چکیده سابقه و هدف آسیب اکسیداتیو، یکی از عوامل مهم در تشکیل آسیب ذخیره پلاکت می‌باشد که منجر به کاهش کیفیت فرآورده پلاکت و کاهش بازده تزریق پلاکت می‌شود. به همین دلیل در این مطالعه به تاثیر خواص آنتی‌اکسیدانی ال- کارنیتین بر آسیب اکسیداتیو در پلاکت‌ها در طول مدت نگهداری پرداخته شد. مواد و روش‌ها در این مطالعه تجربی، 10 کیسه کنسانتره پلاکتی تهیه شده در پایگاه انتقال خون تهران، به روش تصادفی ساده انتخاب گردید و با 100 میلی‌مول ال-کارنیتین تیمار شد. سپس ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام(TAC) و غلظت مالوندآلدئید(MDA) در پلاکت‌های تیمار با ال- کارنیتین در مقایسه با پلاکت‌های گروه کنترل(گروه فاقد ال- کارنیتین) در طول مدت زمان نگهداری پلاکت‌ها تحت شرایط آژیتاسیون ملایم در دمای 2 ± 20 درجه سانتی‌گراد تا 5 روز اندازه‌گیری شد. یافته‌ها نتایج به دست آمده نشان می‌دهد که ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام در گروه تیمار با ال-کارنیتین نسبت به گروه کنترل تا روز پنجم نگهداری بهتر حفظ شده بود و اختلاف معناداری بین دو گروه از نظر آماری وجود داشت(005/0 p= روز پنجم و 007/0 p= روز سوم). غلظت مالون دآلدئید نیز در گروه تیمار با ال-کارنیتین نسبت به گروه کنترل کمتر افزایش یافته بود(005/0 p= روز پنجم و 008/0 p= روز سوم). نتیجه گیری به نظر می‌رسد ال-کارنیتین با ممانعت از پراکسیداسیون لیپیدها و حفظ ظرفیت آنتی‌اکسیدانی پلاکت‌ها، بتواند سبب کاهش آسیب اکسیداتیو در پلاکت‌ها در طول مدت نگهداری گردد و در آینده ممکن است بتوان از ال-کارنیتین به عنوان ماده افزودنی جهت ارتقای کیفیت پلاکت‌ها و کاهش آسیب ذخیره پلاکتی استفاده کرد. کلمات کلیدی:پلاکت‌ها، استرس اکسیداتیو، ال-کارنیتین
تاریخ دریافت: 4/2 /96 تاریخ پذیرش: 13/4/96
1- کارشناس ارشد بیوتکنولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- مؤلف مسئول: PhD بیوشیمی بالینی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665 3- PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 4- متخصص آسیب‌شناسی بالینی و تشریحی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه کنسانتره پلاکتی یکی از مهمترین فرآورده‌های درمانی مشتق از خون بوده که جهت بیماران مبتلا به ترومبوسیتوپنی به کار می‌رود. با این وجود نگهداری کنسانتره‌های پلاکتی تحت شرایط استاندارد در بانک خون (2 ± 22 درجه سانتی‌گراد همرا با آژیتاسیون ملایم) در بیشتر کشورها محدود به 7-5 روز می‌باشد(1). این محدودیت زمانی اساساً مربوط به افزایش خطر آلودگی باکتریایی در واحدهای پلاکتی است به دلیل این که دمای نگهداری پلاکت دمای مطلوبی برای رشد باکتری‌ها می‌باشد از طرفی نیز تغییرات بیوشیمیایی که در طی فرآیند تولید و نگهداری فرآورده پلاکت رخ می‌دهد، می‌تواند سبب تغییرات مورفولوژیک، ساختاری و عملکردی در پلاکت‌ها شده که در نهایت منجر به کاهش بقا و کیفیت پلاکت‌ها پس از تزریق پلاکت گردد که به مجموع این تغییرات، آسیب ذخیره‌ای پلاکت(PSL یا Platelet Storage Lesion) گفته می‌شود(2). پلاکت‌ها به دلیل دارا بودن میتوکندری قادر به تولید گونه‌های فعال اکسیژن(Reactive Oxygen Species) در طی فرآیند متابولیسم سلولی می‌باشند. ROS توسط دو مسیر تولید می‌شود. مسیر اول مربوط به فرآیندهای تنفس سلولی است که منجر به تولید ROSهای اندوژن می‌شوند و مسیر بعدی نیز فرآیندهای آنزیمی است که به واسطه آن آنزیمهایی نظیر NADPH اکسیداز و گزانتین اکسیداز می‌توانند سبب تولید ROS در پلاکت‌ها گردند(3). اولین بار توسط مارکوس در سال 1977این نظریه به اثبات رسید که پلاکت‌ها می‌توانند رادیکال آزاد اکسیژن (O2-) تولید نمایند(4). در مطالعه‌های متعددی گزارش شده است که O2- موجب تحریک‌پذیری بیشتر پلاکت در برخورد با ترومبین، کلاژن و ADP شده که می‌تواند سبب اگریگاسیون پلاکت گردد(6، 5). رادیکال‌های آزاد اکسیژن به وسیله غیرفعال کردن نیتریک اکسید(NO)، آزادسازی آگونیست‌هایی نظیر ADP و تولیـد ایزوپروستان‌هـا مـی‌توانند مـوجب افـزایش فعالسازی پلاکت گردند(7). بنابراین هرگونه عدم تعادل بین میزان تولید ROS و مکانیسم‌های دفاعی آنتی‌اکسیدانی سلول که موجب استرس اکسیداتیو شود، به واسطه افزایش فعالسازی پلاکت‌ها موجب پیشبرد آسیب ذخیره در پلاکت‌ها می‌گردد. در واقع استرس اکسیداتیو یکی از فاکتورهای مهمی است که منجر به کاهش کیفیت و کاهش طول عمر فرآورده پلاکتی می‌گردد(8). در بین بیومولکول‌ها، لیپیدها در معرض بیشترین آسیب اکسیداتیو می‌باشند(9). به دنبال پراکسیداسیون لیپیدها، تعداد زیادی محصولات ثانویه تولید می‌شوند که بیشتر آلدئید هستند(10). این محصولات ثانویه با بیومولکول‌های دیگر نظیر پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک وارد واکنش شده و می‌تواند به صورت غیر قابل برگشت، موجب آسیب به فرآیندهای دخیل در عملکرد سلول شوند. مالوندآلدئید(MDA)، مهمترین محصول ثانویه پراکسیداسیون لیپیدها است که از سال 1960 به بعد به عنوان مارکر مهمی جهت ارزیابی پراکسیداسیون لیپیدها و در نتیجه جهت ارزیابی میزان آسیب اکسیداتیو به کار می‌رود(9). ال-کارنیتین (γ- تری‌متیل آمینو-β- هیدروکسی بوتیریک اسید) مولکول کوچکی است که اولین بار در سال 1905 به وسیله گول‌ویچ و کریمبرگ کشف شد(10). این مولکول که مشتقی از دو اسید آمینه لیزین و متیونین می‌باشد به صورت معمول در اکثر سلول‌ها در بدن یافت می‌شود. این مولکول به صورت سنتتیک نیز موجود می باشد که پودری سفید رنگ و غیر سمی است(11). مطالعه‌های مختلفی به تاثیر مثبت ال-کارنیتین بر پارامترهای مختلف فیزیولوژیکی اشاره داشته است. اگر چه مکانیسم مولکولی آن هنوز مشخص نیست، اما عملکرد آنتی‌اکسیدانی آن در مقالات مختلف به عنوان مسئول تاثیر مثبت این مولکول معرفی شده است(12). اثر آنتی‌اکسیدانی ال- کارنیتین مربوط به جمع‌آوری مستقیم رادیکال‌های آزاد و شلاته کردن یون‌های فلزی می‌باشد(13). از طرفی نیز ال-کارنیتین با حفظ تمامیت و یکپارچگی دیواره میتوکندری می‌تواند سبب بهبود عملکرد میتوکندری در شرایط استرس شود(16-14). بنابراین به نظر می‌رسد ال-کارنیتین بتواند با خواص آنتی‌اکسیدانی خود سبب ارتقاء کیفیت پلاکت‌ها در طول مدت نگهداری گردد. اگر چه اطلاعات کافی از تاثیر این ماده بر افزایش کیفیت فرآورده پلاکتی در طی دوره ذخیره‌سازی وجود ندارد. هدف این مطالعه، کاهش آسیب اکسیداتیو توسط ال- کارنیتین می‌باشد. با این فرض که این مولکول قادر به کاهش تولید MDA و حفظ ظرفیت آنتی‌اکسیدانی در پلاکت‌ها خواهد بود.
مواد و روش‌ها تعیین غلظت بهینه ال-کارنیتین(Optimum dose): برایاینمنظور5کیسهکنسانترهپلاکتی به صورت تصادفی سادهانتخابشدوهرکیسهپلاکت، بهچند قسمتبرایتیمار باغلظتهای مختلفال-کارنیتینتقسیم شد. پس از تیمار پلاکت‌ها با غلظت‌های 10، 15، 20 و 100 میلی مول ال-کارنیتین، کلیه کیسه‌ها همراه با گروه شاهد خود(گروه فاقد ال- کارنیتین) در دمای 24-20 درجه سانتی‌گراد در شیکر انکوباتور پلاکتی به مدت 5 روز نگهداری شدند. در روزهای اول، سوم و پنجم نگهداری، متغیرهای مالون دآلدئید(MDA ) و ظرفیت آنتی‌اکسیدان تام(TAC) در پلاکت‌های گروه تیمار با ال- کارنیتین و گروه شاهد(گروه فاقد ال- کارنیتین) اندازه‌گیری شد و غلظت بهینه و مؤثر ال- کارنیتین بر آسیب اکسیداتیو از این طریق به دست آمد.
آماده‌سازی و نگهداری پلاکت‌های کنسانتره: مطالعه حاضر از نوع تجربی(Experimental) بود که به روش نمونه‌گیری تصادفی ساده انجام شد. بدین منظور 10 کیسه پلاکت کنسانتره به طور تصادفی بدون در نظر گرفتن گروه خونی، سن و جنس اهدا کننده انتخاب شد. کنسانتره‌های پلاکتی به وسیله روش پلاسمای غنی از پلاکت((PRP) Platelet rich plasma) در پایگاه انتقال خون استان تهران تهیه شدند. همه کیسه‌ها در شیکر انکوباتور در دمای 22 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 روز با آژیتاسیون ملایم نگهداری گردید. هر کیسه کنسانتره پلاکت، شامل 60-40 میلی‌لیتر پلاکت کنسانتره با تعداد پلاکت بیشتر از PLT/mL 109× 1 همراه بود. نحوه تقسیم کیسه‌ها به دو گروه A (گروه کنترل) و گروه B (گروه آزمایش) در ادامه آمده است: ابتدا هر کیسه به وسیله دستگاه متصل کننده(ژاپن، TSCD-II ، Connection device) به کیسه اقماری B (ژاپن، JMS) که از جنس کیسه‌های گروه کنترل بود متصل شد و با استفاده از ترازوی دیجیتال(آلمان، سارتوریوس)، دقیقاً هر دو کیسه کنترل و شاهد به حجم‌های مساوی از پلاکت تقسیم گردیدند. در روز اول نگهداری پلاکت(روز تهیه پلاکت)، قبل از تقسیم کیسه اصلی به دو کیسه کنترل و مورد، ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام، غلظت مالوندآلدئید، شمارش تعداد پلاکت و جهت اطمینان از عملکرد پلاکت، میزان آگریگاسیون پلاکت‌ها در پاسخ به آگونیست اندازه‌گیری شد. پس از تهیه استوک ال-کارنیتین (1000 میلی‌مول) و فیلتر کردن آن توسط فیلتر 22/0 میکرومتر(آمریکا، GVS)، ال- کارنیتین با غلظت نهایی 100 میلی مول (غلظت بهینه به دست آمده از مطالعه پایه)، به کیسه گروه آزمایش(B) تزریق گردید و به مقدار مساوی نیز، نرمال سالین به کیسه گروه کنترل(A) تزریق شد. کلیه مراحل تزریق جهت جلوگیری از آلودگی باکتریال در زیر هود کلاس II انجام گرفت. کلیه کیسه‌های آزمایش و کنترل به مدت 5 روز در دمای 24-20 درجه سانتی‌گراد در شیکر انکوباتور تحت آژیتاسیون ملایم نگهداری شدند.
کشت پلاکتی و شمارش تعداد پلاکت‌ها: به منظور شمارش تعداد پلاکت‌ها، نمونه پلاکت کنسانتره به نسبت یک به پنج با بافر فسفات(PBS) رقیق شد و با استفاده از دستگاه شمارشگر سلولی(ژاپن، Kobe ، 1000-K ،سیس‌مکس) شمارش پلاکت ها در روز اول در کیسه‌های تست و کنترل اندازه‌گیری گردید. ضمنا در این مطالعه برای اطمینان از عدم آلودگی باکتریایی، نمونه پلاکت گرفته شده از کیسه در روزهای اول و پنجم نگهداری بر روی محیط های کشت باکتریایی تایوگلیکولات(آلمان، مرک) و محیط (Tryptic Soy Broth (TSB(هند، HiMedia) کشت داده شدند.
اندازه‌گیری میزان اگریگاسیون پلاکتی: در روز 1 نگهـداری پلاکت‌ها جهت اطمینان از عملکرد و کیفیت پلاکت‌های کنسانتره قبل از تیمار با ال- کارنیتین، میزان اگریگاسیون پلاکتی در پاسخ به آگونیست‌های ریستوستین( mg/mL5/1)(فرانسه، هلنا) و آراشیدونیک اسید(5/0 میلی‌مول)(فرانسه، هلنا) توسط دستگاه اگریگومتر(Pack-4) اندازه‌گیری شد.
آماده‌سازی پلاکت‌ها جهت انجام آزمایش MDA و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام: ابتدا مقدار 4 میلی‌لیتر پلاکت کنسانتره به لوله فالکون انتقال داده شد و به مدت 10 دقیقه در دور rpm 4000 سانتریفیوژ شد و به رسوب پلاکتی 1 میلی‌لیتر بافر تیرود اضافه گردید. پس از آن محلول حاوی پلاکت به مدت 20 دقیقه داخل فریزر 70- درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. پس از اتمام فرآیند انجماد نمونه‌ها در دمای محیط قرار داده شدند تا ذوب شوند. این پروسه (freeze and Thaw) سه بار متوالی انجام شد. سپس هم حجم نمونه‌ها بافر لیز به آن‌ها اضافه شد و نمونه‌ها به مدت 1 ساعت روی یخ قرار داده شدند. بعد از یک ساعت به منظور تکمیل فرآیند لیز سلولی تمام نمونه‌ها توسط دستگاه سونیکاتور به مدت 40 ثانیه با فاصله زمانی 5 ثانیه و دامنه 50% همگن شدند. برای تهیه کنترل مثبت از نمونه پلاکتی استفاده شد که به منظور القاء آسیب اکسیداتیو، تحت تیمار با 2 میلی‌مولار H2O2 قرار گرفته شد.
اندازه‌گیری غلظت مالون دآلدئید(MDA): در این روش که اصطلاحاً به روشThiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) معروف می‌باشد، محصول نهایی پراکسیداسیون لیپیدها که مالون دآلدئید (MDA) می‌باشد، با باربیتوریک اسید وارد واکنش شده که نهایتاً منجر به ایجاد کمپلکس صورتی رنگ می‌شود و جذب نوری آن را می‌توان در طول موج 532 نانومتر قرائت نمود(3). در ایـن آزمـایش، ابتـدا 500 میکرولیتـر از نمـونـه‌های همگـن شـده و 500 میکرولیتـر از هر کدام از محلول‌های استاندارد به لوله‌های شیشه‌ای انتقال داده شد. به هر کدام از لوله‌ها 750 میکرولیتر تیوباربیتوریک اسید 8/0%، 750 میکرولیتر تری کلرو‌استیک اسید 20% و 100 میکرولیتر SDS 1/8% اضافه شد. سپس 400 میکرولیتر آب مقطر به هر کدام از لوله‌ها افزوده شد تا حجم کل هر لوله به 5/2 میلی‌لیتر برسد. سپس همه لوله‌ها به مدت 60 دقیقه در بن‌ماری در دمای 95 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. پس از سرد کردن نمونه‌ها بر روی یخ به مدت 15 دقیقه، 1 میلی‌لیتر آب مقطر و 5 میلی‌لیتر مخلوط ان- بوتانول و پیریدین(با نسبت 15:1) به هر کدام از لوله‌ها اضافه شد. بعد از این که نمونه‌ها به شدت توسط شیکر میکس شدند، همه لوله‌ها برای 10 دقیقه با دور rpm 4000 سانتریفیوژ شدند. در نهایت لایه شفاف ارگانیک در هر لوله جدا شد و جذب آن در طول موج 532 نانومتر در مقابل بلانک نمونه قرائت شد و از روی منحنی استاندارد طبق معادله خطی به دست آمده، غلظت MDA بر حسب nmoL/PLT به دست آمد. در این روش به عنوان استاندارد از محلول استوک 1-1-3- 3 تترامتوکسی‌پروپان با غلظت‌های 50، 5/10، 5/2 و 25/1 میلی‌مول استفاده شد و با محاسبه میانگین جذب برای هر استاندارد، نمودار استاندارد بر مبنای غلظت استاندارد به جذب رسم شد. کلیه سنجش‌ها به صورت دوتایی انجام گرفت.
سنجش ظرفیت آنتی‌اکسیدان تام (TAC): برای اندازه‌گیری ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام در پلاکت‌ها از کیت شرکت سیگما(anti oxidant assay kit- Sigma Aldrich) استفاده شد که بر اساس واکنش اکسیداسیون 2,2-azino-bis(3-ethylbenzylthiazoline-6 sulfonic acid (ABTS) می‌باشد. در این روش ابتدا ABTS توسط رادیکال‌های فریل میوگلوبین اکسیده شده که منجر به تشکیل رادیکال کاتیون ABTS+ می‌شود، در نهایت جذب نوری کمپلکس ایجاد شده که به رنگ سبز می‌باشد در طول موج 405 نانومتر توسط الایزا ریدر قرائت گردید. آنتی‌اکسیدان‌های موجود در نمونه، اثر مهاری بر این واکنش داشته و هر چه میزان آن‌ها در نمونه بیشتر باشد، میزان کمتری رادیکال کاتیون ABTS+ تشکیل می‌شود که سبب کاهش جذب نوری می‌گردد یعنی هر چه قدر جذب نوری کمتر باشد، میزان آنتی‌اکسیدان موجود در نمونه بیشتر خواهد بود. در این روش به عنوان استاندارد از آنالوگ محلول در آب ویتامین E (Torolox) به عنوان آنتی‌اکسیدان استفاده شد. آزمایش در پلیت 96 خانه‌ای و به صورت دوتایی انجام شد. در هر چاهک مربوط به استانداردهای ترولکس، 10 میکرولیتر از غلظت‌های مختلف استاندارد به چاهک‌های 1 تا 6 انتقال داده شد. در چاهک‌های مربوط به نمونه‌ها 10 میکرولیتر از پلاکت‌هایی که آماده شده بودند و در یک چاهک نیز 10 میکرولیتر از نمونه کنترل مثبت ریخته شد. سپس 20 میکرولیتر از محلول کاری میوگلوبین به همه چاهک‌ها افزوده شد. در مرحله بعد 150 میکرولیتر از محلول کاری پیش‌ماده ABTS به تمام چاهک‌ها اضافه شد. پلیت به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد، در صورت نیاز، زمان انکوباسیون قابل تغییر است. در انتهای زمان انکوباسیون، 100 میکرولیتر از محلول متوقف‌کننده واکنش به هر چاهک اضافه شد. در نهایت جذب نمونه‌ها و استانداردها در طول موج 405 نانومتر با استفاده از دستگاه الایزاریدر خوانده شد. با محاسبه میانگین جذب برای هر استاندارد ترولکس، نمودار استانـداردی برمبنای غلظت ترولکس به جذب آن رسم شد.
نحوه جمع‌آوری اطلاعات و تجزیه و تحلیل داده‌ها: تمامی داده‌ها وارد نرم‌افزار SPSSنمایه 18 گردید. جهت آنالیز آماری، کلیه داده‌ها با استفاده از آزمون آماری کولموگروف اسمیرنوف دارای توزیع طبیعی بود. برای توصیف داده‌ها از میانه و دامنه (حداقل- حداکثر داده‌ها) استفاده شد. جهت مقایسه تفاوت مقادیر MDA و TAC در طول زمان در هر گروه و نیز اختلاف بین دو گروه در هر مقطع زمانـی از آزمون ویلکاکسـون استفاده شد. سطـح معناداری تمام آزمون‌ها 05/0 در نظر گرفته شد.
یافته‌ها نتایج مربوط به مطالعه پایه جهت تعیین غلظت بهینه ال-کارنیتین: میانگیـن نتایـج بـه دسـت آمــده از پلاکت‌هایی که با غلظت‌های مختلف از ال-کارنیتین تیمار شده است در مقایسه با گروه شاهد(گروه فاقد ال-کارنیتین) در جدول آمده است(جدول 1). همان طور که در جدول نیز مشاهده می‌گردد، غلظت 100 میلی‌مول ال- کارنیتین بر آسیب اکسیداتیو نسبت به غلظت‌های دیگر از این ماده به صورت معناداری با 05/0 p< تاثیر بیشتری بر حفظ ظرفیت آنتی‌اکسیدانی و کاهش پراکسیداسیون لیپید در پلاکت‌ها در طول مدت نگهداری داشته و به همین علت، به عنوان موثرترین غلظت از ال- کارنیتین در این مطالعه انتخاب گردید. هم چنین غلظت‌های مختلف از ال-کارنیتین و تاثیر آن بر دو مارکر مهم آسیب اکسیداتیو نیز در جدول 1 آمده است. نتایج آماری به دست آمده نشانگر این است که مؤثرترین غلظت از ال-کارنیتین، غلظت 100 میلی‌مول می‌باشد که می‌تواند بیشترین تاثیر را بر حفظ ظرفیت آنتی‌اکسیدانی پلاکت‌ها و هم چنین مهار پراکسیداسیون لیپیدها در پلاکت در طول مدت نگهداری داشته باشد. برای اطمینان از عملکرد پلاکت‌ها و کیفیت آن‌ها، آزمایش آگریگاسیون پلاکتی انجام شد(جدول 2). همان طور که در این جدول مشاهده می‌شود، میانگین نتایج آگریگاسیون پلاکتی در پاسخ به آگونیست‌های آراشیدونات و ریستوستین در روز تهیه پلاکت‌ها به میزان مطلوب و قابل قبول بوده و نشان‌دهنده این است که پلاکت‌ها از عملکرد و کیفیت خوبی برخوردار بودند. از طرف دیگر میانگین شمارش تعداد پلاکت‌ها در واحد میکرولیتر نیز در روز تهیه(روز 1) در این جدول نشان داده شده و مشاهده می‌شود که تعداد پلاکت‌ها نیز در حد مطلوب و مورد انتظار می‌باشند. میانگین نتایج MDA و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام(TAC) پلاکت‌های تیمـار شـده بـا ال- کارنیتیـن بـا گروه فاقد ال-کارنیتین(گروه کنترل) مقایسه شد(جدول 3). با توجه به نتایج به دست آمده، مشخص گردید که میزان پراکسیداسیون لیپیدها با استفاده از شاخص MDA در پلاکت‌هایی که با ال-کارنیتین تیمار شده بودند در طول مدت نگهداری به مراتب پایین‌تر از پلاکت‌های گروه شاهد بود و این اختلاف در روزهای 3 و 5 نگهداری پلاکت از نظر آماری معنادار بود(005/0 p= روز پنجم و 008/0 p= روز سوم).
جدول 1: میانگین نتایج غلظت مالون دآلدئید و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام در نمونه‌های تیمار شده با غلظت‌های 10، 15، 20 و 100 میلی‌مول ال-کارنیتین در مقایسه با گروه کنترل(گروه فاقد ال-کارنیتین)
روزهای نگهداری
MDA(nmol/PLT)
p value
TAC (mM/ PLT)
p vlaue
روز سوم گروه کنترل
55/2 ± 86/3
031/0
024/0 ± 364/0
91/0
روز سوم پلاکت تیمار با 10 میلی مول ال-کارنیتین
61/1 ± 41/2
024/0 ± 365/0
روز پنجم گروه کنترل
38/3 ± 18/4
57/0
029/0 ± 347/0
08/0
روز پنجم پلاکت تیمار با 10 میلی مول ال-کارنیتین
41/2 ± 66/3
082/0 ± 285/0
روز سوم گروه کنترل
55/2 ± 86/3
023/0
024/0 ± 364/0
16/0
روز سوم پلاکت تیمار با 15 میلی مول ال-کارنیتین
92/1 ± 49/2
132/0 ± 278/0
روز پنجم گروه کنترل
38/3 ± 18/4
14/0
029/0 ± 347/0
08/0
روز پنجم پلاکت تیمار با 15 میلی مول ال-کارنیتین
35/1 ± 35/2
063/0 ± 294/0
روز سوم گروه کنترل
55/2 ± 86/3
16/0
024/0 ± 364/0
08/0
روز سوم پلاکت تیمار با 20 میلی مول ال-کارنیتین
92/0 ± 45/2
55/2 ± 86/3
روز پنجم گروه کنترل
38/3 ± 18/4
1/0
029/0 ± 347/0
06/0
روز پنجم پلاکت تیمار با 20 میلی مول ال-کارنیتین
57/1 ± 39/2
068/0 ± 294/0
روز سوم گروه کنترل
63/0 ± 09/3
013/0
003/0 ± 325/0
006/0
روز سوم پلاکت تیمار با 100 میلی مول ال-کارنیتین
29/0 ± 26/1
002/0 ± 333/0
روز پنجم گروه کنترل
44/0 ± 1/4
001/0
009/0 ± 261/0
014/0
روز پنجم پلاکت تیمار با 100 میلی مول ال-کارنیتین
38/0 ± 53/2
003/0 ± 316/0
جدول 2: میانگین نتایج نهایی آگریگاسیون پلاکت‌ها و شمارش پلاکت‌ها در روز تهیه(روز 1)
اگریگاسیون پلاکت‌ها با ریستوستین(%) (میانگین ± انحراف معیار) 10 n=
تعداد پلاکت(/µL103×) (میانگین ± انحراف معیار) 10 n=
47/18 ± 6/100
2/8 ± 5/71
364 ± 1460
شکل 1: نمودار آگریگاسیون پلاکت‌ها در پاسخ به آراشیدونیک اسید و ریستوستین در روز 1 نگهداری
جدول 3: میانه و دامنه متغیرهای لیپید پراکسیداسیون و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام پلاکت‌ها در روزهای 1، 3 و 5 نگهداری کنسانتره‌های پلاکتی بعد از تزریق ال ـ کارنیتین با غلظت 100 میلی‌مول در مقایسه با گروه شاهد(گروه فاقد ال ـ کارنیتین)
کنترل
مورد
p value*
محدوده اعداد
میانه
محدوده اعداد
میانه
10 = n ، MDA (nmol/PLT)
0
52/1
45/3-19/0
-
-
3
45/3
74/5-98/1
99/2
77/3-75/1
008/0
5
31/5
12/12-08/3
32/4
87/4-99/2
005/0
005/0
005/0
p value*
10 = n ، MDA (mM/PLT)
0
340/0
295/0-398/0
-
-
3
317/0
288/0-391/0
325/0
292/0-393/0
007/0
5
295/0
146/0-313/0
312/0
219/0-331/0
005/0
021/0
005/0
p value*
* p value با استفاده از آزمون آماری ویلکاکسون برای مقایسه بین گروه‌ها در روزهای نگهداری پلاکت(5-3 روز) محاسبه شده است و 05/0 p< از نظر آماری معنادار می باشد.
هم چنین میانگین MDA در طول زمان پس از مداخله نیز تفاوت معناداری نشان می‌دهد، به طوری که در هر دو گروه میانگین MDA در طول زمان به طور معناداری افزایش یافته است(005/0 p= مورد و 005/0 p= کنترل). اما در مورد ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام(Total antioxidant capacity (TAC))، میانگین نتایج بین دو گروه در روز سوم و پنجم نگهداری پلاکت تفاوت معناداری را نشان می‌دهد (005/0 p= روز پنجم و 007/0 p= روز سوم). از سویی دیگر، در مجموع در طول زمان(پس از مداخله) میانگین TAC تفاوت معناداری نشان می‌دهد به طوری که در هر دو گروه مقدار TAC در طول زمان به طور معناداری کاهش یافته است(021/0 p= مورد و 005/0 p= کنترل). در تمـام مقاطـع زمانـی به طور معناداری مقادیر MDA برای گروه کنترل بالاتر از گروه مورد و نیز در تمام مقاطع زمانی به طور معناداری مقادیر TAC برای گروه کنترل پایین‌تر از گروه مورد می‌باشد. هم چنین روند افزایش MDA و کاهش TAC از روز 3 ام تا روز 5 ام، برای هر دو گروه، معنـادار بوده است(جدول 3). نتایج کشت میکروبی پلاکت‌ها در دو محیط Thio و TSB : بر طبق نتایج بدست آمده از کشت میکروبی ، هیچ‌گونه آلودگی باکتریایی در کیسه‌های پلاکت کنسانتره در روزهای اول و پنجم نگهداری پلاکت مشاهده نشد(شکل 1). همان طور که در این نمودار مشاهده می‌شود، غلظـــت MDA که شاخص اصلی پراکسیداسیون لیپیدها می‌باشد در طول مدت نگهداری به صورت معناداری در هر دو گروه پلاکت‌های تیمار شده با ال- کارنیتین و گروه شاهد(گروه فاقد ال- کارنیتین) افزایش می‌یابد. در گروه تیمار با ال-کارنیتین، این افزایش به مراتب کمتر از گروه کنترل می‌باشد و این خود نشان‌دهنده اثر مهاری ال- کارنیتین بر پراکسیداسیون لیپیدها در پلاکت‌ها در طول مدت نگهداری است.ظرفیت آنتی‌اکسیدانی پلاکت‌ها که شاخص مهمی در آسیب اکسیداتیو می‌باشد، در طول مدت نگهداری به صورت معناداری در هر دو گروه پلاکت‌های تیمار با ال- کارنیتین و گروه شاهد (گروه فاقد ال- کارنیتین) کاهش می‌یابد(نمودار 1). در گروه تیمار با ال- کارنیتین، این کاهش به مراتب کمتر از گروه کنترل در روز سوم و پنجم نگهداری پلاکت می‌باشد و این خود نشان می‌دهد که ال- کارنیتین می‌تواند با استفاده از خواص آنتی‌اکسیدانی خود، سبب حفظ ظرفیت آنتی‌اکسیدانی پلاکت‌ها در طول مدت زمان نگهداری شود(نمودار 2).
نمودار 1: تغییرات غلظت مالون دآلدئید
نمودار 2: نمودار تغییرات ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام
بحث نتایج به دست آمده نشان می‌دهد که ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام در گروه تیمار با ال-کارنیتین نسبت به گـروه کنتـرل تا روز پنجـم نگهـداری بهتـر حفظ شده بود غلظت مالون دآلدئید نیز در گروه تیمار با ال-کارنیتین نسبت به گروه کنترل کمتر افزایش یافته بود آسیـب ذخـیره پلاکـت، فرآیند بسیار پیچیده‌ای است و مکانیسم‌های احتمالی ایجاد آن هنوز به خوبی مشخص نمی‌باشند. بعضی از این مکانیزم‌ها در ارتباط با فعال شدن پلاکت‌ها در طول مدت ذخیره‌سازی می‌باشد که می‌تواند در ایجاد PSL نقش داشته باشد(17). تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن و در نتیجه آسیب اکسیداتیو، یکی از عواملی است که می‌تواند سبب فعال شدن پلاکت‌ها گردد(18). در واقع افزایش آسیب و استرس اکسیداتیو در طول مدت نگهداری پلاکت، یکی از دلایل مهم در پیشبرد پروسه PSL است و در نتیجه آن سبب کاهش بقا و کاهش کیفیت در پلاکت‌ها در طول مدت زمان نگهداری به شمار می‌آید(8). بهبود شرایط ذخیره‌سازی و فرآیندهای تولید فرآورده همیشه یکی از اهداف اصلی در طب انتقال خون بوده است(19). استفاده از ترکیبات دارای خواص آنتی‌اکسیدانی مانند ال- کارنیتین در بانک خون می‌تواند در جهت کاهش آسیب اکسیداتیو و به منظور بهبود کیفیت فرآورده پلاکتی مؤثر باشد(22-20، 11). با توجه به خواص آنتی‌اکسیدانی که به این مولکول نسبت داده می‌شود و مطالعه‌هایی که بیانگر تاثیر مثبت آنتی‌اکسیدان‌ها بر تنظیم فعالیت پلاکت‌ها می‌باشند، این مولکول می‌تواند موجب کاهش پیشرفت آسیب ذخیره‌ای در کنسانتره‌های پلاکتی شود. علاوه بر خواص آنتی‌اکسیدانی این ماده، ال- کارنیتین مولکولی غیر سمی و غیرآلرژیک است(23). با توجه به این که تاکنون هیچ مطالعه جامعی در ارتباط با اثر ال- کارنیتین بر آسیب اکسیداتیو در پلاکت‌ها در طول مدت نگهداری انجام نشده است، در این مطالعه به اثر ال- کارنیتین بر آسیب اکسیداتیو پلاکت‌ها در طول مدت نگهداری تا 5 روز پرداخته شده که از جنبه‌های نوآوری این مطالعه محسوب می‌شود. در این تحقیق، بعد از انجام مطالعه پایه که در آن پلاکت‌ها با غلظت‌های مختلف ال- کارنیتین تیمار شدند، غلظت 100 میلی مول ال- کارنیتین به عنوان مؤثرترین غلظت در کاهش آسیب اکسیداتیو انتخاب شد. در مطالعه قبلی، فقط به اثر ال- کارنیتین بر متابولیزم، عملکرد و بقای پلاکت‌ها در طول مدت نگهداری پرداخته شده بود(11) و اثر این ماده بر آسیب اکسیداتیو در پلاکت‌ها در طول مدت نگهداری مطالعه نشده بود. نتایج به دست آمده از مطالعه حاضر نشان‌دهنده این است که غلظت 100 میلی مول ال-کارنیتین نسبت به غلظت‌های دیگر از این ماده اثر بهتری را جهت حفظ ظرفیت آنتی‌اکسیدانی پلاکت و هم چنین مهار پراکسیداسیون لیپیدها نشان می‌داد، اگر چه غلظت 15 میلی‌مول ال- کارنیتین که در مطالعه قبلی توانسته بود بر حفظ عملکرد و بقای پلاکت‌ها در طول مدت زمان نگهداری مؤثر باشد(11)، در این مطالعه نیز توانست سبب کاهش پراکسیداسیون لیپیدها در روز سوم نگهداری باشد ولی برای حفظ ظرفیت آنتی‌اکسیدانی پلاکت‌ها در طول مدت نگهداری این غلظت کافی نبود. نتایج مطالعه حاضر نشان می‌دهد که میزان تولید MDA در پلاکت‌های تیمار شده با ال- کارنیتین در روزهای سوم و پنجم نگهداری به مراتب کمتر از پلاکت‌های فاقد ال-کارنیتین(گروه کنترل) بود(005/0 p= روز پنجم، 008/0 p= روز سوم)، که این نشان‌دهنده کاهش پراکسیداسیون لیپیدها در پلاکت‌هایی بود که با ال-کارنیتین تیمار شده بودند. این نتایج با نتایجی که توسط جوس زاک و همکارانش به دست آمده بود مطابقت داشت. در مطالعه این گروه، میزان پراکسیداسیون لیپیدها در پلاکت‌های تحریک شده با ترومبین بعد از انکوبه شدن با ال-کارنیتین کاهش می‌یافت(21). نتایج به دست آمده از مطالعه حاضر و نتایج به دست آمده از سایر تحقیقات بیانگر این حقیقت است که ال-کارنیتین می‌تواند به طور مؤثری سبب کاهش پراکسیداسیون لیپیدها شود. احتمالاً ال-کارنیتین به واسطه جمع‌آوری رادیکال‌های آزاد و شلاته کردن فلزهای کاتالیتیکی نظیر Fe و Cu که پیش‌برنده تولید ROS می‌باشند، می‌تواند ممانعت از آسیب اکسیداتیو نماید(24). از طرف دیگر، ال-کارنیتین به دلیل کمک به حفظ یکپارچگی میتوکندری و بنابراین پایین آوردن شانس تولید ROS، مانع پراکسیداسیون لیپیدها می‌شود و بنابراین تولید MDA که از محصولات ثانویه پراکسیداسیون لیپیدها است را کاهش می‌دهد(26، 25، 14). در این مطالعه برای اولین بار، ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام کنسانتره‌های پلاکتی در مواجه با ال-کارنیتین در طول مدت نگهداری بررسی شد. بر طبق نتایج به دست آمده از پلاکت‌های تیمار با ال-کارنیتین در مقایسه با گروه فاقد ال-کارنیتین(کنترل) ، به نظر می‌رسد ال-کارنیتین تا روز پنجم نگهداری پلاکت به خوبی قادر به حفظ ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام پلاکت‌ها می‌باشد(005/0 p= روز پنجم و 007/0 p= روز سوم). در سال 1997 آردوئینی و همکارانش از ال-کارنیتین با غلظت 5 میلی‌مولار در کیسه‌های خون کامل استفاده کردند. نتایج به دست آمده توسط این گروه حکایت از تفاوت آشکار در غلظت ATP و میزان همولیز بین دو گروه خون‌های تیمار شده با ال-کارنیتین و گروه فاقد ال-کارنیتین می‌کرد. خون‌های تیمار شده با ال-کارنیتین به مراتب دارای همولیز کمتر و غلظت بالاتری از ATP نسبت به گروه فاقد ال-کارنیتین بودند(22). در سال‌های بعد دانشمندان اثر این مولکول را بر پلاکت‌ها نیز بررسی کردند. در مطالعه‌ای که در سال 2000 توسط سویینی و همکارانش در ایتالیا بر روی پلاکت‌های کنسانتره انجام شد، میزان کاهش گلیکولیز بعد از تیمار پلاکت‌ها با ال-کارنیتین بررسی شد. بنا به نتایج به دست آمده توسط این گروه، ال-کارنیتین با غلظت 5 میلی‌مولار می‌توانست مانع کاهش pH ، موجب کاهش مصرف گلوکز و مانع افزایش لاکتات در فرآورده پلاکتی شود و بر طبق آن، تاثیر مثبت ال-کارنیتین در صورت افزایش زمان ذخیره‌سازی تا 10 روز آشکارتر می‌شد. بنابراین در صورت داشتن توانایی غیرفعالسازی پاتوژن‌ها به منظور ذخیره‌سازی پلاکت‌ها برای مدت طولانی‌تر، کنترل متابولیسم پلاکت‌ها به کمک ال-کارنیتین می‌تواند گزینه مناسبی برای حفظ کیفیت فرآورده پلاکتی باشد که از طرف این گروه بیان شد(27). در سال 2009جوس‌زاک و همکارانش اثر آنتی‌اکسیدانی ال-کارنیتین را بر استرس اکسیداتیو در پلاکت‌ها بررسی کردند. در این مطالعه تمرکز بر استرس ایجاد شده در بدن به خاطر فعالیت‌های سنگین ورزشی بود. در این مطالعه اثر استرس اکسیداتیو بر فعال شدن پلاکت‌ها با بررسی تاثیر ال-کارنیتین به عنوان یکی از مکمل‌های محبوب بین ورزشکاران بر عملکرد پلاکت‌ها انجام شد و ال-کارنیتین در غلظت 100 میلی‌مولار توانست میزان تجمع پلاکت‌ها را تا 10% کاهش دهد(21). در سـال 2015 مطالعـه‌ای کـه توسط دیهیم و همکارانش در سازمان انتقـال خـون ایـران انجام گرفت با هدف بررسی تاثیر ال-کارنیتین بر بهبود متابولیسم و کیفیت پلاکت‌های کنسانتره در طول مدت نگهداری بود و بر طبق نتایج حاصل از این تحقیق، به نظر می‌رسید که به علت افزایش اکسیداسیون اسیدهای چرب در پلاکت‌های تیمار شده با ال- کارنیتین، میزان مصرف اکسیژن افزایش می‌یافت و این امر می‌توانست یکی از فواید استفاده از ال- کارنیتین برای بهبود فرآیندهای متابولیک در کنسانتره‌های پلاکتی باشد. بر اساس نتایج به دست آمده میزان آگریگاسیون پلاکت‌ها در گروه تیمار با ال- کارنیتین در پاسخ به آگونیست‌ها بالاتر بود و ال- کارنیتین می‌توانست سبب بهبود در عملکرد پلاکت‌ها شود و در مجموع ال-کارنیتین می‌توانست در حفظ کیفیت فرآورده پلاکتی و کاهش آسیب ذخیره‌ای پلاکت مؤثر باشد (11). با بررسی دوباره مکانیسم‌های آنتی‌اکسیدانی ال-کارنیتین، می‌توان این طور نتیجه گرفت که در پلاکت‌ها به دلیل فقدان هسته، مکانیسم آنتی‌اکسیدانی ال- کارنیتین محدود به 1) جمع‌آوری مستقیم رادیکال‌های آزاد، 2) شلاته کردن یون‌های فلزی، 3) حفظ یکپارچگی میتوکندری و بنابراین ممانعت از تولید رادیکال‌های آزاد در زنجیره انتقال الکترون و در نهایت 4) مهار آنزیم‌های تولید کننده ROS می‌باشد، در حالی که در سلول‌های هسته دار این مولکول به واسطه فعال کردن فاکتورهای رونویسی نظیر Nrf2 و PPARα می‌تواند موجب افزایش تولید آنزیم‌ها و مولکول‌های آنتی‌اکسیدانی سلول شود(12). پس می‌توان چنین نتیجه گرفت که ال- کارنیتین به واسطه کاهش مقدار ROS به واسطه راه‌هایی که قبلاً توضیح داده شد، موجب حفظ ظرفیت آنتی‌اکسیدانی پلاکت‌های کنسانتره تا روز پنجم در این مطالعه شود و قادر به مقابله با رادیکال‌های آزاد بوده و می‌تواند سبب حفظ ظرفیت آنتی‌اکسیدانی در پلاکت‌ها شود. یکی از محدویت‌های مطالعه حاضر وجود مقدار کمی گلبول سفید در فرآورده پلاکتی بود(/µL 103× 1/0 WBC=). اگر چه این مقدار از گلبول سفید در مقابل تعداد پلاکت‌ها که میانگین آن به بیش از /µL 106× 3/1 PLT = می‌رسید مقدار ناچیزی است که احتمال تداخل بسیار کم می‌باشد ولی در مطالعه‌های بعدی پیشنهاد می‌گردد جهت حذف هرگونه تداخل احتمالی، جداسازی گلبول‌های سفید از فرآورده پلاکتی انجام گردد. با توجه به نتایج به دست آمده از این مطالعه، به نظر می‌رسد ال-کارنیتین می‌تواند سبب کاهش آسیب اکسیداتیو به واسطه کاهش پراکسیداسیون لیپیدها و حفظ ظرفیت آنتی‌اکسیدانی در پلاکت‌ها شود و به همین دلیل شاید در آینده بتواند به عنوان ماده افزودنی در پلاکت‌های ذخیره شده جهت حفظ بقا و کیفیت آن‌ها مورد استفاده قرار گیرد.
نتیجه‌گیری با در نظر گرفتن نتایج به دست آمده از مطالعه حاضر و مقایسه آن با سایر مطالعه‌های انجام گرفته در این خصوص، به نظر می‌رسد که ال- کارنیتین قادر به حفظ ظرفیت آنتی‌اکسیدانی و هم چنین توانایی مهار نسبی پراکسیداسیون لیپیدها در پلاکت‌ها در طول مدت نگهداریبوده و بدین ترتیب می‌تواند سبب کاهش آسیب‌های اکسیداتیو در پلاکت‌ها در طول مدت ذخیره‌سازی گردد و شاید بتواند با کاهش آسیب‌های اکسیداتیو که یکی از فاکتورهای مهم در بروز آسیب‌های ذخیره پلاکت(PSL) می‌باشد، تا حدی سبب حفظ کیفیت و بقا پلاکت‌ها در طول دوران ذخیره‌سازی باشد. با توجه به طبیعی بودن،
بی‌خطر بودن و اثرات آنتی‌اکسیدانی که این ماده دارا می‌باشد، شاید در آینده بتوان از آن به عنوان ماده افزودنی در پلاکت‌ها استفاده کرد. در این مطالعه فقط به دو شاخص پراکسیداسیون لیپیدها و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام کنسانتره‌های پلاکتی پرداخته شد. اثر آنتی‌اکسیدانی این مولکول و مکانیزم‌های مرتبط با آن در کنسانتره‌های پلاکتی در طول مدت نگهداری در شرایط بانک خون نیاز به مطالعه‌های بیشتری دارد.
تشکر و قدردانی این پروژه بخشی از پایان‌نامه کارشناسی ارشد می‌باشد که در تاریخ 24/12/94 با کد اخلاق IR.TMI.REC.1394.44 در شورای پژوهشی به تصویب رسیده و با حمایت مالی مؤسسه آموزش عالی طب انتقال خون انجام شده است. از معاونت آموزشی و پژوهشی مؤسسه آموزش عالی طب انتقال خون و ریاست محترم پایگاه انتقال خون تهران که همکاری لازم را جهت اجرای این پروژه داشته‌اند و هم چنین از همکاران شاغل در آزمایشگاه‌های مرکز نوآوری، بیوشیمی، هماتولوژی و انعقاد سازمان انتقال خون نهایت تشکر و قدرددانی به عمل می‌آید.
Helmi Siasi N, Deyhim M, Amiri F, Amini Kafiabad S. The antioxidant impact of the L-carnitine (LC) in platelet concentrates during storage. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2017; 14 (3) :175-187 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1118-fa.html
حلمی سیاسی نوشین، دیهیم محمدرضا، امیری فاطمه، امینی کافی آباد صدیقه. تاثیر آنتی‌اکسیدانی ال - کارنیتین در پلاکت کنسانتره در طول مدت نگهداری. فصلنامه پژوهشی خون. 1396; 14 (3) :175-187
