چکیده سابقه و هدف سقط مکرر بیانگر وضعیتی است که فرد 2 یا 3 سقط پشت سر هم قبل از هفته 20 بارداری را تجربه کند، که در 2 تا 5 درصد بانوان احتمال بروز دارد. پلی‌مورفیسم ژنHPA-1 به عنوان عامل اصلی آلوایمیونیزاسیون در مادران باردار و ایجاد FNAIT و عوارض وابسته به آن و همین طوربه عنوان یکی از فاکتورهای ترومبوفیلی مرتبط با سقط مکرر، مطرح میباشد. هدف این مطالعه، بررسی میزان ناسازگاری و پلی‌مورفیسم ژن HPA-1 در زوجین ایرانی با سابقه سقط مکرر بود. مواد و روش‌ها در یک مطالعه توصیفی ـ مقطعی، 75 زوج با سابقه حداقل دو سقط مکرر ایدیوپاتیک(طبق پرونده پزشکی) که در سال 1395 به بیمارستان تخصصی زنان و زایمان صارم مراجعه کردند، مورد بررسی قرار گرفتند. نمونه خون در لوله EDTA جمع‌آوری شد و فراوانی آلل‌های HPA-1 a, b به روش مولکولی PCR-SSP تعیین شد. فراوانی ژنی با استفاده از معادله هاردی وینبرگ محاسبه گردید. سطح اطمینان 05/0 p< در نظر گرفته شد. یافته‌ها میانگین سنی بانوان بررسی شده 7 ± 32 سال و میانگین تعداد سقط 9/0 ± 5/2 مورد بود. در این جمعیت، وفور ژنHPA-1a100% به دست آمد و ژن HPA-1b مشاهده نشد. نتیجه گیری نتایج مطالعه حاضر بیانگر آن است که پلی‌مورفیسم ژن HPA-1و[CybeR1] آلوایمیونیزاسیون احتمالی بر علیه HPA-1aدر بروز سقط نقشی ندارد و برای مشخص شدن علت سقط مکرر ایدیوپاتیک نیاز به بررسی سایر عوامل میباشد. کلمات کلیدی: پلاکت‌ها، سقط مکرر، ترومبوسیتوپنی
تاریخ دریافت: 6 /4 /97 تاریخ پذیرش: 29/5/97
1- کارشناس ارشد خون‌شناسی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- مؤلف مسئول: متخصص بیماری‌های عفونی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665 3- PhD ایمنی‌شناسی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 4- کارشناس ارشد بیوشیمی ـ مربی مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 5- دکترای ایمونولوژی ـ مرکز تحقیقات باروری و ناباروری صارم ـ پژوهشکده سلولی مولکولی و سلول‌های بنیادی صارم ـ بیمارستان فوق تخصصی صارم ـ تهران ـ ایران
مقدمه سقط مکرر یا عادتی، وضعیتی میباشد که فرد 2 یا 3 سقط پشت سر هم قبل از هفته 20 بارداری را تجربه کند. طبق آمار در 5-2 درصد بانوان این عارضه محتمل است. تقریباً 25%-15% کل بارداری‌هایی که توسط سیستم پزشکی شناسایی می‌شوند، به طور ناگهانی سقط می‌شوند ولی تعداد بسیار بیشتری قبل از تشخیص پزشکی در مراحل لقاح و لانه گزینی از بین می‌روند(2، 1).دلایل اتیولوژیک متعددی نظیر عوامل ژنتیکی، آناتومیک، بیماری‌های اتوایمیون، عفونت‌ها و اختلالات غدد اندوکرین برای بروز سقط مکرر ذکر شده است. ولی تقریباً در50% موارد علت آن نامشخص میباشد(3). غشاء پلاسمایی پلاکت‌ها از تعداد زیادی گلیکوپروتئین و فسفولیپید تشکیل شده است، بیشترین شمار آنتی‌ژن‌های پلاکتی شناخته شده و همین طور HPA-1 روی گلیکوپروتئین IIb/IIIa قرار دارند(4). پلی‌مورفیسم آنتی‌ژن پلاکتی نوع 1، HPA-1a/1b ناشی از یک جهش نقطه‌ای در نوکلئوتید 1565 در اگزون شماره 2 ژن GPIIIa میباشد که منجر به جایگزینی تیمین با سیتوزین میگرددو در نتیجه اسید آمینه شماره 33 زیر واحد b تغییر می‌کند و لوسین به پرولین تبدیل می‌شود(6، 5). در بسیاری از مطالعه‌ها پلی‌مورفیسم HPA-1 به عنوان فاکتور ترومبوفیلی در زنان یا زوجین با سابقه سقط مکرر بررسی شده است و ارتباط این فاکتور با مسأله سقط در برخی از این مطالعه‌ها مشاهده شده است(10-7). در برخی دیگر تاثیر حضور این فاکتور به عنوان عامل ترومبوفیلی دخیل در سقط مشاهده نگردیده است(12، 11، 3). در مطالعه‌ای که مزیری در سال 1385 به بررسی تاثیر پلی‌مورفیسم HPA- 1 در زنان با سابقه سقط مکرر و گروه کنترل پرداخت، تاثیر پلی‌مورفیسم این آنتی‌ژن بر سقط مکرر مشاهده نشد(13). در بین آنتی‌ژن‌های پلاکتی متعددی که بر سطح پلاکت‌ها حضور دارد، HPA-1 به عنوان عامل اصلی در آلوایمیونیزاسیون مادری- جنینی در جمعیت سفید پوست مطرح میباشد و عامل 85%-75% موارد FNAIT (Fetal/Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia) است(13).
امروزه FNAIT اصلی‌ترین عامل ترومبوسیتوپنی شدید در نوزادان زنده، شناخته شده است و تقریباً دلیل 40% از مراجعات نوزادان به بخش مراقبت ویژه محسوب می‌شود. FNAIT درحال حاضر به عنوان عارضه‌ای پیچیده در بارداری مطرح است که عوارضی شدید و متناقض دارد. FNAIT رایج‌ترین علت خونریزی مغزی ICH (Intra Cerebral Hemorrhage ) در جنینقبل از هفته 20 بارداری و هم‌چنین در نوزادان کامل و سالم میباشدکه می‌تواند منجر به عوارض دائمی عصبی و یا مرگ شود(13). در مطالعه‌ای که در سوئد در سال 2017 با هدف بررسی اثر FNAIT بر میزان مرگ و میر انجام شد، به بررسی آلوآنتی‌بادی‌های مادر در نوزادانی که با عارضه ICH متولد شدند، پرداخته شد و بیان شد که نقش ترومبوسیتوپنی در بروزICH کمتر از میزانی است که مطالعه‌های قبل گزارش کرده‌اند و عوامل دیگری غیر از ترومبوسیتوپنی در بروز ICH دخیلند(14). برخی مطالعه‌ها احتمال بروز سقط قبل از هفته 20 جنینی با مکانیسم مشابه FNAIT را پیشنهاد کرده‌اند؛ مکانیسم‌هایی هم چون خونریزی در نتیجه ترومبوسیتوپنی، ایجاد ترومبوز در جفت، به علاوه سیتوتوکسیسیته سلولی با واسطه NK Cell بر علیه b3 اینتگرین‌های سطح تروفوبلاست‌های جفت نیز در اثر پلی‌مورفیسم ژنیHPAs مطرح شده‌اند(15). در زمینه غربالگری FNAIT در کشورهای مختلف مانند لهستان و نروژ، مطالعه‌های کوهورت صورت گرفته است و مطالعه‌های مشابهی نیز در هلند و چین در حال انجام است ولی تاکنون هیچ کشوری روش غربالگری روتین جهت شناسایی موارد FNAIT را به کار نبرده است (17، 16، 14، 13).بیشتر مطالعه‌های صورت گرفته مربوط به جمعیت سفید پوست میباشد و آلوایمیونیزاسیون بر علیه HPA-1aموجب اکثر موارد آلوایمیونیزاسیون علیه HPAs شناخته شده است. تفاوت در فراوانی HPAs در جوامع و قومیت‌های مختلف، نشان‌دهنده تنوع در الگوی فراوانی HPAs میباشد و این مسأله لزوم مطالعه فراوانی این آنتی‌ژن‌ها در جوامع مختلف را مشخص می‌سازد، لذا در این مطالعه فراوانی آللـی و ژنـی HPA-1 و میـزان نـاسازگاری آن در زوجین ایرانی با سابقه سقط مکرر به روش PCR-SSP (Sequence Specific Primed-PCR) بررسی شد.
مواد و روش‌ها مطالعه حاضر از نوع توصیفی- مقطعی بود که در آن 75 زوج با سابقه حداقل دو سقط مکرر خود به خودی ایدیوپاتیک از میان مراجعه‌کنندگان به بیمارستان فوق تخصصی زنان و زایمان صارم تهران، وارد مطالعه شدند. انتخاب این افراد با نظر متخصص زنان و زایمان بر اساس پرونده پزشکی و به صورت تصادفی در روزهای مختلف مراجعه صورت گرفت، این افراد از نظر عوامل مؤثر در سقط مکرر مانند کاریوتیپ، عوامل آناتومیک، اختلالات هورمونی، عوامل عفونی و ایمونولوژیک بررسی شده و فاقد عامل اتیولوژیک سقط بودند که این اطلاعات از پرونده پزشکی ایشان منتج گردید. از افرادی که در مطالعه شرکت کردند جهت رعایت اخلاق پزشکی رضایت‌نامه دریافت گردید. این مطالعه، مصوبه کمیته اخلاق در پژوهش مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ایران را به شماره IR.TMI.REC.1395.002 دریافت کرد. نمونه‌های خون (4 میلی‌لیتر خون کامل) در لوله‌های حاوی EDTA جمع‌آوری گردید. برای استخـراج DNA از گلبول‌های سفید موجود در بافی‌کوت و کیت کیاژن که دارای ستون مخصوص میباشد استفاده شد. برای آمپلیفیکاسیون از روش Touch down استفاده شد و هدف از استفاده از این روش، کاستن از واکنش‌های غیر اختصاصی در روند PCR بود(جدول 1). دو لوله واکنش جداگانه برای تعیین ژنوتیپ 2 آلل مورد نظر (HPA-1a, 1b) استفاده شد(جدول 2). حجم کلی محتوای واکنش 20 میکرولیتر بود(جدول 3). پس از انجام مراحل تکثیر، محصولات PCR روی ژل آگارز 2% الکتروفورز شد و با استفاده از رنگ‌آمیزی سایبرگرین و ترانس لومیناتور UV مشاهده و بررسی گردید. اندازه مورد انتظار برای هر آلل مشخص شد(جدول 4). تعیین ژنوتیپ HPAs با استفاده از نتایج PCR صورت گرفت و وفور مشاهده شده شمارش گردید. فراوانی حاصله برای مطابقت با معادله هاردی وینبرگ به وسیله آزمون کای‌دو بررسی شد. سپس از نرم‌افزار معادله مذکور، وفور ژنی (که اساس آن مبتنی بر 1=ab2+2b+2a است) محاسبه گردید،در این فرمول a وb نشان‌دهنده وفور اشکال آللی هر یک از ژن‌های مورد بحث می‌باشند. جهت مقایسه وفور آللی در جمعیت مورد مطالعه با سایر جمعیت‌ها از آزمون آماری مقایسه نسبت(آزمون Z)
جدول 1: برنامه Touch down دستگاه ترمال سایکلر
مرحله
دما(درجه سانتی‌گراد)
زمان
چرخه (40 n=)
فعال‌سازی
95
10دقیقه
x 1
مرحله اول تکثیر 1
دناتوراسیون
96
25 ثانیه
x 5
آنیلینگ
68
45 ثانیه
اکستنشن
72
30 ثانیه
مرحله اول تکثیر 2
دناتوراسیون
96
25 ثانیه
x 20
آنیلینگ
61
45 ثانیه
اکستنشن
72
30 ثانیه
مرحله اول تکثیر 3
دناتوراسیون
96
25 ثانیه
x 15
آنیلینگ
51
1 دقیقه
اکستنشن
72
2 دقیقه
سرد کردن
4
3 دقیقه
x 1
جدول 2: توالی آغازگرها، اندازه هر آغازگر و غلظت نهایی و دمای هر کدام
سیستم
آنتی‌ژن
سایز (bp)
دما (ºC)
غلظت نهایی (میکرومول)
سکانس‌ها
HPA-1
a 1
19
62
5/0
5 `TCACAGCGAGGTGAGGCCA 3`
b 1
19
64
5 `TCACAGCGAGGTGAGGCCG 3`
مشترک
21
66
5 `GGAGGTAGAGAGTCGCCATAG 3`
b-Actin
جلوبرنده
20
60
4/0
5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’
معکوس
20
60
5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’
جدول 3: غلظت مواد اولیه برای مراحل PCR
مواد مورد نیاز
µL/rxn
غلظت نهایی
2X Master Mix (GentBio)
10
x 1
HPA Primer (10 µM)
1
µM 5/0
Common Primer (10 µM)
1
µM 5/0
Distilledwater (DNAase &RNAase free)
4
-
DNA (30 ng/µL)
4
-
جدول 4: اندازه مورد انتظار برای هر آنتی‌ژن
آنتی‌ژن
Allele specific size (bp)
HPA-1
90
b Actin
500
استفاده شده است و 05/0 p< بیانگر تفاوت معنادار میباشد.
یافته‌ها در این مطالعه از 75 زوج نمونه‌گیری شد. نتایج PCR یک زوج به علت مناسب نبودن کیفیتDNA استخراج شده قابل اطمینان نبود و لذا از مطالعه حذف شدند. در 74 زوج مورد مطالعه، میانگین سنی خانم‌ها 7 ± 32 سال با طیف سنی 22 تا 46 سال، تعداد سقط‌ها در تاریخچه پزشکی ایشان به طور میانگین 9/0 ± 5/2 و میانگین سن حاملگی در زمان آخرین سقط 7/0 ± 5/7 هفته بود. قومیت زوج‌های فوق مورد نظر نبود و پرسش نگردید. همه زوجین دارای ژنوتیپ به صورت هموزیگوت HPA-1a/1a بودند وHPA-1b مشاهده نشد(شکل 1). فراوانی ژن HPA-1a در این جمعیت 100% یا 1 برآورد شد. بررسی ژن بتااکتین برای همه نمونه‌ها به صورت جداگانه انجام شد(شکل2[l2] ).
شکل 1: نتایج الکتروفورز محصول PCR-SSP مربوط به ژنHPA-1a : ستون اول سمت راست سایز مارکر bp 50 و ستون دوم سمت راست کنترل منفی بدون DNA میباشد. باند bp 90مربوط بهHPA-1a میباشد که درتمام ستونهای مربوط به زوجین مشاهده می‌شود.
شکل 2: نتایج الکتروفورز محصول PCR-SSP مربوط به ژن b-Actin : ستون اول سمت راست، نمونه کنترل منفی بدونDNA ستون دوم کنترل مثبت، ستون سومسایز مارکر bp 50 DNA میباشد. باند bp 500 مربوط به β-Actin در نمونه‌های آزمایش شده قابل مشاهده میباشد. برای تمام نمونه‌های مورد آزمایش PCR-SSP برای ژنβ-Actin صورت گرفت.
بحث همه زوجین در مطالعه حاضر به صورت هموزیگوت HPA-1a/1a بودند و از این نظر ناسازگاری بین آن‌ها مشاهده نشد، لذا احتمال وقوع آلوایمیونیزاسیون علیه HPA-1a در حین بارداری در زنان مورد مطالعه مطرح نمی‌باشد. بررسی پلی‌مورفیسم HPA-1 به دلیل مطرح بودن به عنوان فاکتور ترومبوفیلی و همین طور به عنوان اصلی‌ترین آنتی‌ژن پلاکتی در ایجاد عوارض ناشی از آلوایمیونیزاسیون در افراد با سابقه سقط مکرر حائز اهمیت است. جنین آنتی‌ژن‌های پدری و مادری را به ارث می‌برد و به ذات وضعیت Semi Allograft را دارا میباشد، آنتی‌ژن‌های پدری ممکن است توسط سیستم ایمنی مادر به عنوان بیگانه شناخته شود. سیستم ایمنی مادر باید ویژگی‌های منحصر به فردی داشته باشد تا بتواند به جنین Semi Allograft اجازه رشد دهد، این در حالی است که سیستم ایمنی مادر باید از مادر و جنین در برابر پاتوژن‌ها به طور مؤثر محافظت کند. اکثر این ویژگی‌های خاص ناشناخته می‌باشند(18، 14). در مطالعه حاضر با توجه به حضور 100% HPA-1a در جمعیت مطالعه شده، مشخص شد که اگر HPA-1a را به عنوان فاکتور ترومبوفیلی در نظر بگیریم عدم تجانس آلل‌های HPA-1 و در نتیجه آلوایمیونیزاسیون مادران در بروز سقط مکرر ایدیوپاتیک در زوج‌های ایرانی احتمالاً نقشی ندارد(19، 9-7 ). در بـررسی مشخـص شـد که وفور آللی این ژن در جمعیت زنان با سقط مکرر در مقایسه با وفور آللی همین ژن در اهداکنندگان ایرانی تفاوت معنادار دارد(015/0 p=)(20). ولی تفاوت وفور ژنی در دو جمعیت فوق در دو مطالعه، معنادار به دست نیامد. مطالعه‌های متعددی به بررسی عوارض ناشی از آلوایمیونیزاسیون بر علیه HPA-1a در بارداری‌های دچار عوارضی مانند سقط، ICH ، FNAIT پرداخته است که در در ادامه چند مورد ذکر می‌شوند.مورفی و همکاران با بررسی خانمی که سابقه سه جنین مبتلا به ICH داشته است، آلوایمیونیزاسیون علیه HPA-1a را عامل این عارضه برشمردند. همین طور لوکاس خانمی را که در چهار بارداری اول عوارضی مانند سقط و جنین هیدروسفال را تجربه کرده بود، بررسی کرد و ژنوتایپ او به صورت HPA-1b/1b گزارش شد. عامل این عوارض آلوایمیونیزاسیون علیه HPA-1a برشمرده شد و در بارداری پنجم و ششم با استفاده از IVIG و داروهای استروئیدی، نوزاد سالم متولد شد(22، 21). در مطالعه‌ای که در ایتالیا در سال 2005 انجام شد به بررسی ژنوتیپیHPA1-6 در 12 والد که نوزاد مبتلا به NAIT (Neonated Alluimmune Thrombocytopenia) شدید داشتند پرداخته شد و با بررسی آنتی‌بادی نتیجه‌گیری شد که HPA-1عامل اصلی آلوایمیونیزاسیون و بروز NAIT شدید بوده است(23). به علاوه در بسیاری از مطالعه‌ها پلی‌مورفیسمHPA-1 به عنوان فاکتور ترومبوفیلی در زنان یا زوجین با سابقه سقط مکرر بررسی شده است و ارتباط این فاکتور با مسأله سقط در برخی از این مطالعه‌ها مشاهده شده است(10-7). در برخی دیگر تاثیر حضور این فاکتور به عنوان عامل ترومبوفیلی دخیل در سقط مشاهده نگردیده است(12، 11، 3). در مطالعه‌ای که مزیری در سال 1385 به بررسی HPA-1 در زنان با سابقه سقط مکرر و زنان بدون سابقه سقط پرداخت، تأثیر حضور این آنتی‌ژن بر سقط مکرر مشاهده نشد(24). با توجه به حضور HPA-1a در 100% جمعیت مطالعه شده، این فاکتور نمی‌تواند به عنوان فاکتور آلوایمیونیزاسیون مؤثر در سقط و همین طور به عنوان یک فاکتور ترومبوفیلی مؤثر در سقط در جمعیت مطالعه شده مطرح باشد. مقایسه وفور آللی و ژنتیکی HPAs در اهداکنندگان اقوام مختلف بیانگر تنوع در فراوانی HPAs در کشورهای مختلف است(28-25). به نظر می‌رسد در جمعیت ایرانی نیز مطالعه‌های جداگانه‌ای بر اساس اقوام ضرورت دارد و با توجه به گستردگی قومیت‌های مختلف در ایران، فراوانی آنتی‌ژن‌های پلاکتی در این اقوام می‌تواند متفاوت باشد.
نتیجه‌گیری در جمعیـت مطالعـه شـده پلـی‌مورفیســم ژن HPA-1 نقشی در بروز سقط مکرر ندارد و تأثیر سایر عوامل در بروز این مسأله باید بررسی شود. عدم دسترسی به اطلاعات قومیت و نژاد افراد شرکت‌کننده در مطالعه حاضر از محدودیت‌های این مطالعه بود. نتیجه‌گیری در این زمینه نیازمند بررسی‌های گسترده‌تر است. از دیگر محدودیت‌های این مطالعه، عدم بررسی ژنوتیپ جنینی و بررسی آنتی‌بادی در مادر با احتمال آلوایمیونیزاسیون و همین طور بررسی افراد مورد مطالعه از نظر HLA Typing میباشد که پیشنهاد می‌شود در ادامه مطالعه‌های بعدی لحاظ گردند.
تشکر و قدردانی نتایج این مطالعه از پایان‌نامه دانشجویی مصوب در مرکز تحقیقات انتقال خون، مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ایران با کد اخلاق IR.TMI.REC.1395.002 در مقطع کارشناسی ارشد حاصل شده است. بدین‌وسیله از مرکز درمانی صارم که در امر تهیه نمونه مورد نیاز این پژوهش همکاری صمیمانه‌ای داشتند، تشکر و قدردانی می‌گردد.
Ahmadzadeh Shad G, Zadsar M, Shayegan M, Samiee S, Zare A. HPA-1 gene polymorphism in Iranian couples with history of recurrent abortion. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2018; 15 (4) :293-300 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1215-fa.html
احمدزاده شاد غزال، زادسر مریم، شایگان مژگان، سمیعی شهرام، زارع احد. ارزیابی فراوانی آنتی‌ژن پلاکتی نوع 1 در زوجین ایرانی با سابقه سقط مکرر. فصلنامه پژوهشی خون. 1397; 15 (4) :293-300
