[صفحه اصلی ]   [Archive] [ English ]  
:: صفحه اصلي :: درباره نشريه :: آخرين شماره :: آرشيو مقالات :: جستجو :: ثبت نام :: ارسال مقاله :: تماس با ما ::
:: جلد 17، شماره 2 - ( تابستان 1399 ) ::
جلد 17 شماره 2 صفحات 100-112 برگشت به فهرست نسخه ها
سطح میکروRNA های mir-222 ، mir-92a و mir-223 در میکروپارتیکل‌های مشتق شده از پلاکت در فرآورده‌های پلاکتی تهیه شده به روش پلاسمای غنی از پلاکت در طول مدت ذخیره‌سازی
قاسم عباس زاده، دکتر کامران عطاردی، دکتر کامران موسوی حسینی
استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
واژه‌های کلیدی: میکرو RNA، پلاکت، پلاسما
متن کامل [PDF 823 kb]   (140 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (566 مشاهده)
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: بانك خون
انتشار: 1399/4/10
متن کامل:   (145 مشاهده)
سطح میکروRNA های mir-222 ، mir-92a و mir-223 در میکروپارتیکل‌های
مشتق شده از پلاکت در فرآورده‌های پلاکتی تهیه شده به روش پلاسمای غنی از پلاکت
در طول مدت ذخیره‌سازی
 
قاسم عباس‌زاده1، کامران عطاردی2، میرکامران موسوی حسینی3
 
چکیده
سابقه و هدف
سنجش تغییرات بیان میکرو RNAهای پلاکتی، یکی از شاخص‌های ارزیابی ضایعات ناشی از ذخیره‌سازی پلاکت محسوب می‌شود. هدف از مطالعه، بررسی سطح تغییرات در بیان mir-223 و mir-92a و mir-222 طی دوران ذخیره‌سازی در پلاکت‌های تهیه شده به روش پلاسمای غنی از پلاکت، به عنوان شاخصی برای ارزیابی ضایعات ذخیره‌سازی بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه تجربی، 5 واحد کنسانتره پلاکتی تهیه شده به روش PRP از اهداکنندگان خون جمع‌آوری گردید و به مدت 5 روز در دمای 22 درجه سانتی‌گراد همراه با آژیتاسیون نگهداری شد. تغییرات در سطح بیان mir-223 ، mir-92a و mir-222 با استفاده از روش qRT- PCR طی روزهای صفر، سه و پنج ذخیره‌سازی اندازه‌گیری شد. نتایج با استفاده از نرم‌افزار GenEX نسخه 7 با آزمون paired-sample t-test تجزیه و تحلیل گردید.
یافته‌ها
طی این مطالعه مشخص شد بیان mir-223 در روزهای سوم و پنجم ذخیره‌سازی نسبت به روز صفر افزایش یافت(001/0 p<). بیان mir-92a نیز در روز سوم و پنجم نسبت به روز صفر نیز افزایش معناداری را نشان داد (05/0 p<). از طرفی بیان mir-222 به تدریج در طول مدت زمان ذخیره‌سازی طی پنج روز کاهش یافت(05/0 p< ).
نتیجه گیری
مطالعه نشان داد که تعیین پروفایل miRNA های میکروپارتیکل‌ها در کنسانتره­های پلاکتی در کنار پارامترهای رایج مانند شمارش پلاکت‌ها، تعیین MPV و حجم فرآورده پلاکتی، شمارش لکوسیت‌ها، بررسی swirling و تعیین pH فرآورده پلاکتی می­تواند ابزار مفیدی برای شناسایی آسیب­های سلولی مرتبط با ضایعات ذخیره‌سـازی پلاکت و شاخص بالقوه­ای بـرای ارزیابی کیفیت و قابلیت زیستی پلاکـت­های ذخیـره شده در in vitro باشد.
کلمات کلیدی: میکرو RNA ، پلاکت، پلاسما
 
 
 
 
 
تاریخ دریافت: 16/11/98
تاریخ پذیرش:  6  /2 /99
 

1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- PhD هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- مؤلف مسئول: دکترای تخصصی شیمی دارویی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
 

مقدمه
    کنسانتره پلاکتی، یکی از فرآورده‌های اصلی به دست آمده از خون است. میلیون‌ها فرآورده پلاکتی در هر سال برای درمان بسیاری از بیماران مبتلا به اختلالات پلاکتی تزریق می‌شوند و زندگی بسیاری به واسطه تزریق این فرآورده‌ها به طور مستقیم متاثر می‌شود. لذا بهبود روش‌ها و استراتژی‌هایی‌ که کیفیت فرآورده‌های خونی را ارزیابی می‌کنند، همواره مورد نیاز است تا از ایمن بودن و کارآمد بودن این فرآورده‌ها برای بیماران اطمینان حاصل گردد(2، 1). در اغلب کشورها، فرآورده‌های پلاکتی در دمای 24-20 درجه سانتی‌گراد همراه با آژیتاسیون به مدت 3 تا 5 روز نگهداری می‌شوند(3). شرایط ذخیره‌سازی و نگهداری در in-virto سبب می‌شود پلاکت‌ها تحت تغییرات مورفولوژیک و فیزیولوژیک قرار بگیرند. یکی از دلایل اصلی مدت زمان محدود نگهداری فرآورده‌های پلاکتی، ضایعات ناشی از ذخیره‌سازی یا PSL است که کیفیت و کارآیی فرآورده‌های پلاکتی را کاهش می‌دهد(7-4). PSL یک رویداد پیچیده است که در آن هر دو فرآیند فعال‌سازی و آپوپتوز نقش دارند. طی دوران ذخیره سازی، میکروپارتیکل­های پلاکتی به واسطه فعال­سازی یا آپوپتوز پلاکت­ها تولید می­شوند و نقش مهمی را در انتقال محتویات پلاکتی از جمله میکرو RNAها و بروز عوارض نامطلوب ناشی از تزریق پلاکت ایفا می­کنند(12-8). متعاقب تزریق فرآورده­های پلاکتی، میکرو RNAها هم به میزبان منتقل می­شوند که می­تواند اهمیت بالینی به سزایی داشته باشد. برخی از میکرو RNAهای پلاکتی سبب اختلال در عملکرد سلول‌های اندوتلیال و در نتیجه اختلال در فرآیندهای تنظیم هموستاز می‌شوند. بدین ترتیب ممکن است در بروز اختلالات ترومبوتیک نیز سهیم باشند(23-13). تعیین پروفایل بیان این گروه از miRNA ها در کنسانتره­های پلاکتی، می­تواند ابزار مفیدی برای شناسایی آسیب­های سلولی مرتبط با ضایعات ذخیره­سازی پلاکت platelet storage lesion (PSL) یا platelet storage defect (PSD) و شاخص بالقوه­ای برای ارزیابی کیفیت و قابلیت زیستی پلاکت­های ذخیره شده در شرایط in vitro باشد(24، 4). به علاوه ممکن است نتایج حاصل به مدیریت عوارض نامطلوب متعاقب تزریق پلاکت‌ها و مدیریت مصرف فرآورده­های پلاکتی کمک نماید. لذا در این مطالعه تغییرات در سطح بیان میکرو RNA های mir-92a ، mir-222 و mir-223 را که متعاقب انتقال به سلول اندوتلیال موجب تغییر و تعدیل عملکرد بیولوژیک این سلول می‌شوند، طی روزهای صفر، سه و پنج ذخیره‌سازی در کنسانتره‌های پلاکتی تهیه شده به روش پلاسمای غنی از پلاکت مورد سنجش قرار دادیم.
 
مواد و روش‌ها
آماده‌سازی و ذخیره‌سازی کنسانتره‌های پلاکتی:
    در این مطالعه تجربی، 5 واحد کنسانتره پلاکتی رندوم از اهداکنندگان داوطلب خون مراجعه‌کننده به پایگاه تهران در سال 1397 به شکل تصادفی انتخاب شد. معیار ورود اهداکنندگان خون به مطالعه، اهداکنندگان سالمی بودند که بر اساس معیارهای تدوین شده توسط سازمان انتقال خون ایران برای انتخاب اهداکننده سالم، توسط پزشک واحد اهداکنندگان پایگاه انتقال خون تهران غربالگری شدند. طی فرآیند انتخاب، نوع و جنس کیسه‌های کنسانتره‌های پلاکتی و جنسیت، سن و گروه خونی اهداکنندگان لحاظ نگردید. کنسانتره‌های پلاکتی رندوم بلافاصله پس از تهیه و اتمام زمان استراحت(2 ساعت در دمای 2±22 درجه سانتی‌گراد) مطابق با استانداردهای ملی سازمان انتقال خون ایران، تحویل گرفته شد. فرآورده‌های پلاکتی پس از تحویل از واحد آزمایشگاه فرآوری خون پایگاه تهران، به ستاد مرکزی منتقل گردید. برای انتقال این فرآورده‌ها طبق دستورالعمل سازمان انتقال خون ایران، از محفظه‌های مخصوص حمل پلاکت دارای دیتالاگر استفاده شد و کنسانتره‌های پلاکتی در عرض کمتر از30 دقیقه به ستاد مرکزی انتقال یافت.
    پس از انتقال و پیش از ذخیره‌سازی، به منظور کاهش لکوسیت‌ها، مهم‌ترین مداخله‌کننده در نتیجه مطالعه، کنسانتره‌های پلاکتی از فیلترهای کاهنده لکوسیت in-line عبور داده شدند. سپس با توزین واحدها، حجم کنسانتره‌های پلاکتی محاسبه شده و واحدهایی با Swirling  و حجم مناسب انتخاب گردیدند. پس از انتخاب واحدهای
پلاکتی در دمای 2±22 درجه سانتی‌گراد به مدت پنج روز با آژیتاسیون مداوم در انکوباتور پلاکتی مرکز تحقیقات نگهداری گردید.
    در این مطالعه برای مقایسه نتایج به دست آمده و محاسبه میانگین‌ها از آزمون آماری t-test Paired sample استفاده گردید. مقادیر 05/0 p< از نظر آماری مهم و قابل توجه در نظر گرفته شدند. داده‌ها وارد نرم افزار GenEx  نسخه 7 گردید و مقایسه و میانگین متغیرهای مورد نظر در روزهای صفر، سه و پنج ذخیره‌سازی در کنسانتره‌های پلاکتی تعیین شد.
 
فرآیند جداسازی میکروپارتیکل‌های پلاکتی:
    برای حفظ استریلیتی کنسانتره‌های پلاکتی طی دوران ذخیره‌سازی، نمونه‌برداری از کورد متصل به کیسه و در زیر هود در شرایط استریل انجام گرفت. برای این منظور 5 میلی‌لیتر از کنسانتره پلاکتی به لوله فالکون منتقل گردید. سپـس شمـارش اولیه پلاکتی با استفاده از دستگاه سل‌کانتر کالیبره sysmex XS 800i (سیـس‌مکـس ـ ژاپن) روی نمونه انجام شد و واحدهایی با شمارش پلاکتی حداقل 1010 × 5/5 و شمارش لکوسیتـی کمتـر از 102× 2/0 و 2/6 pH≥ انتخاب شدند(24). لوله‌های فالکون حاوی کنسانتره پلاکتی به مدت 10 دقیقه در دور xg 200 به منظور رسوب سلول‌ها سانتریفیوژ شدند. پس از اتمام سانتریفیوژ، مایع رویی به لوله فالکون دیگری منتقل شده و مجدد در دور xg 2100 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردید. این مرحله جهت اطمینان از رسوب کامل پلاکت‌ها و سلول‌های باقی مانده مجدداً تکرار شد. در مرحله بعد، مایع رویی حاوی پلاسما و میکروپارتیکل‌ها از رسوب سلولی ته لوله جدا شده و به لوله فالکون دیگری منتقل گردید و در نهایت در سانتریفیوژ یخچال‌دار به مدت یک ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با دور xg 20000 قرار داده شد. پس از خارج نمودن مایع رویی به منظور اطمینان از خروج حداکثری پروتئین‌های پلاسما، رسوب ته لوله دو مرتبه با محلول (PBS )Phosphate Buffer Solution فاقد کلسیم و منیزیم به مدت یک ساعت در دور 20000xg  شستشو داده شد. ایـن مـراحل بـرای تمامـی نمونه‌هـا در طـــی دوران ذخیره‌سازی انجام گرفت(27-25، 20).
 
تعیین سایز و هویت میکروپارتیکل‌ها:
    برای تعیین سایز و اندازه میکروپارتیکل‌های جداسازی شده از روش  Dynamic light scattering با حداقل 500 میکرولیتر از محلول حاوی میکروپارتیکل‌ها استفاده شد. در این تحقیق تایید و تعیین منشاء پلاکتی میکروپارتیکل‌های جداسازی شده با کمک دستگاه فلوسیتومتری Partec-PAS-III CY flow (آلمان، Partec GmbH) و آنتی‌بادی CD41 کونژوگه با FITC و آنتی‌بادیCD61 کونژوگه با FITC انجام شد. برای این منظور 3 میکرولیتر از آنتی‌بادی مورد نظر به هر نمونه اضافه گردید و سپس به مدت 30 دقیقه در مکانی تاریک انکوبه شد. گیت میکروپارتیکل‌های پلاکتی نیز بر روی forward scatter (FCS) و side angle scatter (SSC) با استفاده ازcalibrator beads با ابعاد 9/0 میکرومول، 5/0 میکرومول و 3/0 میکرومول مشخص گردید. از آنتی‌بادی IgG1-FITC به عنوان کنترل منفی استفاده شد.
 
استخراج میکروRNA ها:
    در این مطالعه از روش دستی استخراج microRNA ها استفاده گردید. به نمونه حاوی میکروپارتیکل به مقدار µL 500 محلول ترایزول سرد اضافه شد. برای اطمینان از این که لیز میکروپارتیکل‌ها به طور کامل انجام می‌شود، نمونه حاوی ترایزول به مدت 30 ثانیه ورتکس گردید. بعد از ورتکس، نمونه برای حدود 5 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت. در طی این مدت نوکلئوپروتئین‌ها کاملاً تجزیه می‌شوند. در مرحله بعد µL 100 کلروفرم به نمونه افزوده شد و نمونه به مدت 15 ثانیه مخلوط گردید. در ادامه به مدت 2-3 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. بعد از اتمام زمان انکوباسیون، نمونه به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با دور xg 12000 سانتریفیوژ گردید با اتمام سانتریفیوژ، سه فاز در لوله نمونه تشکیل می‌شود. فاز قرمز فنول ـ کلروفرم در ته لوله، یک فاز میانی و یک فاز آبی بی‌رنگ در بالای لوله. فاز رویی آبی بی‌رنگ حاوی RNA می‌باشد که با دقت با استفاده از سمپلر و در زاویه 45 درجه به میکروتیوب RNase free منتقل گردید. از آن جایی که مقدار RNA پلاکت بسیار ناچیز است، لذا برای رسوب بهینه به مایع حاصل از مرحله قبل، µL 5 گلیکوژن اضافه گردید و نمونه به مدت 18 ساعت در دمای 20- درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. بعد از اتمام دوره انکوباسیون، به مقدار µL 500 الکل اتانول مطلق سرد افزوده شد و در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه قرار گرفت. در این مرحله حتی قبل از سانتریفیوژ، پلت ژل مانند RNA در ته لوله قابل مشاهده است. سپس در دور xg 12000 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ انجام گرفت و مایع رویی خارج گردید. به منظور شستشوی پلت RNA در ته میکروتیوب، از µL 500 الکل اتانول 70% سرد استفاده شد. بعد از افزودن الکل اتانول سرد، میکروتیوب برای 10 دقیقه در دور xg 8000 در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. سپس با اتمام سانتریفیوژ، مایع‌رویی خارج گردید. در نهایت بعد از آخرین مرحله شستشو، پلت RNA ته میکروتیوب به منظور خارج شدن باقی‌مانده الکل در دمای اتاق به مدت 5 تا 10 دقیقه قرار گرفت. در این مرحله بایستی دقت داشت تا پلت ته میکروتیوب کامل خشک نشود. بعد از این مدت در حدود 20 تا 5 میکرولیتر آب تیمار شده با دی‌اتیل پیروکربنات (DEPC : diethyl pyro carbonate) به میکروتیوب اضافه کرده و آن را در دمای 70- درجه سانتی‌گراد تا زمان ساخت cDNA نگهداری نمودیم(28).
 
ساخت cDNA و بررسی آنالیز بیان miRNA با Quantitative Reat Time PCR :
    پس از استخراج RNA و اندازه‌گیری غلظت آن با دستگاه نانودراپ ، cDNA مربوط به هر miRNA با استفاده از کیت(بن‌یاخته، ایران) ساخته شد. ساخت cDNA شامل دو مرحله بود. در مرحله اول واکنش poly A polymerase  طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت در دمای 75 درجه سانتی‌گراد صورت گرفت و در مرحله دوم ساخت cDNA  پـس از افـزودن تـرکیبات لازم بـه همـراه آنزیـم RT طبق
دستورالعمل شرکت سازنده کیت انجام شد(جدول 1).
 
جدول 1: مواد و مقادیر استفاده شده در ساخت cDNA از miRNA

   
برای تعیین بیان نسبی
miRNA های انتخابی، از Quantitative Real Time PCR استفاده شد. مقدار cDNA استفاده شده 1 میکرولیتر و مقدار هر کدام از آغازگرهای اختصاصی و عمومی  برای miRNA های انتخابی 5/0 میکرولیتر بود. برنامه PCR استفاده شده برای بیان ژن miRNA به ترتیب عبارت بود از: دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 دقیقه و یک چرخه که با دمای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 ثانیه ادامه یافت. تکثیر در دمای 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و 40 چرخه انجام شد. در مطالعه حاضر از  snRNA U6 جهت طبیعی‌سازی نتایج qRT-PCR استفاده گردید(جدول 2)(شکل‌های 1 ، 2 و 3).
 
جدول 2: مواد و مقادیر استفاده شده در qRT-PCR
 



شکل 1: نمونه‌ای از منحنی Real Time PCR برای mir-223 طی روزهای صفر، سوم و پنجم ذخیره‌سازی


شکل 2: نمونه‌ای از منحنی Real Time PCR برای mir-92a طی روزهای صفر، سوم و پنجم ذخیره‌سازی


شکل 3: منحنی Real Time PCR برای mir-222 طی روزهای صفر، سوم و پنجم ذخیره‌سازی
 

    پس از انجام واکنش‌های qRT-PCR ، تغییرات بیان miRNA های مورد مطالعه با استفاده از فرمول -∆∆ct2 به کمک نرم‌افزار GenEX نسخه 7 مورد ارزیابی و تحلیل قرار گرفت(28).
  
یافته‌ها
نتایج فلوسیتومتری و DLS برای ارزیابی میکروپارتیکل‌ها:
    نتایج حاصل از ارزیابی میکروپارتیکل‌های جدا شده از کنسانتره‌های پلاکتی در طی روزهای صفر، سه و پنج ذخیره‌سازی با روش فلوسیتومتری، نشان داد که قریب به 90% از وقایع شمارش شده برای رنگ‌آمیزی شاخص سطحی CD40 با استفاده از anti-CD40–FITC مثبت بودند.
به علاوه نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی میکروپارتیکل‌های مذکور برای شاخص سطحی
CD61 با استفاده از anti-CD61-FITC نیز مشخص کرد که تقریباً 88% از وقایع شمارش شده برای شاخص سطحی CD61 مثبت بودند. آنالیز یافته‌های DLS برای ارزیابی اندازه میکروپارتیکل‌های استخراج شده طی دوران ذخیره‌سازی نیز نشان داد که میانگین توزیع اندازه بیش از 95% ذرات استخراج شده بین µm 1-1/0 می­باشند. به علاوه شدت تفرق نور که متناسب با ابعاد ذرات می‌باشد، طی دوران ذخیره‌سازی افزایش می‌یابد. نتایج حاصل از ارزیابی با روش‌های فلوسیتومتری و DLS بیانگر مطلوب بودن روش استفاده شده برای استخراج میکروپارتیکل‌ها بود(شکل‌های 4 و 5).
 
 
شکل 4: نمونه‌ای از نتایج فلوسیتومتری به روز شاخص‌های سنجی CD41 و CD61 بر سطح میکروپارتیکل‌های پلاکتی: به ترتیب A و B مربوط به ایزوتیپ کنترل IgG ، C و D نمودار Gating و هیستوگرام شاخص سطحی CD-41 رنگ‌آمیزی شده با anti-CD41-FITC . E و F نمودار Gating و هیستوگرام شاخص سطحی CD-61 رنگ‌آمیزی شده با anti-CD61-PITC
 


شکل 5 : نمونه‌ای از نمودارهای توزیع اندازه ذرات برحسب شدت نور متفرق شده با استفاده از روش  DLSبه ترتیب A) میانگین توزیع اندازه میکروپارتیکل‌ها در روز صفر ذخیره‌سازی. (B میانگین توزیع اندازه میکروپارتیکل‌ها در روز سه ذخیره‌سازی. (C میانگین توزیع اندازه میکروپارتیکل‌ها در روز پنج ذخیره‌سازی.
 

نتایج حاصل از تعیین سطح بیان میکرو RNA های انتخابی با استفاده از qRT-PCR :
    در این مطالعه با ارزیابی تغییرات در بیان miRNA-223  در میکروپارتیکل‌های 5 واحد کنسانتره پلاکتی طی روزهای صفر، سه و پنج، مشخص شد که در روز سوم ذخیره‌سازی نسبت به روز صفر، بیان میکروRNA مورد نظر به طور چشمگیری افزایش یافت(001/0 p<).  این افزایش در روز پنجم نسبت به روز صفر نیز مشاهده شد. به گونه‌ای که میانگین تغییرات بیان mir-223 در روز پنجم در
مقایسه با روز صفر حدود 4 برابر افزایش بیان را نشان داد(001/0
p<). افزایش بیان این میکروRNA در روز پنجم ذخیره‌سازی نسبت به روز سوم نیز معنادار بود(05/0 p<)(جدول 3)(شکل 6).
    به علاوه در این مطالعه مشخص شد که تغییرات قابل توجهی در سطح بیان mir-92a متعاقب ذخیره‌سازی در شرایط in-vivo طی روزهای صفر، سه و پنج رخ می‌دهد. بیان mir-92a نیز در روز سوم(05/0 p <) و پنجم(05/0 p<) نسبت به روز صفر افزایش مشخصی را نشان داد.
 
 
 
جدول 3: تغییرات بیان میکروRNAهای مورد مطالعه طی روزهای مختلف ذخیره‌سازی با استفاده از نتایج qRT-PCR



شکل 6: تغییرات پروفایل
microRNA های انتخابی طی روزهای صفر، سه و پنج ذخیره‌سازی با qRT-PCR  : اطلاعات ارائه شده بر مبنای انحراف معیار ± میانگین


    تجزیه و تحلیل داده‌های حاصل از qRT-PCR برای سنجش تغییرات در پروفایل mir-222 ، روند کاهشی در بیان میکرو RNA مذکور را نشان داد. به گونه‌ای که بیان mir-222 به تدریج در طول مدت زمان ذخیره‌سازی طی پنج روز کاهش می­یابد(05/0 p<). در روز پنجم ذخیره‌سازی، کاهش بیان این میکرو RNA به حدود 2 برابر در مقایسه با سطح بیان آن در روز صفر می‌رسد. میزان بیان این میکرو RANدر روز سوم نسبت به روز صفر کاهش معناداری را نشان داد(جدول 3)(شکل 6)(05/0 p<).
 
بحث
    در ایـن مطالعـه تجزیـه و تحلیـل نتایج حاصل از qRT-PCR برای تعیین تغییرات در سطح بیان میکرو RNA های mir-233 , mir- 92a , mir-222 در کنسانتره‌های پلاکتی تهیه شده به روش پلاسمای غنی از پلاکت طی روزهای صفر، سه و پنجم نگهداری در شرایط in-vitro ، مشخص کرد که پروفایل بیان میکروRNA های انتخابی طی دوران ذخیره‌سازی، دستخوش نوسانات معناداری می‌شود.
    پلاکت‌ها میزبان ترانسکریپتوم متنوعی(تقریباً 5-10 × 2 گرم در هر پلاکت) می‌باشند که از تقریباً 9500 RNA پیامبر(mRNA) و کلاس‌های متفاوتی از RNA های کوچک غیر کدکننده تشکیل می‌شوند. پلاکت‌ها این متریال‌های ژنتیکی را نیز از سلول اجدادی‌شان، مگاکاریوسیت، نگه می­دارند. تقریباً 80% از این RNA های کوچک غیر کدکننده، از نوع میکروRNA هستند. میکروRNAها، RNAهای کوچک غیر کدکننده به طول 19 تا 24 نوکلئوتید می‌باشند که به طور اندوژنوس بیان شده و در تنظیم پس از رونویسی بیان ژن به طور منفی دخیل هستند(31-29، 9، 6). امروزه از ارزیابی میکروRNA های پلاکتی، فراتر از نقش بیولوژیک شان در تنظیم فرآیندهای فیزیولوژیک، به عنوان بیومارکرهایی برای تشخیص، پیگیری و کنترل بیماری‌های مختلف به طور گسترده‌ای استفاده می‌شود(33-30، 24). بر مبنای گزارشی از تحقیقات پیشین، میکروRNA های محدودی به عنوان بیومارکرهای کیفی برای ارزیابی ضایعات ناشی از ذخیره‌سازی پلاکت مورد استفاده قرار گرفته‌اند. اغلب این میکروRNAها در ارتباط با تنظیم فرآیندهای دخیل در فعال‌سازی و آپوپتوز نقش دارند و در پاسخ به تغییرات و محرک‌های محیطی، بیان شان تغییر می‌کند تا پاسخ مناسب پلاکتی را تنظیم نمایند(36-34، 10). بنابراین miRNA ها، نقشی حیاتی در بیولوژی پلاکت‌ها طی شرایط ذخیره‌سازی ایفا می‌کنند(24). مهم‌تر این که پلاکت‌ها قادرند متعاقب فعال‌سازی، حداقل بخشی از miRNA های خود را در میکروپارتیکل های پلاکتی(PMP) منتشر کنند و بدین ترتیب عملکرد سلول‌های دریافت‌کننده را تحت تاثیر قرار بدهند(37).
    لافونت و همکاران نشان دادند که PMP ها به عنوان حاملین بین سلولی برای انتقال مجموعه Ago2-microRNA عمل می‌کنند و بدین ترتیب بیان سلولی ژن‌ها و عوامل اپی‌ژنتیک در سلول‌های گردش خون، به ویژه سلول‌های اندوتلیال را تعدیل و تنطیم می‌نمایند(20). تحقیقات در مورد این که چگونه miRNA ، بیان mRNA پلاکتی را تنظیم می‌کنند و چه تاثیری بر روی سایر سلول‌های هدف متعاقب تزریق فرآورده‌های پلاکتی اعمال می‌نمایند، برای درک بیشتر ما از مکانیسم‌های مولکولار ضایعات نگهداری پلاکت‌ها و ارزیابی بیولوژی پلاکت‌ها در طی ذخیره‌سازی و کاهش عوارض نامطلوب متعاقب ترانسفیوژن و مدیریت ذخایر فرآورده‌های پلاکتی در بانک‌های خون ارزشمند است(24، 4). از طرفی دیگر، درک این مکانیسم‌های مولکولار می‌تواند در بهبود کیفیت و افزایش طول عمر نگهداری پلاکت‌ها نقش به سزایی داشته باشد(24، 9). با وجود مطالعه‌های گسترده در مورد میکروپارتیکل‌های پلاکتی و نقش آن‌ها در ضایعات ذخیره‌سازی پلاکت، اما گزارش‌ها و مطالعه‌ها در مورد محتوی میکروRNA ای آن‌ها محدود می‌باشند. امروزه تعامل بین میکروپارتیکل‌های پلاکتی و miRNA های پلاکتی کاملاً مشخص شده است به طوری که mir-223 و mir-126 فراوان‌ترین mir های موجود در میکروپارتیکل‌های پلاکتی محسوب می‌شوند(38).
    در مطالعه حاضر بیان mir-222 ، mir-92a و mir-223 در روزهای صفر، سه و پنج ذخیره سازی درمیکروپارتیکل‌های استخراج شده از کنسانتره‌های پلاکتی تهیه شده به روش پلاسمای غنی از پلاکت با استفاده از روش qRT-PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. الگوی بیان سه microRNA مورد مطالعه در طی روزهای صفر، سه و پنج ذخیره‌سازی به طور قابل ملاحظه‌ای تغییر یافت. بدین ترتیب که بیان -223 mir در طی دوران ذخیره‌سازی روندی افزایشی را نشان می‌دهد. به گونه‌ای که بیان این میکرو RNA در روز سوم ذخیره‌سازی نسبت به روز صفر، به طور قابل چشمگیری افزایش یافت. این افزایش در روز پنجم نسبت به روز صفر نیز مشاهده شد. افزایش بیان این mir در روز پنجم ذخیره‌سازی نسبت به روز سوم نیز معنادار بود. نتایج به دست آمده در مطالعه ما مشابه نتایج تحقیق ژاهو یوان و همکاران در سال 2018 می‌باشد. آن‌ها نیز افزایش بیان mir-223 در فرآورده‌های پلاکتی طی مدت ذخیره‌سازی را نشان دادند. به علاوه آن‌ها با استفاده از روش فلوسیتومتری، تاثیر تنظیمی mir-223 بر روی پروتئین‌های مرتبط و فعال‌سازی گیرنده P2Y12 را اثبات کردند. طی مطالعه آن‌ها مشخص شد که mir-21 طی دوران ذخیره‌سازی، دچار تنظیم کاهشی می‌شود. P2Y12 ، که نقش مهمی در فعال‌سازی و تجمع پلاکت‌ها ایفا می­کند، می‌تواند GPb/IIIa را با تنظیم مسیر سیگنالینگ اگریگیشن فعال کند. لذا تصور کردند که miR-223 و miR-21 عملکرد گلیکوپروتئین GPIIb/IIIa را با تنظیم P2Y12 تحت تأثیر قرار می‌دهند(35). بنابراین افزایش بیان mir-223 طی دوران ذخیره‌سازی، با کاهش قابلیت زیستی و کیفیت کنسانتره‌های پلاکتی مرتبط می‌باشد. به علاوه مشخص شده است که  میکروپارتیکل­های پلاکتی حاوی microRNA-223 به طور ترجیحی توسط سلول­های اندوتلیال برداشت می­شوند(20). یی‌پان و همکارانش گزارش کردند که microRNA-223 دریافت شده از پلاکت­ها سبب افزایش محصولات انتهایی گلیکاسیون القاکننده آپوپتوز از طریق هدف­گیری گیرنده فاکتور رشد شبه انسولینـ 1(IGF – 1 R) در سلول پذیرنده می­گردد و به واسطه مهار بیان IGF-1R ، آپوپتوز را در سلول‌های اندوتلیال عروق القا می­کند(18، 17).
    نقش microRNA-223 مشتق شده از میکروپارتیکل­های پلاکتـی در تنظیـم بیـان دو ژن داخلـی سلـول انـدوتلیال؛ FBXW7 و Ephrin-A1؛ و ژنEFNA1 در هر دو سطح mRNA و پروتئین اثبات شده است(20). افزایش بیان mirRNA-223 سبب کاهش سطح mRNA FBXW7 و افزایش سطح و فعالیت cyclin E می­شود. افزایش بیان pre-mir223 ، پرولیفراسیون، مهاجرت و جوانه­زنی و تشکیل tube (یکی از مراحل آنژیوژنز) القا شده توسط فاکتورهای رشد VEGF و bFGF سلول­های اندوتلیال طی فرآیند آنژیوژنز را مهار می­کند. mir-223 نه تنها بر روی فعال‌سازی  ERK1/2 القاء شده توسط فاکتور رشد اثر می‌گذارد بلکه با کاهش تنظیمی بیان B1- اینتگرین در سلول­های اندوتلیال، سبب مهار فسفوریلاسیون گیرنده‌های VEGFR2 و FGFR1  القا شده توسط فاکتورهای رشد VEGF و bFGF و هم چنین مهار فعال‌سازی مسیر سیگنالینگ Akt نیز می­گردد(39). علاوه بر این، فاکتور RhoB نیز به عنوان یکی از اهداف mir-223 محسوب می‌شود که متعاقب افزایش بیان mir-223 سطح آن کاهش یافته و این امر موجب مهار آنژیوژنز می‌گردد(40). علاوه بر این، افزایش مدت زمان ذخیره‌سازی فرآورده‌های پلاکتی، باعث کاهش سطح بیان miR-21 و miR-155 در روز 5 و به دنبال آن افزایش miR-223 ، miR-3162 و 1et-7b میشود که مستقیماً روی تجمع پلاکتی وبه تبع آنPSL  تاثیرگذار است(41)
    طی مطالعه حاضر بیان mir-92a در میکروپارتیکل‌های پلاکتی طی روزهای سوم و پنجم نسبت به روز صفر، با افزایش معناداری همراه بود. به علاوه این روند افزایشی در بیان طی روز سوم نسبت به روز پنجم نیز مشاهده شد. افزایش بیان mir-92a در مطالعه دیگری که بیان miRNA پلاکتی در 100 کنسانتره پلاکتی تهیه شده به روش بافی‌کوت را  بررسی کرده بود نیز ذکر شده است. پونتس و همکاران تغییرات در بیان 10 microRNA با فراوانی بالا را  در 100 کنسانتره پلاکتی طی روزهای 1 تا 7 ذخیره‌سازی با استفاده از روش qRT-PCR مورد ارزیابی قرار دادند. طی مطالعه‌های وی نیز  مشخص شد که تا روز پنجم ذخیره‌سازی نیز بیان mir-92a افزایش می‌یابد(42). ژن‌های متعددی توسط این mir تنظیم می‌شوند. mir-92a در تنظیم بیان KLF2 و KLF4 در اندوتلیوم عروق مشارکت داشته و با فنوتیپ هتروژنیک پروـ آتروژنیک مرتبط است(43). فانگ و همکارانش دریافتند که mir-92a هم در سطح رونویسی و هم در سطح ترجمه، هر دو فاکتور KLF2  و KLF4 را مهار می­کند(13). خاویر لویر و همکارانش مشخص کردند که mir-92a به عنوان athero-mir طی فرآیند آترواسکلروز دچار افزایش تنظیمی می‌شود. به علاوه آن­ها نشان دادند که مهار mir-92a در in vivo ، گسترش پلاک آترواسکلروتیک، التهاب سلول­های اندوتلیال و اتصال مونوسیت­ها به سلول­های اندوتلیوم را محدود و مهار می­کند(29). برخلاف mir-92a و mir-223 ، طی مطالعه ما مشخص شد که بیان mir-222 به تدریج در طول مدت زمان ذخیره‌سازی طی پنج روز روندی کاهشی را طی می‌کند. میزان کاهش بیان این mir در روز سوم نسبت به روز صفر نیز مشاهده شد. تغییرات فیزیولوژیکی پلاکت‌ها با هر دوی کاهش و افزایش تعداد miRNA ها در حین دوران ذخیره‌سازی مرتبط هستند. در طی فرآیند ذخیره‌سازی پلاکت‌ها در بانک‌های خون، کاهش فراوانی miRNA ممکن است به دلیل استرس شار، تخریب توسط نوکلئازها، فعال شدن و آپوپتوز پلاکت‌ها، که از دلایل عمده ریلیز وزیکول‌های خارج سلولی حاوی miRNA هستند و عوامل متعدد دیگری باشد. در کنار این عوامل، بایستی استرس ناشی از فرآیند پیری را نیز اضافه کرد. احتمالاً، تغییرات پس از رونویسی ممکن است بیوژنز miRNA و دوام آن‌ها را در زمان ذخیره‌سازی در شرایط ex-vivo تحـت تـأثیر قرار دهد. از طرفی دیگر، افزایش mir های بسته‌بندی شده در میکروپارتیکل‌ها نیز ممکن است بیانگر تشدید فرآیند PSL باشد. به علاوه می‌تواند نشان‌دهنده فعال شدن پروسه‌ها و مکانیسم‌های دخیل در فرآیند بلوغ آن‌ها باشد. برای نمونه پیش‌سازهای miRNA
مرتبط با پیری توسط آنزیم‌های ویرایش‌کننده RNA به miRNA های بالغ تبدیل می‌شوند. طی این فرآیند پیش‌ساز‌های miRNA  و هم چنین برخی از رونوشت‌های اولیه RNA می‌توانند به مولکول‌های RNA کوچکتر شکسته شوند که ممکن است نقش سرکوب‌کنندگی در فرآیند ترجمه ایفا نمایند(45، 44، 34).
 
نتیجه‌گیری
    با توجه به نتایج حاصل از مطالعه حاضر و مطالعه‌های پیشین پیشنهاد می‌گردد که کنسانتره‌های پلاکتی که مدت زمان طولانی‌تری در شرایط in-vitro ذخیره می‌شوند، با احتیاط بیشتری برای بیماران مستعد وقایع ترومبوتیک استفاده شوند. به علاوه تعیین پروفایل میکروRNAهای میکروپارتیکل‌های پلاکتی در کنار شاخص‌ها و پارامترهای رایج مانند: شمارش پلاکت‌ها، تعیین میانگین حجم پلاکتی (MPV)، تعیین حجم فرآورده‌های پلاکتی، شمارش لکوسیت‌ها، بررسی swirling و تعیین pH فرآورده پلاکتی می‌تواند ابزار مفیدی برای کنترل کیفی و ارزیابی ضایعات ناشی از ذخیره‌سازی فرآورده‌های پلاکتی محسوب شود.
 
تشکر و قدردانی 
    از زحمات کلیه همکاران محترم پایگاه انتقال خون بابل و تهران، همکاران بخش بانک خون بند ناف و مرکز نوآوری‌های ستاد مرکزی و به ویژه از استاد گرانقدر آقای سمیعی که در انجام این پژوهش ما را یاری رساندند صمیمانه سپاسگزاریم. این مقاله منتج از پایان‌نامه کارشناسی ارشد مصوب مرکز تحقیقات مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون با کد اخلاق IR.TMI.REC.1397.023 می‌باشد. بدین وسیله از زحمات این بزرگواران نیز تقدیر و تشکر می‌شود. 
ارسال پیام به نویسنده مسئول

ارسال نظر درباره این مقاله
نام کاربری یا پست الکترونیک شما:

CAPTCHA


XML   English Abstract   Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Abbaszadeh G, Atarodi K, Mousavi Hosseini K. Evaluation of microRNAs; mir223, mir222 and mir92a levels in the Platelet-derived microparticles in the Platelet concentrates produced by Platelet Rich Plasma method during storage. Sci J Iran Blood Transfus Organ. 2020; 17 (2) :100-112
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1330-fa.html

عباس زاده قاسم، عطاردی کامران، موسوی حسینی کامران. سطح میکروRNA های mir-222 ، mir-92a و mir-223 در میکروپارتیکل‌های مشتق شده از پلاکت در فرآورده‌های پلاکتی تهیه شده به روش پلاسمای غنی از پلاکت در طول مدت ذخیره‌سازی. فصلنامه پژوهشی خون. 1399; 17 (2) :100-112

URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1330-fa.html



جلد 17، شماره 2 - ( تابستان 1399 ) برگشت به فهرست نسخه ها
فصلنامه پژوهشی خون Scientific Journal of Iran Blood Transfus Organ
The Scientific Journal of Iranian Blood Transfusion Organization - Copyright 2006 by IBTO
Persian site map - English site map - Created in 0.2 seconds with 31 queries by YEKTAWEB 4227