[صفحه اصلی ]   [Archive] [ English ]  
:: صفحه اصلي :: درباره نشريه :: آخرين شماره :: آرشيو مقالات :: جستجو :: ثبت نام :: ارسال مقاله :: تماس با ما ::
:: جلد 17، شماره 4 - ( زمستان 1399 ) ::
جلد 17 شماره 4 صفحات 276-286 برگشت به فهرست نسخه ها
اثر آپوپتوتیک و آنتی‌پرولیفراتیو فرکشن های گیاه Juniperus excelsa بر روی رده سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد(Nalm-6)
لیلا نورآذر، دکتر سمیه اسماعیلی، پرگل مشاتی، دکتر احمد قره باغیان، دکتر سینا سالاری
دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی
واژه‌های کلیدی: لوسمی لنفوبلاستیک حاد، آپوپتوز، جونیپروس
متن کامل [PDF 788 kb]   (113 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (478 مشاهده)
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: هماتولوژي
انتشار: 1399/10/10
متن کامل:   (103 مشاهده)
اثر آپوپتوتیک و آنتی‌پرولیفراتیو فرکشن های گیاه Juniperus excelsa بر روی
رده سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد(Nalm-6)
 
لیلا نورآذر1، سمیه اسماعیلی2، پرگل مشاتی1، احمد قره‌باغیان3، سینا سالاری4
 
چکیده
سابقه و هدف
لوسمی لنفوبلاستی حاد، از بدخیمی­های خونی رده لنفوئیدی می­باشد. عوارض جانبی داروهای شیمی‌ درمانی که از ابتدا در درمان سرطان مورد توجه بودند، علت گرایش به سمت داروهای گیاهی بودند. مطالعه‌های گذشته بر روی گیاه جونیپروس اکسلسا حاکی از وجود خاصیت ضد سرطانی بر روی برخی رده‌های سلولی سرطانی بود. هدف از این مطالعه، بررسی اثرات کشندگی و انتخاب فرکشن توکسیک­ترگیاه جونیپروس اکسلسا بر روی رده سلولی ALL (Nalm-6) و سلول­های طبیعی PBMC بود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، میزان سیتوتوکسیسیتی فرکشن­ها از طریق آزمون­های زنده‌مانی سلولی و فعالیت متابولیک ارزیابی شد. با استفاده از این دو آزمون، فرکشن توکسیک­تر انتخاب گشته و سپس میزان آپوپتوز سلولی به روش رنگ‌آمیزی آنکسین V و پروپیدیوم یدید به کمک فلوسیتومتری برای آن محاسبه شد. هر آزمون سه بار تکرار گردید. از آزمون one-way ANOVA و 23 SPSS  برای آنالیز آماری داده­ها استفاده شد.
یافته‌ها
یافته­ها نشان داد که دوز µg/mL 5/2 و µg/mL 4 به ترتیب فرکشن کلروفرمی و اتردوپترولی گیاه جونیپروس، بدون تاثیر معنادار بر سلول‌های PBMC ، درصد زنده‌مانی و فعالیت متابولیک سلول­های Nalm-6 را به طور معنادار کاهش داد(01/0 p<). فرکشن آبی آن فاقد اثرات سیتوتوکسیک بود. با این آزمون­ها، فرکشن توکسیک­تر کلروفرمی انتخاب شد. آپوپتوز سلول­های Nalm-6 با فرکشن کلروفرمی توسط فلوسیتومتری، افزایش حدود 13 برابری در مقایسه با گروه تیمار نشده نشان داد(001/0 p<).
نتیجه گیری
نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد فرکشن کلروفرمی و اتردوپترولی گیاه جونیپروس، دارای خاصیت کشندگی و آنتی‌پرولیفراتیو بوده و سلول­های Nalm-6 را وارد چرخه آپوپتوز می­کند.
کلمات کلیدی: لوسمی لنفوبلاستیک حاد، آپوپتوز، جونیپروس
 
 
 
 
 
 
تاریخ دریافت: 16/4/99
تاریخ پذیرش: 25/5/99
 

1- دانشجوی کارشناسی ارشد خونشناسی آزمایشگاهی و بانک خون ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
2- PhD فارماکوگنوزی ـ دانشیار گروه داروسازی سنتی ـ مرکز تحقیقات طب سنتی و مفردات پزشکی ـ دانشکده طب سنتی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
3- PhD ایمونوهماتولوژی بالینی ـ استاد دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ مرکز تحقیقات بیماری‌های خونی مادرزادی کودکان دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
4- مؤلف مسئول: فوق تخصص خون و سرطان بالغین استادیار دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ بیمارستان آیت اله طالقانی - تهران ـ وانجک - ایران-
کدپستی:11151-19857
 

مقدمه
    لوسمی لنفوبلاستی حاد(ALL)، یکی از انواع بدخیمی‌های خونی است که با تکثیر پیش‌ساز­های لنفوئیدی در مغز استخوان همراه می­باشد که تواماً کودکان و بزرگسالان را درگیر می­کند. سالانه به طور تقریبی، 6000 مورد ابتلا به این سرطان در ایالت متحده امریکا گزارش می­شود که بیشترین رنج سنی بیماران بین کودکان و نوجوانان است(1). دو گروه سنی کودکان زیر 15 سال و افراد بالای 50 سال در این لوسمی بیشترین ابتلا را دارند و شایع‌ترین پیک سنی درگیر در ALL کودکان، بین 2 تا 5 سال می­باشد(2). این بدخیمی در کودکان با پیش‌آگهی مطلوب همراه است اما در بزرگسالان به صورت یک بیماری کشنده بروز می‌یابد(3). از شایع‌ترین علائم ALL می‌توان به کبودی یا خونریزی ناشی از ترومبوسیتوپنی، خستگی و رنگ پریدگی ناشی از کم خونی و عفونت ناشی از نوتروپنی اشاره کرد. در تشخیص  ALL ، ارتشاح سلول‌های لوسمی به کبد، طحال، غدد لنفاوی و مدیاستن و ایجاد لنفادنوپاتی کمک کننده است (1). پیشرفت مداوم در توسعه درمان‌های مؤثر باعث شده است که میزان بهبودی در کودکان به بیش از 80% افزایش یابد و رویکردهای نوینی در جهت افزایش بقای عاری از سرطان ایجاد شود که به موجب آن شاهد کاهش عواض داروهای شیمی درمانی خواهیم بود(4). همان‌طور که می‌دانیم عوارض جانبی داروهای شیمی درمانی سرکوب شدید سیستم ایمنی، پوکی استخوان، نوروتوکسیسیتی و غیره، از محدودیت‌های این درمان است. از آن‌جا که داروهای گیاهی به علت داشتن منشأ طبیعی در مقایسه با داروهای شیمیایی دارای عوارض جانبی کمتری بوده و به دلیل این که با ارگانیسم زنده از جمله بدن انسان سازگاری بیشتری دارند، تمایل به مصرف آن‌ها رو به افزایش است و اکنون نیز به عنوان منبع مکملی برای داروهای شیمی درمانی مورد توجه هستند(5). اخیراً به کارگیری داروهای گیاهی در زمینه بهبود سرطان مورد توجه محققان قـرار گرفته‌اند. شناخت ترکیبات مؤثره در این گیاهان و جداسازی، تخلیص و به کارگیری آن‌ها در زمینه تحقیقات سرطان نشان داده است که این ترکیبات قادرند باعـث مهار رشد و
القای آپوپتوز شده در نهایت منجر به مرگ سلول سرطانی شوند. با نظر به این که داروهایی با پایه گیاهی تاثیرگذاری و پایداری بیشتر و عوارض جانبی کمتر و هم‌چنین از لحاظ چرخه تولید، صرفه اقتصادی بالاتری نسبت به داروهای سنتتیک دارند، تمایل بیشتری در مصرف داروهای گیاهی به عنوان مکمل یا جایگزین داروهای سنتتیک در بین جوامع مختلف مشاهده می­شود(6). امروزه، حدوداً 55% از داروهایی که به عنوان ضد سرطان در بالین بیمار مورد استفاده قرار می­گیرد، از منابع گیاهی به دست آمده است(7). گیاه جونیپروس اکسلسا(Juniperus excelsa ; J.excelsa)، یک درخت یا درختچه‌ای همیشه سبز از خانواده کوپرساسیا(Cupressaceae) است که در کشورهای ناحیه بالکان، ترکیه، سوریه، لبنان، گرجستان، دامنه قفقاز و قسمت شرقی ایران وجود دارد و فرم‌های اصلاح شده متعددی از آن در ایران کاشته می­شود که مردم محلی، آن را با نام ارس یا اردوج می­شناسند(8). جونیپروس یک گیاه دارویی است که در گذشته برای درمان قاعدگی دردناک، سرفه و برونشیت مورد استفاده قرار می­گرفت. هم‌چنین فعالیت ضد میکروبی متعددی در میوه و برگ‌های این گیاه علیه برخی پاتوژن‌ها مورد بررسی قرار گرفته است(9، 8). مطالعه‌های اخیر در مورد ترکیبات با منبع پودوفیلوتوکسین و دئوکسی پودوفیلوتوکسین موجود در عصاره­ برگ این گیاه نشان داد که این ترکیبات، خاصیت سیتوتوکسیک بر علیه سلول‌های سرطانی از خود نشان می­دهند(10). اثرات سیتوتوکسیک این عصاره بر روی رده‌های سلولی مربوط به تومورهای جامد مانند رده سلولی Hela نیز در مقاله‌ای مشابه به اثبات رسیده است(11). در مطالعه مشابه، عصاره تام جونیپروس اکسلسا، آپوپتوز را در سلول‌های سرطانی رده لنفوبلاستی Reh و Nalm-6  القا کرد و هم‌چنین توانست با اثر سینرژی، دوز داروی شیمی­درمانی وین کریستین را در این دو رده سلولی کاهش دهد(5). از طرف دیگر برخی از مطالعه‌ها تایید کرده­اند که می‌توان از این عصاره به عنوان یک ماده نگهدارنده مواد غذایی استفاده کرد، چرا که خاصیت ضد میکروبی داشته و بر روی بدن انسان تاثیر سوء نخواهد گذاشت(12). در این مطالعه رده سلولی Nalm-6 که الگویی از لوسمی ALL است، به دلیل شیوع بیشتر در بین کودکان و پیش آگهی ضعیف آن در بزرگسالان، به عنوان رده سلولی مورد مطالعه برگزیده شد و برای اولین بار اثرات کشندگی سه فرکشن نامبرده گیاه فوق به طور خاص برروی رده سلولی Nalm-6 و سلول‌های طبیعی تک هسته‌ای خون فرد سالم(PBMC) مورد بررسی قرار گرفت.
 
مواد و روش‌ها
1- آماده‌سازی عصاره:
    در یک مطالعه تجربی، 30 گرم از پودر گیاه خشک  به نسبت 1 به 10 با حلال غیر قطبی پترولیوم اتر مخلوط شد. مخلوط ایجاد شده پس از 24 ساعت قرارگیری بر روی شیکر، صاف و فرکشن به دست آمده با روتاری تغلیظ یافت. پس از خشک شدن کامل نمونه تغلیظ شده در زیر هود شیمیایی، فرکشن خشک اتردوپترولی حاصل شد. در ادامه با افزودن حلال کلروفرم با نسبت 1 به 10 به باقیمانده خشک شده گیاه از مرحله قبل و تکرار فرآیند شرح داده شده، فرکشن کلروفرمی به دست آمد. از افزودن حلال متانولی به باقی‌مانده خشک، فرکشن متانولی استخراج گردید. در انتها با افزودن آب به عنوان حلال قطبی، عصاره آبی حاصل شد که با استفاده از دستگاه فریزدرایر، فرکشن خشک آبی استخراج شد. فرکشن­های به دست آمده تا زمان استفاده در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. تمامی مراحل استخراج فرکشن­ها در مرکز تحقیقات طب سنتی و مفردات پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی و زیر نظر متخصص فارماکوگنوزی انجام گرفت. به منظور تهیه ذخیره اولیه از فرکشن‌ها، 20 میلی­گرم از هر یک از فرکشن­های خشک درون ویال، با استفاده از ترازوی دیجیتال وزن شد و به استثنای فرکشن آبی، 1 میلی­لیتر از DMSO به عنوان حلال استفاده گردید. از محیط کشت RPMI به عنوان حلال برای فرکشن آبی استفاده شد. غلظت نهایی استوک فرکشن­ها 20 میلی­گرم در میلی­لیتر بود و تا زمان تیمار سلول‌ها با غلظت­های مورد نظر، در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری گردید. محیط کشت RPMI برای رقیق‌سازی فرکشن­ها از استوک اولیه استفاده شد و غلظت نهایی DMSO در غلظت­های مورد مطالعه به زیر 01/0 رسید و نیازی به کنترل DMSO نبود. مخلوط حاضر را به مدت 24 ساعت روی شیکر قرار داده و پس از طی این مدت، نمونه را با کاغذ صافی و قیف صاف کرده و حجم مایع به دست آمده را با روتاری کم نمودیم. پس از آن نمونه تغلیظ شده را درون ویال وزن شده ریخته و منتظر خشک شدن کامل آن شدیم که فرکشن حاصل از آن، فرکشن اتردوپترولی است. سپس ویال محتوی تفاله گیاه را وزن کرده و از اختلاف وزن نمونه خشک شده و ویال وزن شده، وزن تفاله خشک به دست می‌آمد. آن را زیر هود به نسبت 1 به 10 با حلال کلروفرم مخلوط نمودیم. 24 ساعت روی شیکر قرار داده و سپس مانند مرحله قبل آن را صاف کردیم. مایع صاف شده را تغلیظ کرده و زیر هود خشک نمودیم که فرکشن کلروفرمی از آن به دست آمد. در مرحله بعد، تفاله را با حلال متانول به طریق گفته شده 24 ساعت خیسانده و صاف کردیم. نمونه صاف شده را تغلیظ کرده و به عنوان فرکشن متانولی استفاده نمودیم. روی تفاله باقی‌مانده به نسبت 1 به 10 آب ریخته و با قیف بوخنر صاف نمودیم و مایع زیرین آن که فرکشن آبی است، درون ظرف فریزدرایر ریخته و داخل فریزر گذاشتیم.
 
2- کشت سلولی و تیمار سلول‌ها:
    مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود و بدین منظور از رده سلولی Nalm-6 مربوط به لوسمی لنفوبلاستیک حاد استفاده شد. هم‌چنین سلول­هایPBMC  به عنوان سلول‌های تک هسته‌ای خونی طبیعی و کنترل، برای ارزیابی عدم تاثیر دارو بر سلول­های خونی مورد استفاده قرار داده شد. رده سلولی  Nalm-6از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران (تهران، ایران) تهیه شد. به منظور کشت سلولی، ابتدا مراحل یخ‌زدایی سلول­ها از تانک ازت انجام شد. سپس سلول­ها در محیط RPMI 1640 (آمریکا، جیبکو) حاوی10% FBS و 1% پنی‌سیلین - استرپتومایسین کشت داده شدند. فلاسک­های کشت سلولی در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با 5% CO2 انکوبه شدند. برای جداسازی سلول­های PBMC ، مقدار 20 میلی‌لیتر از خون فرد طبیعی در ضد انعقاد هپارین گرفته شد و به نسبت 1 به 1 با PBS فیلتر شده رقیق گردید. یک سوم حجم نهایی هر فالکون، فایکول ریخته شد و خون رقیق شده به آرامی با سمپلر از کنار دیواره فالکون بر روی فایکول ریخته شد. به دلیل سمی بودن فایکول، باید این مرحله به سرعت انجام گردد. سلول‌ها به همراه فایکول در سانتریفوژ بدون ترمز با دور  g 600  به مدت 25 دقیقه سانتریفوژ شدند.
پس از پایان سانتریفوژ، از پایین به بالا شاهد 4 لایه سلولی شامل گلبول‌های قرمز، گرانولوسیت­ها، فایکول، سلول‌های PBMC و در نهایت پلاسما هستیم. لایه پلاسما با سمپلر به آرامی دور ریخته شد. سلول‌های PBMC که لایه ابر مانندی را تشکیل داده بودند، توسط پیپت پاستور استریل به یک فالکون تمیز منتقل و جهت شست و شو و خروج فایکول به آن PBS فیلتر شده اضافه شد. سلول‌ها با دور g350 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شدند. این کار سه مرتبه تکرار گردید. در مرحله آخر پس از خروج مایع رویی، محیط کشت RPMI به همراه FBS و آنتی­بیوتیک اضافه شد و در پلیت 6 خانه کشت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با 5% CO2 انکوبه گردید. بعد از این که سلول­ها به قدر کافی رشد کردند، سلول‌های Nalm-6  و PBMC با غلظت­های مختلف از فرکشن کلروفرمی، اتردوپترولی و آبی به مدت 24 و 48 ساعت تیمار شدند. غلظت­های مختلف عصاره ها با استفاده از محیط کشت استریل رقیق سازی و تهیه شد و تمامـی آزمایـش‌ها بـرای افـزایش دقـت کار سه بار تکرار گردید.
 
3- رنگ‌آمیزی تریپان‌بلو:
    برای شمارش سلول­های زنده جهت بررسی میزان بقا و
تکثیر سلول­های تیمار شده نسبت به کنترل، از رنگ‌آمیزی تریپان بلو و لام هموسیتومتر(نئوبار) استفاده شد. پس از 24 و 48 ساعت از کشت سلول‌ها با غلظت­های ذکر شده از فرکشن­های کلروفرمی، اتردوپترولی و آبی گیاه جونیپروس اکسلسا در چاهک‌های پلیت 24 خانه، رنگ تریپان‌بلو به نسبت 1 به 1 به محیط موجود در چاهک‌ها اضافه شد و پس از 5-3 دقیقه زیر میکروسکوپ بررسی گردید. اساس این آزمایش بدین ترتیب است که سلول‌های زنده نسبت به ورود رنگ تریپان‌بلو نفوذ ناپذیر می­باشند، در حالی که سلول‌های مرده رنگ را جذب می­نمایند. میزان زنده‌مانی سلول‌های زنده با فرمول زیر محاسبه شد.

 
4- آزمون MTT به منظور سنجش فعالیت متابولیک :
    برای سنجش تاثیر عصاره‌های کلروفرمی، اتردوپترولی و آبی گیاه جونیپروس اکسلسا بر میزان فعالیـت متابولیک، سلول­های لوسمیک Nalm-6 و طبیعی PBMC با دوزهای مختلف از فرکشن­ها در چاهک‌های پلیت 96 خانه تیمار شدند. پس از 24 و 48 ساعت انکوباسیون در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO2 ، به سلول­های داخل هر چاهک 10میکرولیتر محلول MTT (4,5 dimethyl diphenyl tetrazolium bromide) با غلظت mg/mL 5 اضافه شد و پلیت مجدداً به مدت 3 ساعت در انکوباتور قرار گرفت. در طی زمان انکوباسیون، رنگ تترازولیوم موجود در محلول MTT به وسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز احیا می­شود. احیا و شکسته شدن این رنگ موجب تولید کریستال­های آبی رنگ فورمازان می­شود. میزان رنگ تولید شده با تعداد سلول­هایی که از نظر فعالیت متابولیک فعال هستند (سلول‌های زنده) رابطه مستقیم دارد.
    در ادامه پلیت با دور g 2000 به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شده و پس از خالی کردن محلول رویی، 100 میکرولیتـر حـلال DMSO بـرای حــل رسوب رنگی فورمازان ایجاد شده که نامحلول در آب هستند به هر چاهک اضافه شد و جذب نوری چاهک‌ها با استفاده از دستگاه رنگ سنجی EISA-reader در طول موج 570 نانومتر قرائت گردید.


درصد فعالیت متابولیک سلول‌ها طبق فرمول بالا محاسبه گردید.

5- آزمـون فلـوسیتومتری بـه منظور سنجش میزان آپوپتوز:
    به منظور تایید آپوپتوز در سلول‌های لوسمیک تحت تاثیر فرکشن‌های جونیپروس اکسلسا، از آزمون فلوسیتومتری انکسین PI/V استفاده شد. ابتدا سلول‌ها در محیط RPMI حاوی FBS 10% در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد حاوی 5% CO2 به منظور دسترسی به تعداد مورد نظر از سلول­ها، کشت شدند. طبق دستورالعمل کیت (Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC ، بیوساینس) برای هر آزمون به 105×3  سلول در هر میلی­لیتر نیاز است. سلول‌ها در پلیت 6 خانه با غلظت‌های 5/1 تا 5/2 میکروگرم در میلی­لیتر عصاره کلروفرمی جونیپروس اکسلسا به مدت 48 ساعت تیمار شدند. و هم‌چنین2 نانوگرم در میلی­لیتر داروی وین کریستین تیمار و به مدت 48 ساعت انکوبه شدند.
    بعد از انکوباسیون، سلول‌ها به فالکون منتقل شده و سانتریفوژ شدند و مایع رویی آن دور ریخته شد. رسوب سلولی پس از یک بار شستشو با PBS ، با 500 میکرولیتر از بافر باند کننده X 1 مواجه شد. در ادامه 5 میکرولیتر انکسین V به نمونه ها اضافه شد و پس از 10 دقیقه انکوباسیون در تاریکی، این بار 5 میکرولیتر رنگ PI (Propidium Iodide) اضافه و مجدداً 10 دقیقه انکوبه شد. سپس نمونه‌ها به ویال‌های مربوط به فلوسیتومتری منتقل شدند و میزان خروج فسفاتیدیل سرین در سطح سلول­ها توسط دستگاه فلوسیتومتری مورد سنجش قرار گرفت و نتایج توسط نرم‌افزار FlowJo 7.6.1 آنالیز شد.
 
یافته‌ها
    اثر فرکشن‌های کلروفرمی، اتردوپترولی و آبی گیاه J.excelsa بر روی شاخص زنده‌مانی سلول‌های Nalm-6 و PBMC :
    نتایـج آزمایـش زنده‌مانی سلولی پس از24 و 48 ساعت
از تیمار سلول­ها با فرکشن‌های یاد شده از گیاه جونیپروس اکسلسا، نشان داد که غلظت 5/2 و 3 میکروگرم در میلی‌لیتر از فرکشن کلروفرمی پس از 48 ساعت نسبت به گروه کنترل (تیمار نشده)، میزان زنده‌مانی سلولی را به طور قابل ملاحظه‌ای کاهش داد. در فرکشن اتردوپترولی کاهش معنادار درصد سلول­های زنده پس از 48 ساعت در غلظت 4 و 5 میکروگرم در میلی­لیتر نسبت به گروه کنترل رخ داد در حالی‌که فرکشن آبی فاقد اثرات سایتوتوکسیک قابل مشاهده در بازه غلظتی مورد آزمایش بود.
    هم‌چنین سلول‌های PBMC به عنوان سلول­های طبیعی خونی در تیمار با فرکشن‌های ذکر شده، کاهش معناداری در میزان زنده‌مانی سلولی نشان ندادند. پس از مشاهده تاثیرات فرکشن­ها بر شاخص زنده‌مانی سلولی، به دلیل بی‌اثر بودن فرکشن آبی بر سلول­های Nalm-6 در غلظت‌های 50 تا 150 میکروگرم در میلی­لیتر، این عصاره در ادامه برای آزمون­های بیشتر از مطالعه خارج شد(نمودار 1).
 
اثر فرکشن‌های کلروفرمی و اتردوپترولی بر فعالیت متابولیک سلول‌های Nalm-6 وPBMC :
    نتایج حاصل از بررسی فعالیت متابولیکی سلول با روش MTT نشان داد که پس از 48 ساعت از تیمار سلول­های Nalm-6 با فرکشن کلروفرمی و اتردوپترولی گیاه جونیپروس، به صورت وابسته به دوز و زمان کاهش معناداری در فعالیت متابولیکی سلول‌ها نسبت به گروه کنترل (تیمار نشده) رخ داد. بدین ترتیب که در فرکشن کلروفرمی با شروع افزایش غلظت از 2 میکروگرم در میلی­لیتر بین دو گروه تیمار 24 ساعت و 48 ساعت، اختلاف معنادار در درصد فعالیت متابولیک سلول­ها مشاهده شد. هم‌چنین طبق نتایج آزمون MTT ، دوز IC50 فرکشن کلروفرمی پس از 48 ساعت تیمار سلولی که حداقل 50% از سلول­ها در آن زنده هستند، 5/2 میکروگرم در میلی­لیتر محاسبه گردید. فرکشن اتردوپترولی نیز با افزایش غلظت از 4 میکروگـرم در میلـی­لیـتر در دو گـروه زمانی ذکر شده، اختلاف معنادار در درصد فعالیت متابولیک سلول­ها را نشان داد. طبق این آزمون، دوز IC50 فرکشن اتردوپترولی نیز 4 میکروگرم در میلی­لیتر محاسبه شد. سلول‌های PBMC با غلظت‌های ذکر شده با این فرکشن‌ها تیمار شد و کاهش مختصری در فعالیت متابولیک سلولی گزارش گردید که معنادار نبـود(نمودار 2).


نمودار 1: تاثیر فرکشن­های کلروفرمی، اتردوپترولی و آبی گیاه J.excelsa بر شاخص زنده‌مانی سلول­های لوسمیک Nalm-6 و سلول­های PBMC (*بیانگر 05/0 p< ، ** بیانگر 01/0 p< و *** بیانگر 001/0 p<).
 


نمودار 2: بررسی و مقایسه میزان فعالیت متابولیک سلول­های لوسمیک Nalm-6 و سلول­های PBMC پس از تیمارهای 24 و 48 ساعت با  فرکشن­های کلروفرمی، اتردوپترولی و آبی گیاه J.excelsa (*بیانگر 05/0 p< ، ** بیانگر 01/0 p< و *** بیانگر 001/0 p<).
 


شکل 1: بررسی میزان آپوپتوز سلول­های Nalm-6 توسط آزمون فلوسیتومتری پس از 48 ساعت با دوزهای 5/1 تا 5/2 میکروگرم در میلی­لیتر از فرکشن کلروفرمی گیاه J.excelsa


بررسی آپوپتوز با روش فلوسیتومتری انکسین PI/V :
    نتایج حاصل از آنالیز فلوسیتومتری آپوپتوز سلولی نشان داد که فرکشن کلروفرمی گیاه جونیپروس، قادر به افزایش قابل توجه آپوپتوز در سلول‌های Nalm-6 به صورت وابسته به دوز می­شود. درصد سلول‌های انکسین V مثبت طی تیمار با غلظت 5/2 میکروگرم در میلی­لیتر فرکشن کلروفرمی از 1 درصد در سلول­های کنترل، به 10 درصد در سلول­های تیمار شده افزایش یافت. هم‌چنین درصد سلول­هایی که هر دو مارکر انکسینV و PI را مثبت نشان دادند از 3 درصد در سلول‌های گروه کنترل، به 41 درصد در سلول­های تیمار شده با غلظت 5/2 میکروگرم در میلی‌لیتر از این فرکشن افزایش یافت(شکل 1).
 
آزمون­های آماری:
    داده‌های مطالعه با کمک نرم‌افزار 23SPSS آنالیز شد. برای ارزیابی اختلاف آماری بین گروه­های مورد مطالعه (تیمار شده و کنترل) از آزمونone-way-ANOVA  استفاده شد و از 05/0 p< برای معناداری آزمون­ها استفاده گردید. هم‌چنین 01/0 p< و 001/0 p< به ترتیب نشانگر میزان معناداری بیشتر نسبت به گروه کنترل بودند.
 
بحث
    لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL) در دسته شایع‌ترین گروه لوسمی‌ها قرار دارد و به طور میانگین سالانه حدود 30% از بدخیمی­های کودکان را به خود اختصاص می­دهد. نتایج مطالعه حاضر بر روی فرکشن­های مختلف گیاه جونیپروس نشان از اثر مهاری رشد بر روی رده سلولی Nalm-6 داشت. یافته­های به دست آمده از آزمون زندهمانی و فعالیت متابولیک سلولی نشان داد که در فرکشن کلروفرمی، دوزهای 5/2 میکروگرم در میلی­لیتر به بالا پس از 48 ساعت به طور معناداری نسبت به کنترل، درصد سلول­های زنده را کاهش داد. پس از آن اثرات سایتوتوکسیک فرکشن اتردوپترولی در غظت­های بالاتر از 4 میکروگرم در میلی­لیتر به طور معناداری باعث کاهش بقای سلولی گردید. این درحالی است که فرکشن آبی حتی تا غلظت 150 میکروگرم در میلی­لیتر فاقد اثرات مهاری رشد بود. در مطالعه­ای که توسط اسماعیلی و همکـاران در
سال 2014 انجام شد، اثرات سایتوتوکسیک عصاره تام جونیپروس و فرکشن­های کلروفرمی، اتردوپترولی و متانولی آن بر روی رده های سلولی MCF-7،  HepG-2، MDBK ، A-549 و WEHI-164  توسط آزمون MTT بررسی شد و نشان داد که IC50 فرکشن­های یاد شده به مراتب پایین‌تر از عصاره تام این گیاه می­باشد(13). هم‌چنین در مطالعه دیگری که در ایران انجام شد، اثر سایتوتوکسیک عصاره اتانولی برگ و دانه­های دو زیر گونه از گیاه جونیپروس بر روی رده‌های سلولی Hela ، KB وMDA-MB-468 بررسی گردید.
    نتایج نشان داد غلظت‌های بالاتر از 5 میکروگرم در میلی­لیتر دارای اثرات سایتوتوکسیک می­باشد(11). در مطالعه دیگری، اثر عصاره متانولی و فرکشن‌های کلروفرمی و اتردوپترولی این گیاه بر مهار رشد تومور بررسی گردید. نتایج حاصل از آن نشان داد که عصاره متانولی با 86% و فرکشن اتردوپترولی با 46% نسبت به داروی وینکریستین به ترتیب دارای بیشترین و کمترین اثر مهارکنندگی رشد تومور است(14). در مطالعه پیش رو، نتایج به دست آمده از بررسی آپوپتوز سلولی با آزمون فلوسیتومتری نشان داد غلظت 5/2 میکروگرم در میلی­لیتر از فرکشن کلروفرمی توانست به طور قابل ملاحظه‌ای (13 برابر) میزان آپوپتوز سلولی را نسبت به گره کنترل افزایش دهد. همان طور که در شکل 1 مشاهده شد، در این غلظت بیش از نیمی از سلول­ها دچار آپوپتوز شده و مارکرهای انکسینV و PI را بیان کردند که همسو با نتایج آزمون MTT بود. در مطالعه درویشی و همکارانش، اثر آپوپتوتیک عصاره متانولی این گیاه بر روی رده سلولی بررسی گردید. در مطالعه آن‌ها، غلظت 4 میکروگرم در میلی­لیتر به عنوان IC50 عصاره متانولی بر روی رده سلولی Nalm-6 و Reh  معرفی گردید. آن‌ها نشان دادند که عصاره متانولی جونیپروس اکسلسا با داروی وینکریستین به طور معنادار دارای اثر سینرژی بوده و توانست دوز وینکریستین را در رده سلولی Nalm-6 و Reh کاهش دهد(5).
    در بررسی­های انجام شده پیرامون عصاره گیاه جونیپروس اکسلسا، مشخص شد که بیشترین اجزای مولکولی موجود در آن به ترتیب شامل ترکیبات فنولی(mg/g 54/21)، فلاونوئیدها(از عصاره یا فرکشن mg/g 66/19)، تانن­ها(از عصاره یا فرکشن mg/g 96/17)، آلکالوئیدها (از عصاره یا فرکشن mg/g 23/15) و دیترپن­ها (از عصاره یا فرکشن mg/g 43/14) می­باشد. هم‌چنین این ترکیبات دارای اثرات متعدد بر فرآیندهای حیاتی سلول از جمله متابولیسم، چرخه سلولی، آپوپتوز و ایجاد ترکیبات آنتی‌اکسیدانی است. با توجه به حلال­های متنوع مورد استفاده در فرآیند فرکشن‌گیری از عصاره­های گیاهی، مولکول­های مختلف از نظر قطبیت و ویژگی­های ساختاری در طی این پروسه، جداسازی می­شوند. طبق مطالعه‌های انجام شده بر روی ترکیبات موجود در فرکشن­ها و عصاره J.excelsa ، آلکالوئیدها در فرکشن اتردوپترولی وجود ندارند. از آن‌جا که ترکیبات آلکالوئیدی به شدت دارای خاصیت آنتی­پرولیفراتیو هستند، از این رو به نظر می‌رسد علت اختلاف موجود در میزان سایتوتوکسیسیتی بین فرکشن کلروفرمی و اتردوپترولی مربوط به وجود آلکالوئیدها در فرکشن کلروفرمی باشد(15، 14). از جمله دیگر ترکیبات ثانویه موجود در این گیاه می­توان به  پودوفیلوتوکسین و دئوکسی پودوفیلوتوکسین اشاره کرد که خواص ضد تومورال آن به اثبات رسیده است(16). در مطالعه اوچ و همکارانش، گیاه J.excelsa به عنوان منبع غنی از این ترکیبات محسوب شده اثرات کشندگی آن بر
رده­های سلولی
J 45.01 ، CEM-C1و CCRF-CEM بررسی گردید و نشان دادند که بین میزان پودوفیلوتوکسین و دئوکسی پودوفیلوتوکسین و اثرات کشندگی این گیاه رابطه معناداری وجود دارد(10). ساب و همکاران در بررسی انجام شده بین دو رده سلولی حساس به دارو CCRF-CE و مقاوم به دارو CEM/ADR5000 نسبت به روغن گیاه J.excelsa ، نشان دادند هیچ مقاومت دارویی نسبت به روغن استخراج شده از این گیاه مشاهده نشد(17).
 
نتیجه‌گیری
    در مطالعه حاضر، برای اولین بار اثرات کشندگی فرکشن­های مختلف گیاه J.excelsa بر روی رده سلولی  Nalm-6 بررسی شد. بر اساس اختلاف قطبیت متابولیت‌های ثانویه، می­توان استنباط کرد که ترکیبات موجود در فرکشن­های کلروفرمی، اتردوپترولی و آبی J.excelsa  متفاوت بوده و اساس تفاوت در میزان کشندگی آن‌ها می­باشد. پیشنهاد می­گردد در مطالعه‌‌های بعدی پیرامون این گیاه، مکانیسم ایجاد آپوپتوز توسط فرکشن­های یاد شده در سلول­های سرطانی بررسی شود و ترکیبات ثانویه این گیاه، به عنوان پایه­ای برای ساخت ترکیبات جدید ضد سرطان مورد استفاده قرار گیرد.
ارسال پیام به نویسنده مسئول

ارسال نظر درباره این مقاله
نام کاربری یا پست الکترونیک شما:

CAPTCHA


XML   English Abstract   Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Noorazar L, Esmaeili S, Mashati P, Gharebaghian A, Salari S. Investigating the apoptotic and anti-proliferative effects of Juniperus excelsa fractions on Acute Lymphoblastic leukemia cell line (Nalm-6). Sci J Iran Blood Transfus Organ. 2020; 17 (4) :276-286
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1362-fa.html

نورآذر لیلا، اسماعیلی سمیه، مشاتی پرگل، قره باغیان احمد، سالاری سینا. اثر آپوپتوتیک و آنتی‌پرولیفراتیو فرکشن های گیاه Juniperus excelsa بر روی رده سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد(Nalm-6). فصلنامه پژوهشی خون. 1399; 17 (4) :276-286

URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1362-fa.html



جلد 17، شماره 4 - ( زمستان 1399 ) برگشت به فهرست نسخه ها
فصلنامه پژوهشی خون Scientific Journal of Iran Blood Transfus Organ
The Scientific Journal of Iranian Blood Transfusion Organization - Copyright 2006 by IBTO
Persian site map - English site map - Created in 0.2 seconds with 31 queries by YEKTAWEB 4280