چکیده سابقه و هدف ارزیابی بقای سلولی در مطالعه‌های سـلولی مهـم است ونتیجه حاصله برای کاربرد ماده مورد آزمایش تعیین‌کننده است. امروزه از روش‌های مختلفی برای ارزیابی بقای سلولی استفاده می‌گردد و وجـودهمبستگی بین روش‌ها دارای اهمیت است. در این مطالعه، از سل لاینVero برای بررسی اثرات ویروس HSV-1 بر بقای سلولی استفاده شد. بقای سلولی پس از آلودگی با HSV-1 با استفاده از روشهـایحساس رنگ‌سـنجی MTT و تریپان‌بلو بر روی سل لاین Vero مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش‌ها مطالعه کیفی انجام پذیرفته بر روی رده سلولی Vero آلوده به ویروس HSV-1 با رقت های لگاریتمی طی مدت 24 سـاعت در محیط DMEM حاوی 2% سرم جنین گاوی انجام گرفت و سپس زنده‌مانی سلولی توسط روش‌های رنگ سنجیMTT و تریپان بلو در رقت های 1-10 تا 5-10 و فواصل زمانی 0و 4 و8 و 18 و 24 ساعت بررسی شد و درصـد بقا جهت رسم منحنی بقای سنجش استفاده گردید. یافته‌ها رقتهای مختلف ویروسی جهت تعیین دوز 50 درصد آلودگی TCID50 سلول با ویروس HSV-1 با میکروسکوپ اینورت انجام شد. هم چنین داروی آسیکلویر با غلظت 50 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به عنوان کنترل با روش‌های MTT و تریپان‌بلو، مقایسه شد. نتایج تحلیل رگرسیون بقای سلولی، نشان داد؛ همبستگی خطی، مثبت و معنادار بین روش‌ها مشاهده شده است یعنی بین روش‌های MTT و تریپان‌بلو همبستگی وجود داشت (001/0 p< ، 9/0 r=). نتیجه گیری نتایج نشان دادند، هر دو روش بـرای تعیـین بقای سـلولی قابل استفاده بـوده و نتایج روش تریپانبلوقابل تایید با روش MTT می‌باشد. کلمات کلیدی:HSV-1 ، تریپان بلو، بقا
تاریخ دریافت: 21/8 /99 تاریخ پذیرش: 11/11/99
1- دانشجوی PhD ژنتیک مولکولی ـ گروه زیست شناسی واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران 2- PhD ژنتیک مولکولی ـ استاد گروه زیست‌شناسی واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران 3- PhD شیمی دارویی ـ استاد گروه شیمی دارویی دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران 4- PhDقارچ شناسی ـ استادیار گروه انگل‌شناسی و قارچ شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی سمنان ـ سمنان ـ ایران 5- مؤلف مسئول: PhD ویروس‌شناسی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه امروزه دانشمندان در تلاش هستند تا با استفاده از روش‌های متفاوت درمانی، عوارض شدید را با راه‌کارهای درمانی بهبود و با عوارض کمتر جایگزین کنند. برای ارزیابی زنده‌ماندن و میزان تکثیرسلول،آزمایش‌های مختلف از جمله تریپانبلوو MTT علاوه بر ارزیابیمنحنی رشد و زمان دو برابر شدن در کشت سلول‌ها استفاده می‌شود(1). هم‌چنین برای بررسی اثر سمیت پپتیدها، مطالعه بر روی سلول، پلاکت و گلبول‌های قرمز انسانی و غیره آزمایش MTT پیشنهاد می‌شود چرا که بسیاری از ترکیبات به دلیل اثرات سمی بر روی سلول‌ها نمی‌توانند به عنوان دارو استفاده شوند. برای هر دارو یا ماده جایگزین (گیاهان دارویی) نیز نیاز به سنجش عدم سیتوتوکسیسیتی می‌باشد، به عنوان مثال برای بررسی سمیت دارویی (آسیکلوویر) برای بیماران هرپس و مبتلا به نقص ایمنی به خصوص دارای HIV ، که در مواجهه با این ویروس هستند و نیازمند درمان جایگزین می‌باشند، نیاز به سنجش با روش MTT می‌باشد(3، 2). مطالعه بر روی ویروس تب خال در رابطه با کشف داروی سنتتیک یا گیاهی دارای اهمیت می‌باشد و در قدم اول لزوم بررسی آزمایش‌های اولیه و پایه‌ای جهت بررسـی اتر ویروس بر روی سلول ضروری به نظر می‌رسد. تعیین بقا یا تکثیرمبتنی بر کشت سلول و آزمایش‌های پیش بالینی در شرایط آزمایشگاهی، برای تعیین سمیّت مواد شیمیایی دارای اهمیت بوده و اساس این آزمایش‌ها بر پایه فعالیت های مختلف سلولی، نفوذپذیری غشای سلولی و کنش‌های آنزیمی می‌باشد(4) .دو روش سریع و ساده ارزیابی وجود دارد: 1- رنگ‌سنجی که کاهش سلول‌های زنده به نمک تترازولیوم MTT برای تشکیل کریستال‌های بنفش‌ـ آبی رنگ فورمازان بستگی دارد(5). 2- روش دیگر به اتصال سریع رنگ کوماسی‌بلو درخشان رنگ به پروتئین در pH اسیدی متکی است. درمطالعه‌ها، اعتبار هر دو روش در تعییـن میـزان واکنــش تکثیــر سلول‌های انسانی نشان داده شده است(6). در رنگ‌آمیزی ترپیان‌بلو که بر پایـه عـدم قابلیـت نفـوذ رنگ به غشای سلول زنده می‌باشد(تریپان‌بلو جهت رنگ‌آمیزی سلول‌های مرده به کار برده می‌شود) و بقای سلولی با شمارش سلول‌های رنگ نگرفته توسط میکروسکوپ مشخص می‌گردد(4). در روش آنزیمی رنگ‌سنجی، 3- (4 و 5- دی متیل تیازول ـ 2 ـ ایل) ـ 2 و 5- دی فنیل تترازولیوم برماید(MTT) ، که بر پایه تولید ماده رنگی توسط سلول‌های زنده می‌باشد، استفاده از نمک‌های تترازولیوم مانند 3)-4و5 دی متیل- 2 - تیازول)- 2 و 5 - دی فنیل2- هیدروژن - تترازولیوم بروماید، جهت ارزیابی بقا و تکثیر سلولی استفاده می‌شود. آزمایشMTT ،قادر به ارزیابـی کمـی سلول‌هـای زنده با تبدیل نمک تترازولیوم به بلورهای بنفش رنگ نامحلول فرومازان، به وسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی می‌باشد، که این واکنش تنها در سلول‌های زنده می‌باشد. میزان فرومازان تولید شده توسط اسپکتروفتومتر جهت تعیین میزان بقای سلولی اندازه‌گیری می‌شود(7). آسیکلوویر از داروهای شیمیایی مورد تایید برای درمان HSV-1 محسوب می‌شود که در مطالعه بر روی رده سلولی Vero در دوزهای اثر بخش جزئی و اثر بخش و توکسیک به ترتیب 24 و 39 و76 میکروگرم بر میلی‌لیتر نشان داده شده است(8). جهت تعیین تیتر ویروسی، بروز اثر سیتوپاتیک(CPE ؛ Cytopathic effect) روزانه مشاهده و با استفاده از روش Reed & Muench تیتر ویروس محاسبه می‌گردد(9). هدف از این مطالعه کیفی(پژوهشی)، مقایسه حساسیت و همبستگی روش‌های MTT و تریپان بلو در تعیین بقای رده سلولی Vero آلوده به HSV-1 بود.
مواد و روش‌ها مطالعه کیفی حاضر، مهر 1399 در مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران آزمایشگاه ویروس‌شناسی انجام پذیرفت.
1- رده سلولی: رده سلولـی Vero کـه سلول‌های کلیوی میمون آفریقای جنوبی(Vero) است، از مرکز منابع ژنتیکی جهاد دانشگاهی خریداری شده بود، برای تکثیر ویروس تبخال نوع 1 استفاده شد. (Accession Cell No: IBRC C10001) و برای کشت سلول از محیط کشت DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)، سرم جنین گاوی 10% (FBS)(جیبکو، آلمان) و µg/mL 100 استرپیتومایسین، U/mL 100 پنی‌سیلین و شرکت ترمو فیشر ساینتیفیک استفاده شد.
2- انکوباسیون سلول‌ها با غلظت‌های مختلف ویروسی: سلول Vero بهصورت تکلایه رشد داده شد و در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد و 5% 2CO و رطوبت نگهداری شدند. جهت جدا کردن سلول‌ها از کف فلاسک و پاساژ سلولی، از محلول 25/0% تریپسین EDTA (Ethylene diamine tetraacetic acid) استفاده گردید. ویروس تبخال نوع 1 انسانی از آزمایشگاه ویروس شناسی مؤسسه عالی طب انتقال خون تهیه و با 1/0 MOI= (سلول Vero 10 :1 ویروس) در یک فلاسک 25 سانتی‌متر مکعب با تراکم سلول بالای 90% آلوده شد و به مدت 24 ساعت در انکوباتور 2CO نگهداری شد. پس از بروز اثر سیتوپاتیک CPE (Cytopathic effect or cytopathogenic effect) در فریزر 80- فریز شد. برای تعیین تیتر ویروس، در یکپلیت 96 خانه‌ای، کشت سلول انجام شد و سپس10 رقت لگاریتمی از استوک ویروسی تهیه شد. از داروی سنتتیک آسیکلوویر به عنوان کنترل دارویی مثبت با توجه به غلظت مؤثرµg/mL 50 ، استفاده شد. هشت چاهک برای سلول Vero تنها به عنوان شاهد و هشت چاهک برای کنترل ویروس و هم‌چنین برای هر رقت سلولی هم هشت چاهک مورد آزمایش قرار گرفت و به هر چاهک 100 میکرولیتر از رقت ویروسی مورد نظر اضافه شد. پس از یک ساعت جذب ویروس به سلول‌های Vero ، 200 میکرولیتر از محیط کشت حاوی 5% سرم اضافه شد و بروز CPE روزانه بررسی شد و در نهایت طبق Reed Muench method ، تیتر ویروس محاسبه شد.
3- رنگ‌آمیزی ترپان بلو: سلول‌هـا در محیـط کشـت کامـل تهیـه شـد و تعــداد 104×4/3 سلول در هر چاهک 96 خانه‌ای کشت شدند و پس از 18 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتی‌گراد، رطوبت 80% و 5% 2CO ، برای چسبندگی به کف پلیت با میکروسکوپ اینورت Leica DM (آلمان ، Wetzlar) بررسی شدند. سپس مایع رویی خارج شده و با رقتهای مختلف (8-10- 1-10) ویروس HSV-1 آلوده شد. عفونت ویروسی پس از مدت 24 ساعت با میکروسکوپ اینورت برای CPE بررسی شد و نتایج هر چاهک ثبت شد. برای انجام روش تریپان‌بلو، سلول‌ها با تریپسین/EDTA (BioIdea(Trypsin EDTA 0.20 % 1X برداشته شده و با لام نئوبار شمارش شدند. سپس µL 20 از سوسپانسیون سلولی باµL 20 رنگ آبی تریپان بلو 1/0% مخلوط وµL 10 از مخلوط حاصل بر روی لام نئوبار قرار گرفت و سلول‌ها با غشای آسیب دیده به رنگ آبی و سلول‌های زنده بی‌رنگ و کاملاً شفاف شمارش شده و درصد سلولی به صورت ](تعداد کل سلول‌ها – سلول های رنگ گرفته)/ تعداد کل سلول‌ها) ×100[ محاسبه گردید و برای ترسیم منحنی بقای سلول محاسبه شد. در صد سلول‌های زنده با این فرمول(درصد زنده‌مانی = / تعداد سلول‌های زنده) 100× (مجموع سلول‌های زنده و مرده (محاسبه شد.
4- رنگ‌آمیزی MTT: در روش MTT ، پس از تیمار سلولهابه مدت 24 ساعت جهت انجام آزمایش MTT ، محیط رویی خارج گردید و سلول‌ها توسط محلول نمکی بافر فسفات (PBS شستشو شده و مقدار µL 100 محلول(mg/mL 5(MTT رقیقشده درPBS ، به هر چاهک اضافه شد و پلیت به مدت چهار ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و تاریکی انکوبه گردید. پس از آن محلول رویی هر چاهک خارج شده و مقدار µL 100 DMSO (Dimethyl sulfoxide) به هر چاهک اضافه شده و بهمدت 15 تا 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه و روتاتور گردید. پس از آن جذب نوری آن در nm 570خوانده شد و جهت رسم منحنی بقای سلولی، محاسبه گردید. درصد بقای سلولی به صورت(مقدار جذب نوری گروه تیمار شده/ مقدار جذب نوریگروه کنترل) × 100 محاسبـه شـد. تمامی آزمایش‌ها به صورت مستقل سه بار تکرار شد.
5- آنالیز آماری: داده‌ها بـه صـورت میانگیـن ±انحـراف معیار بیان شده است. در مقایسه آزمایش‌ها ازt-student با استفاده ازنرمافزار 25 IBM SPSS Statistics و برای مقایسه در یک گروه، از روش آنالیز واریانس یک طرفه استفاده شد. هم‌چنین برای ترسیم نمودارها در Excel ، داده‌ها آنالیز و همبستگی محاسبه گردید. در تمام بررسی‌ها سطح معناداری آزمون‌ها، 05/0 p< در نظر گرفته شد.
یافته‌ها اثر فعالیت‌های HSV-1 بر روی سلول‌های Vero با
میکروسکوب اینورت ارزیابی و ثبت شد(شکل 1، الف و ب). میزان زنده ماندن سلول و تکثیرویروس HSV-1 با رقتهای لگاریتمی مختلف(105-101) در سلول‌های Vero تعیین تیتر شد(mL/TCID50 104×4/3). این عمل 3 مرتبه برای آلودگی به ویروس HSV-1 در سه سری جداگانه با روشهایتریپانبلو و MTT انجام شد و اثر سیتوپاتیک بعد از 24ساعت، پایین‌ترین میزان زنده‌مانی سلول با ویروس HSV-1 را نشان داد(شکل 1 و نمودار1(. در روش MTT میزان بقای سلولی نسبت به گروه کنترل سلول و داروی آسیکلوویر در رقت 5-10 تفاوت معناداری نداشت و بقای سلولی در کنترل ویروس به پایین‌ترین مقدار خود با میانگین 32/14% رسید(جدول 1).
شکل 1: با بزرگ‌نمایی(X10) =100 الف) سلول دوکی شکل طبیعی Vero ب)سلول‌های آلودهVero به ویروسHSV- ج) کریستال‌های فرومازان در آزمایش MTT . (شکل الف، کنترل سلول در برابر شکل ب، سلول‌های آلوده Vero به ویروسHSV). جدول 1: میانگین درصدها و انحراف معیار نسبی بقای سلولی Vero آلوده به HSV-1 با رقتهای مختلف ویروسی در فواصل زمانی مختلف به روش
جدول 2: میانگین درصدها و انحراف معیار نسبی بقای سلول Vero آلوده به HSV-1 با رقتهای مختلف ویروسی در فواصل زمانی مختلف به روش تریپان‌بلو Mean ± SD * جدول 3: میزان بقای سلول‌های Vero پس از آلودگی با ویروس HSV-1 به روش تریپان‌بلو و MTT پس از 24 ساعت
در روشMTT ، میانگین بقای سلولی به دست آمده نسبت به گروه کنترل سلول و داروی آسیکلوویر با گروه کنترل ویروس، معادل 2/14% در 24 ساعت بعد از انکوباسیون بود، در صورتی که در رقت 4-10 ، بقای سلولی 1 ± 4/67 بود و سلول‌های Vero به عنوان معیار کنترل سلولی در نظر گرفته شدند(جدول1). بر اساس نتایج به دست آمده از روش رنگ‌آمیزی تریپان‌بلو، بقای سلولی تفاوت معناداری را در رقت 5-10 نسبت به گروه کنترل سلول و داروی آسیکلوویر نشان نداد و بیشترین میزان بقای سلولی نسبت به گروه کنترل مربوط به رقت 4-10 با میانگین 84% در 24 ساعت بعد از انکوباسیون بود. کمترین میزان بقا مربوط به رقت 1-10 با میانگین 45% در 24 ساعت بعد از انکوباسیون بوده است(جدول 2.( نتیجه‌گیری کلی بین دو روش تریپان‌بلو و MTT در جدول نشان داده شده است(جدول 3).
نمودار 1: رگرسیون بقای سلولی VERO آلوده شده با HSV-1 با دو روش MTT ، رنگ‌آمیزی تریپان‌بلو طی زمان‌های مختلف. الف) انکوباسیون بعد از 4 ساعت ب) انکوباسیون بعد از 8 ساعت ج) انکوباسیون بعد از 18 ساعت د) انکوباسیون بعد از 24 ساعت هـ) در ساعت صفر. داده‌ها بهصورت میانگین، انحرافمعیار تکرار سه آزمون مستقل می‌باشند.
بر اساس نتایج به دست آمده از نمودار رگرسیون بقای سلولی، میزان همبستگی چشمگیری از نوع خطی، مثبت معنادار بین دو روش موجود می‌باشد و ضریب همبستگی معناداری بین روش‌هایMTT و تریپان‌بلو وجود داشت (95/0 r = ،006/0(p< . بحث در این مطالعه روش‌های MTT ، و رنگ‌آمیزی تریپان‌بلو جهت تعیین بقای رده سلولی Vero آلوده به HSV-1 تیمار شده با رقتهای مختلف در زمان‌های متفاوت مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفتند. یافته‌های به دست آمده نشان داد که رقت‌ها به صورت وابسته به غلظت و زمان می‌تواند سبب کاهش بقای سلولی Vero آلوده بهHSV-1 گردد و این در حالی بود که نتایج حاصل از مقایسه میکروسکوپ اینورت با دو روش مورد مطالعه یکدیگر را تایید کرده‌اند و میزان همبستگی بین روش‌های MTT و تریپان‌بلو بالا بود. با وجودی که، مشکلات متعددی در رنگ‌آمیزی‌های معمول تریپان‌بلو وجود دارد و ممکن است در شناسایی سلول‌های مرده مشکلاتی ایجاد نماید، زیرا سلول‌ها می‌بایست بین سه تا پنج دقیقه شمارش شوند، در غیر این صورت تعداد سلول‌های رنگ گرفته با افزایش زمان افزایش می‌یابد(10). برای تجزیه و تحلیلدر روش MTT ، از حجم زیادی از نمونه‌ها در پلیت‌های 96 خانه، استفاده می‌شود. با این وجود، این روش می‌تواند تحت تاثیر عوامل مختلفی مانند مقدارpH و آنالوگ‌های پیرووات و یا سوپراکسیدها قرار گرفته وکاهش یابد. نتایج متناقضی در بقا و تکثیر سلولی با استفاده از تست MTT گزارش شده است که از این جمله می‌توان به قابلیت نانو دی‌اکسید تیتانیوم در افزایش سوپراکسیدها که در معرض تابش UVA سمیت سلولی قوی نشان می‌دهند، اشاره کرد که خود از دیگر محدودیت‌های سلول‌های مختلف مرتبط می‌باشد(11). مطالعه‌های دیگر این یافته را تایید می‌کنند که استفاده از رنگ‌سنجیMTT و رنگ‌آمیزی تریپان‌بلو، می‌توانند روش‌های مناسبی در ارزیابی بقای سلولی باشد ولی رنگ‌آمیزی با تریپان‌بلو در اولویت نسبت به روش MTT قرار نمی‌گیرد(13، 12). روش MTT نسبت به روش تریپان‌بلو از حساسیت بیشتری برخوردار می‌باشد(14). در مطالعه استوآرت در سال 1992، افزایش تراکم نوری مشاهده شده برای هر روش به طور مستقیم، در طول مدت زمان کشت با افزایش تعداد سلول توسط هموسیتومتری در سلول‌های عضلات صاف راه‌های هوایی ASM (airway smooth muscle) انسان و خرگوش تعیین شد. این رابطه هم‌چنین برای تکثیر سلول‌های ASM نای خرگوش در پاسخ به هترودیمر فاکتور رشد مشتق از پلاکت (1 تا 50 نانوگرم در میلی‌لیتر) انجام شد و در پاسخ به سرم گوساله جنین (1.25 تا 10)، افزایش نشان داد(6). در مطالعه سال 2002 روش رنگ سنجی با روش رادیو اکتیو مورد مقایسه قرار گرفته بود که نتایج حاصله دارای همبستگی و حساسیت قابل قبولی بود، ولی روش رنگ‌سنجی به دلیل کم خطر بودن و سهولت پیشنهاد گردید(15). بنا بر گزارش‌های محققین، روش MTT روشی دقیق و سریع در تعیین حساسیت دارویی در طی چرخه درمان می‌باشد و مناسب بودن، هزینه کم و سهولت انجام کار سبب کاربرد فراوان این روش شده است(16). درصد بقای سلول‌ها در حضور رقتهای لگاریتمی ویروس HSV-1 به صورت تابعی از زمان انکوباسیون بود که بقا در حضور ویروس نسبت به کنترل کاهش می‌یافت و اختلاف دو روش در استوک ویروسی یعنی ویروس بدون رقت تا رقت 3-10 بیشتر آشکار بود(جداول 1 و 2). جهت مقایسه دقیق این دو روش، ارتباط با اثر ویروس HSV-1 بر سلول‌های Vero با دو روش محاسبه شد که با توجه به نتایج به دست آمده، همبستگی و هماهنگی بین نتایج مشاهده می‌شود و نشان از حساسیت بیشتر روش MTT نسبت به تریپان‌بلو دارد. مطالعه درباره تاثیر ویروس HSV نوع 1 روی سلول‌های Vero نشان داد، میزان زنده ماندن سلول در آزمایش MTT بعد از آلودگی سلول‌های Vero با رقتهای بالای ویروس HSV-1 از نظر آماری معنادار بود. نتیجه‌گیری پـژوهش کنونی بیان می‌دارد، نتایج دو نوع روش MTT و تریپان‌بلو تایید می‌کند که تا حد زیادی با یکدیگر همبستگی داشته و نتایج یکدیگر را تایید می‌نمایند و با توجه به حساسیت و دقت بیشتر روش MTT ، نسبت به روش تریپان‌بلو، می‌توان نتیجه گرفت که در بررسی نحوه عملکرد HSV-1 در رده سلولی Vero ، می‌توان با روش تریپان‌بلو زنده بودن سلول را تایید اولیه کرد و با روش MTT که نتایج قابل استنادتر و با دقت بیشتـری نسبـت بـه روش تریپان‌بلو دارد، درصد سلول‌های زنده را تعیین نمود.
تشکر و قدردانی در اجرای این پروژه تحقیقاتی که در مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران انجام گردیده است از مؤسسه عالی طب انتقال خون، آزمایشگاه ویروس شناسی و جهاد دانشگاهی برای سلول‌های Vero نهایت قدردانی و سپاس را داریم.
Zamanian M, Noormohammadi Z, Akbarzadeh T, Bineshian F, Sharifi Z. Comparison of MTT and Trypan Blue methods in determining the survival of Vero cell line in HSV-1 infection. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2021; 18 (1) :18-26 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1380-fa.html
زمانیان مهسا، نور محمدی زهرا، اکبرزاده تهمینه، بینشیان فرحناز، شریفی زهره. مقایسه دو روش MTT و تریپان بلو در تعیین بقای رده سلولی Vero در آلودگی با HSV-1. فصلنامه پژوهشی خون. 1400; 18 (1) :18-26
