اضافه گردید و پس از 5 دقیقه سانتریفوژ در 1500 دور بر دقیقه، محلول رویی جدا و به رسوب سلولی حاصل 300 میکرولیتر محلول PBS اضافه شد. نمونه‌های آماده شده در دستگاه فلوسایتـومتـری BD (آمریکـا، بکتـون دیکینسـون) FACS Calibur در طول موج 488 نانومتر، با فیلترهای BPnm 30/530 برای FITC ، nm BP 42/585 برای PE و nm LP 670 برای PE-Cy5 به وسیله نرم‌افزار BD Cell Quest Pro مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
سنجش پتانسیل تمایزی با استفاده از روش سنجش کلنی در محیط نیمه جامد: به منظور مقایسه پتانسیل تکثیری سلول‌های کشت شده در دو گروه استاتیک و بیوراکتور، تعداد 104 * 1 سلول در روزهای نمونه‌گیری شمارش و در 1 میلی‌لیتر محیط کشت متوکالت(Stem Cell ، 4436 Methocult ، کانادا، ونکوور، تکنولوژیست) در پلیت‌های 6 خانه‌ای کشت داده شد. نتایج رشد کلنی‌ها پس از 14 روز با شمارش کلنی و تشخیص نوع آن مورد ارزیابی قرار گرفت. تشخیص نوع کلونی با استفاده از راهنمای شرکت استم سل انجام شد.
بررسی بیان ژن‌های بنیادینگی توسط RT-PCR : بیان 5 ژن مربوط به بنیادینگی(Thy-1 ، AC133 ، CD34 ، c-kit و ABCG2) با آزمایش RT-PCR بررسی شدند؛ به این علت که باقی ماندن سلول‌های بنیادی بدون تمایز و تغییر در کشت، بسیار حایز اهمیت است. ابتدا RNA از سلول‌های تک هسته‌ای خون بند ناف در روزهای 1، 7، 3 و 14 با استفاده از ماده RNX (سیناژن) طبق دستورالعمل پیشنهادی شرکت سازنده، استخراج شد. برای ساخت cDNA از کیت فرمنتاز(آلمان) استفاده گردید. انجام RT-PCR با استفاده از آغازگرهای طراحی شـده بـا برنامـه 95 درجه سانتی‌گراد 4 دقیقه سپس 94 درجه سانتی‌گراد 1 دقیقه، 60 درجه سانتی‌گراد 45 ثانیه و 72 درجه سانتی‌گراد 1 دقیقه(30 سیکل)، و 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه انجام شد. محصول این واکنش روی ژل 2% آگاروز برده شد و با رنگ‌آمیزی اتیدیوم بروماید مشاهده و بررسی گردید.
آنالیز آماری: به منظور تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم‌افزار SPSS نسخه 13 استفاده گردید و نتایج سه آزمایش بر اساس روش student t-test با میزان 05/0 p≤ معنادار گزارش شد.
یافته‌ها کشت سلول‌های تک هسته‌ای خون بند ناف به دو روش استاتیک و بیوراکتور: برای مقایسه تعداد سلول در بیوراکتور و کشت استاتیک در روزهای 3، 7 و 14 ، شمارش دستی انجام شد. مشاهدات میکروسکوپی و نتایج شمارش سلولی نشان داد که تا روز سوم، کاهش تعداد سلولها در هر دو روش کشت اتفاق می‌افتد که ممکن است مربوط به از بین رفتن سلول‌های تمایز یافته موجود در خون باشد. سپس در روزهای 7 و 14 تعداد سلولها افزایش یافت که این افزایش در کشت استاتیک چشمگیر بود(05/0 p≤)(شکل A2). میـزان سلـول‌هـای زنـده طبق نمودار Bدر شکل 2 در روزهای مختلف کشت در هر دو سیستم یکسان نبود و در
شکل 2: شمارش سلول‌های کشت شده در هر دو سیستم سوسپانسیونی و استاتیک(A)، نمایش درصد سلول‌های زنده در حالت کشت سوسپانسیونی و استاتیک(B) و نسبت رشد سلولها در روزهای 7 و 14 به روز اول(C) نشان داده شده‌اند. نتایج نشان داد که تعداد سلولها در گروه استاتیک طی 14 روز کشت افزایش معناداری داشتند(03/0 p≤) در حالی که در هفته دوم نسبت به هفته اول، کشت سوسپانسیونی در مقایسه با حالت استاتیک افزایش سلول معنادار بود(01/0 p≤).
کشت سوسپانسیونی از روز 14 به بعد سلول‌های زنده کاهش داشتند(شکل B 2). بعد از 14 روز کشت، تعداد سلول‌های CD34+ در بیوراکتور نسبت به کشت استاتیک افزایش بیشتری یافت که به ترتیب 86/6 برابر در بیوراکتور و 07/1 برابر در استاتیک بود. با این وجود تعداد کل سلول‌های هسته‌دار تا روز چهاردهم در کشت استاتیک 25/5 برابر و در بیوراکتور 3/4 برابر شده بود. نتایج نشان داد که نسبت تعـداد سلول‌هـا در هفتـه دوم کشـت، در بیـوراکتور(98/3 برابر) در مقایسه با کشـت استاتیک(23/2 برابر) افزایش معناداری داشت(01/0 p≤)(شکل C 2).
1- بررسی تمایز سلولها در کشت استاتیک و بیوراکتور: بررسی پتانسیل کلنی‌زایی سلول‌های تک هسته‌ای کشت شده توسط بیوراکتور: بـه منظـور بررسی توان ایجاد کلنی در روزهای مختلف کشت، از آزمایـش سنجش کلنی بـر روی محیط نیمه جامد استفاده شـد(شکل3). در روز 7 و 14 توان کلنی‌زایی
شکل 3: نتایج سنجش کلنی پس از گذشت 14 روز را نشان می‌دهد که عکس Aکلنی ماکروفاژی(CFU-GM) و عکس B کلنی میکس (CFU- GEMM) هستند.
جدول 1: این جدول نشان می‌دهد که پتانسیل کلنی‌زایی در کشت سوسپانسیونی در مقایسه با حالت استاتیک، میزان بیشتری دارد.
کلنی
میانگین ± انحراف معیار
p value
استاتیک
سوسپانسیون
CFU-GM
45/3 ± 16
34/2 ± 21
10/0
CFU-GMM
03/0 ± 1
5/4 ± 10
02/0
CFC
65/3 ± 17
3/2 ± 30
0064/0
سلول‌های داخل بیوراکتور بیشتر از کشت استاتیک است(01/0 p≤). در حالت کلی با افزایش مدت کشت به 14 روز، در هر دو گروه پتانسیل کلنی‌زایی سلول‌های تحت کشت کاهش یافت و هم‌چنین در هر دو کشت، کلونی اریتروییدی مشاهده نشد(03/0 p≤)(جدول 1).
2ـ بررسی فنوتیپ سلول‌های تک هسته‌ای کشت شده به دو روش استاتیک و بیوراکتور: برای ارزیابی تمایز سلولها به رده‌های میلوئیدی و لنفوئیدی، درصد سلول‌های 38+ ،90- ،CD34+ و CD133+ ، CD34+ به ترتیب به عنوان شاخص‌های رده لنفوئیدی و میلوئیدی با دستگاه فلوسیتومتری مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج نشان داد که بیوراکتور سبب افزایش سلول‌های 38+ ،90- ،CD34+ به نسبت 6/11 و 3/15 برابر در روزهای 14 و 21 گردید؛ در حالی‌که در کشت استاتیک، این افزایش 8/4 و 4/2 برابر بود. بر خلاف این گروه، جمعیت لنفوئیدی کاهش پیدا کردند که روند این کاهش در بیوراکتور بیشتر بود(شکل 4). جمعیت CD133+، CD34+ ، 38+ ، 90- ، CD34+ بعد از 7 و 14 روز، افزایش داشتند.
شکل 4 : نمودارهای فوق درصد سلول‌های تمایز یافته را طبق نتایج فلوسایتومتری نشان می‌دهد.
شکل 5: بیان ژن‌ها را در روزهای مختلف نشان می‌دهد. بر طبق آن بیان ژن‌های CD34 و C-kit تا روز چهاردهم در کشت سوسپانسیونی بیان بیشتری نسبت به کشت استاتیک نشان دادند.
بیان ژن در سلول‌های تک هسته‌ای کشت شده: در سلول‌های تک هسته‌ای کشت شده به هر دو روش بیوراکتور و استاتیک، بیان 4 ژن به نام‌های CD34 ، C-kit ، ABCG2 و CD133 که مربوط به بنیادینگی سلول‌های خونی می‌باشند، با روش RT-PCR مورد بررسی قرار گرفتند. با بررسی این ژن‌ها، تاثیر مدت کشت بر سلول‌های بنیادی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از بیان ژن‌ها در روزهای 7، 3، 0 و 14 از کشت، نشان داد که بیان این ژن‌ها پس از 14 روز، در کشت استاتیک کاهش یافت، اما در بیوراکتور تنها بیان ژن ABCG2 کاهش نشان داد. بنابراین با توجه به نتایج حاصل از RT-PCR ، خواص بنیادینگی سلول‌های خونساز در کشت با بیوراکتور بهتـر از حالت استاتیک حفظ می‌شوند(شکل 5).
بحث با توجه به تعداد کم سلول‌های بنیادی خونساز در یک واحد خون بند ناف، کشت و تکثیر این سلولها در بیوراکتور به صورت وسیع و در مقادیر زیاد یکی از بهترین راه حل‌ها می‌باشد؛ و مطالعه‌هایی هم در این باره وجود دارد(18-16). هم چنین استفاده از انواع مختلف بیوراکتورها برای کشت انواع سلولها در مطالعه‌های بسیاری گزارش شده است. از جمله آن‌ها به کار بردن بیوراکتور Rotating wall vessel ، Perfusion chamber ، Perfusion fixed bed و Stirred tank bioreactor بــوده است(23-19). کـه از بیـن آن‌هـا بـا توجـه به ویژگی‌های
سلول‌های بنیادی خونی و حساسیت آن‌ها به نظر می‌رسد که برای کشت این سلولها، بیوراکتور سوسپانسیونی مناسب باشد(24). چرا که در این نوع بیوراکتورها، کنترل اکسیژن و pH صورت می‌گیرد و فضای کافی و محیطی یکنواخت برای سلول فراهم می‌شود(27-25). هم زن به کار رفته در بیوراکتورهای سوسپانسیونی، مغناطیسی با حرکت دوار می‌باشد اما در این مطالعه هم‌زن با حرکت رفت و برگشتی(بالا و پایین) با سرعت Hz 1 انتخاب شده است که تاکنون مطالعه‌ای با این شرایط گزارش نشده است. سلول‌های MNC به دلیل داشتن سلول‌های خونی پیش‌ساز و تمایز یافته، محیط را شبیه in vivo می‌سازند و به این ترتیب فاکتورهای رشد درونی را در محیط کشت خواهیم داشت که سبب تقویت تکثیر سلول‌های بنیادی مورد نظر می‌گردد(28). با این فرض سلول‌های CD34+ که نقش مهمی را در پیوند ایفا می‌کنند، توان تکثیر بیشتری خواهند یافت. در طی کشت 14 روزه، هر چند که تعداد سلول‌های استاتیک بیشتر بود اما پتانسیل کلنی‌زایی و تعداد سلول‌های بنیادی خونی و بیان ژن‌های بنیادینگی در کشت استاتیک پایین‌تر بود. در مطالعه‌های قبلی تعداد سلول‌های حاصل بیشتر از این مطالعه بوده اما در بررسی‌های کیفی مانند سنجش کلنی، کیفیت پایین بوده که نشان از تمایز یافتن سلولها در کشت می‌باشد(29). در هفته دوم رشد سلولها در بیوراکتور افزایش یافت در صورتی که این افزایش در کشت استاتیک در هفته اول اتفاق افتاد و در ادامه دچار کاهش شد. شرایط pH و O2 و shear استرس و هم چنین نوع هم‌زن انتخاب شده می‌تواند در روند تکثیر و تمایز تاثیرگذار باشد. هم‌زن با حرکت بالا و پایین رونده فشار هیدرودینامیکی به سلولها وارد می‌کند که می‌تواند علت مرگ سلول‌های تمایز یافته باشد؛ سطح اکسیژن محلول در محیط کشت نیز قادر است سبب مرگ سلولی یا مهار رشد یا تمایز به سمت رده‌های نامطلوب گردد. در نهایت می‌توان ذکر کرد با این که میزان تکثیر در بیوراکتور کافی نبود اما سلول‌های CD34+90+38- در این سیستم افزایش یافت و سنجش کلنی نیز نتایج بهتری نسبت به کشت استاتیک نشان داد.
نتیجه‌گیری در ایـن مطالعـه کشـت سلول‌های تک هسته‌ای از خون بند ناف در بیوراکتور سوسپانسیونی هم‌زن‌دار در حضور سایتوکاین‌های مختلف انجام گرفت. با این روش انتظار
می‌رود که سلول‌های پیش‌ساز خونی که مقاوم‌ترند، باقی مانده و تکثیر شوند، چون این سلولها برای پیوند به بیماران بسیار ضروری هستند و نقش اصلی را در موفقیت پیوند خواهند داشت.
تشکر و قدردانی بدین وسیله از زحمات آقایان دکتر احمد وثوق معاون پشتیبانی و امور تخصصی پژوهشگاه رویان، دکتر حسین بهاروند مدیر گروه سلول‌های بنیادی و دکتر عبدالحسین شاهوردی معاون پژوهشی و آموزشی پژوهشگاه رویان که زمینه انجام این پروژه را در پژوهشگاه رویان فراهم کردند، کمال تشکر را داریم. هم چنین از آقای فاضل سامانی کارشناس آزمایشگاه فلوسیتومتری، خانم صمدیان کارشناس آزمایشگاه مولکولی و کارکنان بخش سلول درمانی رویان که در اجرای پروژه ما را یاری نمودند، سپاسگزاریم.
Shayan Asl N, Ebrahimi M, Beiki B, Janzamin E, Bani Ardalan P. Evaluation of expansion and differentiation of cord blood hematopoietic cells expanded in suspension bioreactor with vertical agitation. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2013; 10 (2) :112-121 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-765-fa.html
شایان اصل نیلوفر، ابراهیمی مرضیه، بیکی بهاره، جان‌زمین احسان، بنی اردلان پوریا. مطالعه پتانسیل تکثیری و تمایزی سلول‌های تک هسته‌ای خون بند ناف تکثیر شده در بیوراکتور سوسپانسیونی مجهز به هم‌زن رفت و برگشتی . فصلنامه پژوهشی خون. 1392; 10 (2) :112-121
