چکیده سابقه و هدف تعداد کم سلولهای بنیادی خونساز خون بند ناف یک محدودیت جهت مصارف بالینی است. از این رو تکثیر آزمایشگاهی این سلولها به منظور دستیابی به تعداد مناسب برای مقاصد درمانی ضروری است. سیستم عصبی سمپاتیک و نوروترنسمیترها در تنظیم خود نوسازی، تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی خونساز در ریز محیط مغز استخوان نقش دارند. هدف از مطالعه، ارزیابی قدرت تکثیری نوروپپتید Y در سلولهای خونساز در شرایط آزمایشگاهی بود. مواد و روشها در یک مطالعه تجربی، مقایسه کشت سلولهای بنیادی خونساز پس از جداسازی آنها در حضور فقط سایتوکاین (SCF، TPO، FLT3 L)به عنوان گروه کنترل و در شرایط تیمار شده با غلظت۱ میکرومولار نوروپپتید Y علاوه بر سایتوکاین به عنوان آزمون انجام پذیرفت. در روز ۷ تعداد تام سلولهای هستهدار و سلولهای CD34+محاسبه گردید. قدرت کلنیزایی سلولهای تزاید یافته بررسی شد. آزمون LTC-IC نیز جهت بررسی قدرت کلنیزایی در کشت طولانی مدت انجام شد. یافتهها تکثیر ۷ روزه سلولهای بنیادی خونساز بند ناف منجر به افزایش معنادار سلولهای تام تک هستهای و CD34+ تیمار شده با نوروپپتیدY در مقایسه با گروه کنترل شد. مشاهده انواع کلنیهای مختلط، میلوئیدی و اریتروئیدی در آزمون CFU نشاندهنده حفظ قدرت تمایزی سلولهای تکثیر یافته CD34+به انواع ردههای خونی بود. سلولهای تکثیر شده با نوروپپتید Y قدرت کلنیزایی در کشت طولانی مدت را حفظ کرده بودند. نتیجه گیری مطالعه ما نشان داد نوروپپتید Y میتواند تکثیر سلولهای بنیادی خونساز را با حفظ قدرت تمایز به انواع ردهها در کشت ۷ روزه و در حضور مکمل سایتوکاینی حمایت نماید. کلمات کلیدی:خون بند ناف، سلولهای بنیادی خونساز، نوروپپتیدY
تاریخ دریافت: 27/3/96 تاریخ پذیرش: 21/6/96
1- دانشجوی کارشناسی ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- PhD ایمونولوژی ـ استاد دانشکـده پزشکـی دانشگاه تربیت مدرس و مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 3- مؤلف مسئول: PhD هماتولوژی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه پیوند سلولهای بنیادی خونساز در دهههای اخیر، به عنوان یک گزینه درمانی مناسب برای درمان بسیاری از بیماریها مورد توجه قرار گرفته است. انواع لوسمیها، آنمی آپلاستیک، آنمی داسی شکل، تالاسمیها و ... از جمله بیماریهایی میباشند که با پیوند سلولهای بنیادی خونساز درمان شدهاند. این سلولها را میتوان از سه منبع مغز استخوان، خون محیطی و خون بند ناف جداسازی کرد. با توجه به سهولت جداسازی این سلولها از خون بند ناف و همین طور با توجه به این که تا سالیانی نه چندان دور بند ناف به عنوان یک زباله تلقی و مورد توجه قرار نمیگرفت، جداسازی سلولهای بنیادی خونساز از خون بند ناف توجه محققین را به خود جلب کرد(2، 1). پیوند خون بند ناف به بیمارانی که اهداکننده سازگار خویشاوند یا غیرخویشاوند ندارند، منجر به درمان بیماریهای بدخیم بسیاری گردید. با توجه به تعداد محدود سلولهای بنیادی در خون بند ناف و تاخیر پیوند در مقایسه با مغز استخوان و خون محیطی، این روش درمانی عمدتا برای کودکان بیمار به کار گرفته شد(3). پیوند خون بند ناف در صورت عدم دسترسی به اهداکننده خویشاوند یا غیرخویشاوند سازگار به عنوان درمان انتخابی مطرح گردید. اما با توجه به دوز سلولی توصیه شده جهت پیوند خون بند ناف و وزن بالغین، این گروه از بیماران نیازمند از این روش درمانی محروم میگردند(4). یکی از ابتداییترین مطالعههایی که به منظور تسریع روند پیوند و بهبود بازیابی سیستم ایمنی مورد مطالعه قرار گرفت، تکثیر آزمایشگاهی سلولهای بنیادی یا پیشسازهای اولیه خون بند ناف بود. با افزایش دانش در مورد جایگاههای خونسازی و روشهای جدید القاء تکثیر بدون تمایز پیشسازها، بند ناف در دسترس بیشتری قرار گرفت. سابقه استفاده از روشهای تکثیر آزمایشگاهی سلولهای بنیادی به سالهای قبل بر میگردد. فرآیند تکثیر سلولهای بنیادی با جداسازی سلولهای پیشساز CD34+ یا CD133+ و انکوباسیون آنها در سرم یا محیطهای جایگزیـن همراه با فاکتورهای رشد از جمله SCF، TPO و G-CSF انجام میپذیرد. سلولهای بنیادی خونســاز در ریـز محیـط مغـز استخوان تحت تاثیر عواملی قرار میگیرند که در تعیین سرنوشت آنها مؤثر است. یکی از این عوامل تاثیرات سیستم عصبـی در کنترل ریز محیط مغز استخوان است (7-5). نوروترنسمیترهای مترشحه از سیستم عصبی سمپاتیک، نقش کلیدی در تنظیم ریز محیط مغز استخوان دارند. اگر چه مکانیسم این تغییرات ناشناخته است، بیان گیرندههای نوروترنسمیترها روی پیشسازهای خونی، گواهی بر ارتباط مستقیم سیستم عصبی و سیستم خونی است. نوروپپتید Yاز مهمترین و فراوانترین نوروترنسمیترهای عصبی در سیستم اعصاب سمپاتیک است، نوروپپتید Y با ۳۶ اسیدآمینه و وزن مولکولی ۴۲۵۳ گرم بر مول است که به همراه پپتید YY و پلیپپتید پانکراتیک جزو خانوادهPP-Fold یاNPY میباشند و به عنوان نوروترنسمیتر در مغز و سیستم عصبی اتونومیک انسان عمل میکند. این واسطههای شیمیایی در سیستم عصبی اتونومیک عمدتاً توسط سیستم اعصاب سمپاتیک تولید میگردند و در مغز در هیپوتالاموس ساخته میشوند. نوروپپتید Y ابتدا در سال ۱۹۸۲ توسط تاتموتو از هیپوتالاموس خوک جدا شد و از آن پس مطالعههای زیادی در رابطه با نقش آن در انسان انجام گرفت(8). نقشهای فیزیولوژیک متفاوتی برای آن ذکر شده است، از جمله نقش آن در مکانیسمهای ضد پیری، تنظیم اشتها، تنظیم مصرف انرژی، تنظیم هموستاز استخوان، هموستاز سلولهای ایمنی، تنظیم ریز محیط مغز استخوان، آنژیوژنز، یادگیری و حافظه(11-9). دوز دارویی آن میتواند اثر درمانی برای نوروپاتی عصبی و عدم کارآیی مغز استخوان داشته باشد(12). اثر مستقیم تنظیمی گیرنده نوروپپتید Y روی شمار متفاوتی از سلولها از جمله پیشسازهای عصبی و سلولهای بنیادی رویانی اثبات شده است. کشت طولانی مدت سلولهای پیشساز رویانی در حضور نوروپپتید Y و بدون لایه مغذی منجر به تکثیر بدون تمایز آنها شد(13). زیر تیپهای گیرنده نوروپپتید Y توسط اغلب سلولهای ایمنی، سلولهای آدیپوسیت، سلولهای اندوتلیـال و سلولهـای بنیـادی مـزانشیمی بیــان میشوند(17-14). هدف از این مطالعه، ارزیابی اثر نوروپپتید Y بر تکثیرآزمایشگاهی سلول بنیادی خونساز واحد خون بند ناف بود.
مواد و روشها این مطالعه تجربی طی سه مرحله مشتمل بر بررسی بیان گیرندههای نوروپپتید Y، تعیین دوز مناسب نوروپپتید Y بر تکثیر سلولهای بنیادی خونساز و نحوه تکثیر سلولهای بنیادی خونساز تیمار شده با نوروپپتید Y در مقابل گروه کنترل انجام و در هر مرحله ۳ واحد خون بند ناف مورد آزمون قرار گرفت. ابتدا در مرکز جمعآوری خون بند ناف، اقدام به اخذ رضایتنامه کتبی از والدین شد. سپس نمونه خون بند ناف بعد از زایمان در کیسههای مخصوص خون بند ناف جمعآوری و در شرایط استریل به آزمایشگاه انتقال یافت. نمونهها کمتر از ۴ ساعت از زمان نمونهگیری مورد پردازش قرار گرفتند. ابتدا سلولهای تک هستهای با استفاده از فایکول جدا شدند. سپس سلولهای بنیادی خونساز به روش MACS و توسط آنتیبادی بر علیه CD34 جدا شدند. میزان خلوص سلولهای CD34+با روش فلوسیتومتری ارزیابی شد. به منظور بررسی نحوه بیان گیرندههای نوروپپتید Y از سلولهای CD34+ با خلوص بیش از 90% استفاده شد.RNA سلولهای CD34+با استفاده از ترایزول جدا شد. بعد از استخراج RNA با استفاده از کیت cDNA Synthesis kit Thermo scientific شرکت ترمو، مطابق دستورالعمل سازنده ساخت cDNA انجام پذیرفت. با
توجه به بیان زیر تیپهای 1 و 5 نوروپپتید در اغلب سلولهای ایمنی، برای تایید بیان این دو گیرنده نوروپپتید Y در سلولهای بنیادی خونساز، آزمون Conventional PCR با استفاده از توالی آغازگرهای گیرندههای زیر تیپ 1 و 5 نوروپپتید Y و ژن خانهدار GAPDH(به عنوان کنترل) انجام گرفت(جدول 1). واکنش زنجیرهای پلیمراز در حجم نهایی ۲۰ میکرولیتر حاوی ۷ میکرولیتر آب عاری از نوکلئاز، ۱۰ میکرولیترMaster mix ، 5/0 میکرومول از هر کدام از آغازگرها و ۱ میکرولیتر cDNA به عنوان الگو در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. محصولاتواکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده از ژل آگارز 2% مورد بررسی قرار گرفت. جهت تعیین دوز مناسب نوروپپتید Y، مجدداً جداسازی سلولهای CD34+ صورت گرفت. شمارش تام سلولهای تک هستهای به وسیله لام نئوبار انجام شد. در این مرحله به منظور تعیین خلوص سلولهای CD34+ و سلولهای CD38- به روش فلوسیتومتری، ابتدا۵۰ میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی(حاوی ۱۰۴ سلول)، جهت بررسی مارکرهای سطحی به دو لوله یکی مربوط به آزمایش و دیگری مربوط به کنترل ایزوتیپ منتقل گردیده، به لوله آزمایش میزان ۵/۲ میکرولیتر از آنتیبادی مونوکلونال CD34-PE و ۵/۲ میکرولیتر از آنتیبادی مونوکلونال CD38-FITC (شرکت BD) و به لوله کنترل ایزوتوپ ۵/۲ میکرولیتر از آنتیبادی IgG1-FITC/PE (شرکت BD) بر علیه سلولهای موشی جهت شناسایی و حذف باندهای غیراختصاصی اضافه شد.
جدول 1: آغازگرهای مورد استفاده برای PCR
آغازگر
جهت
توالی (5’…3’)
طول قطعه تکثیری (bp)
NPY1R
جلوبرنده
ATTTCCATCGGACTCTCATAGG
138
معکوس
TTGTCCATCATGTTGTTTCTCC
NPY5R
جلوبرنده
TGTTACAAGGAAAGGCTATCG
146
معکوس
ATACTCGTCGAGCTCTAAATCC
GAPDH
جلوبرنده
CTGGCCAAGGTCATCCATG
120
معکوس
GCCATCACGCCACAGTTTC
لولهها به مدت ۳۰ دقیقه در تاریکی و در دمای ۴ درجه سانتیگراد قرار داده شدند. نهایتاً نمونهها توسط دستگاه فلوسیتومتری(Partec PAS III) و تحت نرمافزار فلومکس تجزیه و تحلیل شد. سلولهای بنیادی خونساز در مقابل غلظتهای مختلف نوروپپتید Y (شرکت Tocris) قرار داده شد و دوز مناسب بر اساس بیشترین تکثیر و کمترین تمایز سلولهای تزاید یافته در مقایسه با گروه کنتـرل انتخاب شد.غلظتهای مورد مطالعه ۱، ۱/۰، ۰۱/۰ و ۰۰۱/۰ میکرو مولار بود. پس از تعیین دوز مناسب نوروپپتید Y ، تکثیر سلولهای CD34+ خون بند ناف در دو شرایط مختلف به صورت زیر انجام پذیرفت. 1- تیمار شده توسط نوروپپتید Y به همراه سایتوکاین(Cyto+NPY) (غلظت نوروپپتید Y ۱ میکرومولار) 2- تنها در حضور سایتوکین(Cyto-NPY) تکثیر سلولها در هر دو شرایط به صورت تکرار سهتایی و در محیط کشت Stem span (شرکت استم سل تکنولوژیس) و در حضور سایتوکاینهای TPO ، SCF (با غلظت 100 میکروگرم در لیتر) و Flt3L (با غلظت 50 میکروگرم در لیتر) به مدت یک هفته انجام پذیرفت. پس از 7 روز کشت سلولی، سلولهای تکثیر یافته از نظر مارکرهای سطحی CD34 و CD38 ایمونوفنوتیپ شدند. قدرت کلنیزایی سلولهای بنیادی CD34+ قبل و بعد از یک هفته کشت به روش CFU-assay در محیط H4435Methocult (شرکت استم سل تکنولوژیس) انجام گرفت. تعداد ۳۰۰۰ سلول به ۳ میلیلیتر محیط کشت اضافه شد. سوسپانسیون تهیه شده مخلوط شد تا کاملاً به صورت یکنواخت در بیاید. سپس ۱ میلیلیتر از سوسپانسیون سلولی ایجاد شده به آرامی به هر یک از پلیتهای 35 میلی متری انتقال داده شد و سپس در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد و 5% CO2 قرار داده شد. سلولها در مدت ۱۴ روز انکوباسیون به کلونیهای واحد، تکثیر و تمایز پیدا کردند. پس از ۱۴روز کلونیها به وسیله میکروسکوپ معکوسبا بزرگنمایی ۱۰ شمارش شدند. بررسی قدرت کلنیزایی سلولهای بنیادی خونساز در کشت طولانی مدت(LTC-IC) بعد از تکثیر انجام گرفت و بعد از ۵ هفته برای آن CFU assay انجام شد. ازنرمافزار 16 SPSS و آزمایش آماری Paired sample t-Test جهت آنالیز دادهها استفاده شد. 05/0 p< از نظر آماری معنادار درنظر گرفته شده است.
یافتهها به منظور تایید حضور قطعه ژنی NPY1R و NPY5R ، روی cDNA تام استخراج شده از سلول بنیادی خونساز، PCR انجام شد. پس از انجام PCRconventional ، محصولات تکثیر شده از هر دوی گیرندهها روی ژل منتقل و الکتروفورز شد. طول قطعه تکثیر شده مورد انتظار برایNPY 1R وNPY 5R به ترتیب ۱۳۸ و۱۴۶بود. باندی در محدوده bp ۱۴۶مشاهده نشد. باند به دست آمده برای NPY1R مؤید حضور گیرنده تیپ ۱ نوروپپتید Y در سلولهای CD34+ بود. بیشترین میزان تکثیر سلولهای هستهدار و سلولهای CD34+/CD38- در غلظت 1 میکرومولار نوروپپتید Y مشاهده شد(نمودار 1). همان طور که در نمودار 1 مشاهده میشود پاسخ سلولهای CD34+ مورد مطالعه به غلظتهای مختلف نوروپپتید Y ، وابسته به دوز بود و میزان تکثیر بدون تمایز سلولها متاثر از افزایش غلظت نوروپپتید Y بوده و بیشینه تکثیر سلولی به میزان 8/18 برابر با 002/0 p< در برابر افزایش تکثیر سلولی به میزان 2/17 برابر با 003/0 p< به ترتیب با غلظتهای 1 و 1/0 میکرومولار نوروپپتید Y در برابر گروه کنترل با افزایش تکثیر سلولی به میزان 5/12 برابر مشاهده شد، لذا از غلظت 1 میکرومولار نوروپپتید Y در ادامه مطالعه استفاده شد. به منظور بررسی نحوه تکثیر سلولهای بنیادی خونساز تیمار شده با غلظت بهینه نوروپپتید Y ، مجدداً سلولهای CD34+ واحدهای خون بند ناف جدا گردید. شمارش تام سلولهای تک هستهای توسط لام نئوبار انجام گرفت و از نظر ایمونوفنوتیپ با روش فلوسیتومتری بررسی شد. پس از یک هفته کشت سلولهای CD34+ در حضور و عدم حضور نوروپپتیدY، از سلولهای تکثیر یافته نمونهبرداری به عمل آمد و شمارش تام سلولهای هستهدار، آنالیز فلوسیتومتری، بررسی قدرت کلنیزایی و آزمون LTC-IC انجام پذیرفت(شکل 1).
نمودار 1: مقایسه تاثیر غلظتهای مختلف نوروپپتید Y بر تکثیر سلولهای CD34+/CD38- (* افزایش معنادار در سطح 003/0 p< ، ** افزایش معنادار در سطح 002/0 p<)
شکل 1 نتایج بررسی فلوسیتومتری شاخصهای CD34 و CD38 در روز صفر و پس از ۷ روز کشت را نشان میدهد. شمارش کلی سلولها و تکثیر آنها طی مدت یک هفته در هر دو حالت کشت نسبت به تعداد سلولهای اولیه منتقل شده به هر چاهک افزایش داشت، اما این افزایش به صورت معناداری در گروه تیمار شده با نوروپپتید Y (15/3 ± 45/18) بیش از گروه کنترل (47/1 ± 24/11) بود(001/0 p<). در مرحله بعد میزان تکثیر سلولهای CD34+/38- دو حالت مختلف با همدیگر مقایسه شد(نمودار 2). قدرت کلنیزایی سلولها نیز بعد از یک هفته کشت در هر دو حالت کشت نسبت به قدرت کلنیزایی اولیه (روز صفر)(به ازای 103سلول) افزایش داشت. قدرت کلنیزایی در پایان روز هفتم در گروه آزمایشCyto+NPY)) در مقایسه با گروه کنترل(Cyto-NPY) افزایش معناداری داشت(05/0 p<)(جدول 2). به منظور ارزیابی توان سلولهای تکثیر شده در تولید کلنی در شرایط کشت طولانی مدت، از آزمون LTC-IC استفاده شد. نتایج این آزمون نشان از افزایش میزان قدرت کلنیزایی در گروه آزمایش نسبت به گروه کنترل داشت(01/0 p=)(نمودار 3).
نمودار 2: مقایسه میزان افزایش سلولهای CD34+/38- بعد از یک هفته کشت در حضور و عدم حضور نوروپپتید Y
جدول 2: میانگین کلنیزایی سلولهای TNC در روز صفر کلنی1/12 ± 127 به ازای 103 سلول میباشد. p value گروههای آزمایش نسبت به گروه کنترل محاسبه شدهاند.