[صفحه اصلی ]   [Archive] [ English ]  
:: صفحه اصلي :: درباره نشريه :: آخرين شماره :: آرشيو مقالات :: جستجو :: ثبت نام :: ارسال مقاله :: تماس با ما ::
:: جلد 15، شماره 1 - ( بهار 1397 ) ::
جلد 15 شماره 1 صفحات 36-46 برگشت به فهرست نسخه ها
پرتودهی با اشعه گاما، شیوه‌ای مناسب جهت استریلیزاسیون غشای فیبرینی همراه با حفظ ویژگی‌های زیست سازگاری آن
طاهر اکبری سعید، دکتر میثم احمدی زیدآبادی، دکتر احمد فاطمی، دکتر علیرضا فارسی نژاد*
PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمان
واژه‌های کلیدی: کلمات کلیدی: مهندسی بافت، فیبرینوژن، استریلیزاسیون، اشعه گاما
متن کامل [PDF 724 kb]   (199 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (861 مشاهده)
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: هماتولوژي
متن کامل:   (99 مشاهده)
پرتودهی با اشعه گاما، شیوه‌ای مناسب جهت استریلیزاسیون غشای فیبرینی همراه
با حفظ ویژگی‌های زیست سازگاری آن
 
طاهر اکبری سعید1، میثم احمدی2، احمد فاطمی3، علیرضا فارسی‌نژاد4
 
چکیده
سابقه و هدف
مهندسی بافت به عنوان یک روش بالقوه برای ترمیم بافت‌های آسیب‌دیده ابداع گردید. پیش شرط لازم برای مهندسی بافت در شرایط آزمایشگاهی، رشد کافی سلول‌ها بر روی داربست سلولی می‌باشد. یکی از بیومتریال‌های جدید و مهم که از سال 2006 معرفی شد و هم اکنون فقط به صورت اتولوگ استفاده می‌شود، غشای فیبرینی است. با این وجود، استفاده از غشای فیبرینی به صورت آلوژن به دلیل خطر انتقال بیماری­های ویروسی و باکتریایی مختلف توسط آن بسیار محدود می­باشد. شاید بتوان استریلیزه کردن غشای فیبرینی را کلیدی­ترین راه‌کار برای رفع محدودیت­های کاربردی آن در مهندسی بافت دانست.
مواد و روش‌ها
در مطالعه تجربی حاضر، غشای فیبرینی از پلاسمای تازه منجمد(FFP) تهیه شده و با سه روش استریل گردید. میزان بقای سلولی و سمیت غشاهای فیبرینی استریل شده بر سلول­های فیبروبلاستی رده 3T3 با آزمایش MTT ارزیابی و تجزیه و تحلیل آماری داده­های به دست آمده با استفاده از آزمون Paired-Sample t-test انجام شد.
یافته‌ها
غشاهای فیبرینی استریل شده و نشده، بقای سلول­های فیبروبلاستی را 24 و 48 ساعت پس از مجاورت با غشا به طور معناداری افزایش دادند، ولی 72 ساعت پس از مجاورت با غشا، از مقدار تکثیر سلولی کاسته و شواهدی از مرگ سلولی دیده شد(به ترتیب 004/0 p= و 006/0 p=).
نتیجه گیری
بر اساس نتایج می­توان چنین استنباط کرد که غشای فیبرینی با فراهم نمودن بستری مناسب و آزادسازی فاکتورهای رشد، سبب تقویت پتانسیل تکثیر و افزایش بقای سلول­ها می­گردد و استریلیزاسیون تاثیری بر این ویژگی غشای فیبرینی ندارد.
کلمات کلیدی: مهندسی بافت، فیبرینوژن، استریلیزاسیون، اشعه گاما
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
تاریخ دریافت: 20/9/95
تاریخ پذیرش: 20/9/96
 

1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ دانشکده علوم پزشکی سیرجان ـ دانشگاه علوم پزشکی کرمان ـ کرمان ـ ایران
2- دکترای بیوفیزیک ـ استادیار مرکز تحقیقات فیزیولوژی و علوم اعصاب دانشگاه علوم پزشکی کرمان ـ کرمان ـ ایران
3- PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمان ـ کرمان ـ ایران
4- مؤلف مسئول: PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمان ـ کرمان ـ ایران ـ کدپستی:  7619794435
 

مقدمه
    مهندسی بافت، علم طراحی و تولید بافت­های جدید برای ترمیم اندام­های آسیب دیده و جایگزینی قسمت­های از دست رفته می­باشد(2، 1). در واقع، مهندسی بافت با کشت سلول­های زنده بیمار بر روی داربست­های زیستی تخریب پذیر سه بعدی و با شبیه‌سازی عملکرد فیزیولوژیکی بستر خارج سلولی(ECM)، اجزای قابل پیوند و یا ساختارهایی را ایجاد می­نماید که منجر به بازسازی و بازگردانی عملکرد بافت می­شود(5-3). افزایش کارایی و بهبود عملکرد کشت سلول و بافت­های مهندسی شده، نیازمند ایجاد داربست­های مناسب و کارا می­باشد. از این­رو، استفاده از بیومتریال­های زیستی و ساختی به عنوان داربست­های سلولی در فرآیندهای ترمیم بافتی، گسترش فراوانی یافته است(8-6).
    غشای فیبرینی از جمله بیومتریال­های زیستی است که پتانسیل بالایی برای استفاده در مهندسی بافت دارد(12-9). فیبرین از خون خود بیمار جداسازی شده و به عنوان یک داربست اتولوگ بدون خطر از نظر ایجاد واکنش­های ایمنی و هم‌چنین انتقال عفونت مورد استفاده قرار می­گیرد. کاربرد فیبرین در زمینه­های مهمی هم‌چون جراحی­های شکمی، ارتوپدی، اعصاب و دهان رایج است(13). استفاده از فیبرین به­ عنوان یک داربست بافتی، محیطی با عملکرد سلولی مناسب را فراهم آورده که امکان مهاجرت، رشد، تکثیر و تمایز سلولی را به طور مطلوب ایجاد می‌نماید(14).
    مطالعه‌های انجام شده حاکی از آن است که فعالیت متابولیک، تکثیر و تمایز سلولی در داربست­های فیبرینی به ویژه غشای فیبرینی غنی از پلاکت به طور معناداری بیشتر از سایر بیومتریال­های زیستی است(15).
    زیست سازگاری بالا، قابلیت تجزیه‌پذیری زیستی، ایمنوژنیسیتی کم، عدم سمیت سلولی، میل اتصالی بالا، تهیه آسان، خصوصیات فیزیکی و مکانیکی مناسب و پایداری مطلوب غشای فیبرینی را به یک بیومتریال مناسب در مهندسی بافت تبدیل کرده است. با این وجود، احتمال انتقال بیماری­های ویروسی خطرناک نظیر HCV ، HBV ، HIV و غیره هم‌ چنین بیماری‌های باکتریایی مختلف توسط غشای فیبرینی، استفاده از این بیومتریال را صرفاً به فرم اتولوگ محدود کرده است(23-16).
    یافتن راه‌کاری مناسب برای استفاده از غشای فیبرینی به صورت آلوژن در مهندسی بافت و هم‌چنین رفع محدودیت­های کاربردی آن، سبـب استفاده گسترده­تر از این بیومتریال زیسـت سـازگار و بهره­مندی از مزایای آن ­می­گردد (25، 24). از این­رو، روش­های مختلف استریلیزاسیون همانند اتوکلاو، اشعه فرابنفش، اشعه گاما و اتیلن اکساید جهت استریل کردن غشای فیبرینی می­توانند مؤثر واقع گردند. از آن جا که تاکنون هیچ کار پژوهشی در زمینه استریل کردن غشای فیبرینی انجام نشده، مطالعه حاضر با هدف بررسی تاثیر روش­های مختلف استریلیزاسیون بر ارزیابی سمیت سلولی در غشاهای فیبرینی استریل شده انجام گرفته است.
 
مواد و روش‌ها
    در یک مطالعه تجربی، ارزیابی سمیت سلولی غشاهای فیبرینی استریل شده بر سلول­های فیبروبلاستی رده 3T3 در 5 گروه تجربی و یک گروه کنترل و در زمان­های 24، 48 و 72 ساعت انجام گرفت. نتایج حاصل از تمامی آزمایش‌ها حاصل میانگین چهار بار تکرار نمونه­ها به وسیله آزمایش MTT بود. مراحل انجام این مطالعه به قرار زیر است.
 
ساخت غشای فیبرینی:
    پلاسمای تازه منجمد یا FFP (Fresh Frozen Plasma) از سازمان انتقال خون کرمان تهیه شد. سپس با استفاده از اتانول سرد، فیبرینوژن جداسازی شد و با استفاده از ترومبین انسانی در ون بشرهای استریل آزمایشگاهی پلیمریزه و به شکل ژل فیبرینی درآمد. این ژل فیبرینی پس از آبگیری توسط سانتریفیوژ به غشای فیبرینی به قطر 5 سانتی‌متر تبدیل گردید. جهت تهیه ترومبین انسانی از بخشی از پلاسمای تازه منجمد شده استفاده شد که طی آن 5/1 میلی‌لیتر از کلسیم 10% با 5/1 میلی‌لیتر از اتانول مطلق مخلوط و در نهایت به 7 میلی‌لیتر از پلاسمای تازه افزوده گردید. پس از گذشت چند دقیقه و تشکیل لختـه،
سـرم حـاوی تـرومبین به عنوان منبعی از ترومبین انسانی
جدا و مورد استفاده قرار گرفت.
 
استریلیزاسیون غشای فیبرینی:
    استریلیزاسیون غشای فیبرینی با به کارگیری 3 روش اتوکلاو، اشعه فرابنفش و اشعه گاما انجام شد. به منظور استریل کردن غشاهای فیبرینی با حرارت مرطوب تحت فشار از اتوکلاو استفاده شد. فرآیند استریلیزاسیون در اتوکلاو(پارس طب نوین، ایران) در  فشار بخار 15 پوند بر اینچ مربع در دمای 121 درجه سانتی­گراد و به مدت 15 دقیقه انجام شد(26).
    به منظور استریل کردن غشاهای فیبرینی با اشعه فرابنفش از لامپ UV هود لامینار(ژال تجهیز، ایران) استفاده شد. بدین منظور، غشاها به مدت 30 و 60 دقیقه در زیر لامپ UV قرار گرفتند(27). جهت استریلیزاسیون با اشعه گاما، غشاهای ساخته شده در معرض 25 کیلوگری پروتوی گاما تولید شده توسط دستگاه گاماسل(کانادا) موجود در سازمان انتقال خون کرمان، قرار گرفتند(32-28).
 
کشت سلول­های فیبروبلاستی رده 3T3 :
    در مطالعه تجربی حاضر، به ­منظور بررسی سمیت سلولی در غشاهای فیبرینی استریل شده، از سلول­های فیبروبلاستی رده 3T3 استفاده شد. این رده سلولی از انستیتو پاستور ایران تهیه گردید. کشت سلولی در محیط کشت DMEM (آمریکا، جیبکو) حاوی 10% FBS (آمریکا، جیبکو) و 1% آنتی بیوتیک پنی‌سیلین استرپتومایسین(آمریکا، جیبکو) در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی­گراد و در شرایط  5% 2CO و رطوبت 95% صورت گرفت. پاساژ سلولی به فواصل 3-2 روز انجام شد. زمانی­ که سلول­ها به پاساژ سوم رسیدند، حیات سلولی با استفاده از رنگ تریپان بلو 4/0% تایید گردیده و سلو­ل­ها توسط لام نئوبار شمارش شدند.
    با بررسی­های میکروسکوپی از شرایط مناسب سلول‌های رده 3T3  اطمینان حاصل شد و این سلـــول­ها برای آزمایش سمیت سلولی به روش MTT مورد استفاده قرار گرفتند.
بررسی سمیت غشای فیبرینی بر سلول­های فیبروبلاستــی
رده 3T3 با روش MTT :
الف- قرارگیری غشای فیبرینی در مجاورت سلول­های فیبروبلاستی رده 3T3 :
  آزمایش MTT ] 3-(4 و 5- دی‌متیل تیازول-2- یل) 2- و 5- دی متیل تترازولیوم بروماید[ به منظور تعیین میزان سمیت سلولی غشای فیبرینی و تاثیر آن بر زنده‌مانی سلول­های رده 3T3 انجام شد. بدین منظور تعداد 103 × 100 سلول رده 3T3 به صورت یک لایه درون هر یک از چاهک­های پلیت 96 خانه قرار داده شد. 100 میکرولیتر محیط کشت DMEM کامل به هر یک از چاهک­ها اضافه شد و سلول­ها به مدت 24-18 ساعت (overnight) در دمای 37 درجه سانتی­گراد و در حضور 5% CO2 و رطوبت 95% انکوبه گردیدند. در زیر هود لومینار و در شرایط استریل، غشاهای فیبرینی(استریل شده و استریل نشده) با استفاده از پانچ به شکل دایره­هایی با قطر 3 میلی­متر برش داده شدند. روز بعد، پس از اطمینان از چسبیدن کامل سلول­ها و پر شدن کف چاهک­ها (confluency حدود 80%-70%)، محیط سلول­ها با احتیاط تعویض گشته و غشاهای فیبرینی برش داده شده با توجه به گروه آن­ها (در معرض اشعه فرابنفش به مدت 30 دقیقه، در معرض اشعه فرابنفش به مدت 60 دقیقه، اتوکلاو شده، در معرض اشعه گاما و غشای استریل نشده) به چاهک­های مربوطه اضافه گردیدند. برای هر یـک از 5 گروه غشاهای فیبرینی و گروه کنترل 4 چاهـک اختصاص داده شد. به چاهک­های گروه کنترل غشای فیبرینی اضافه نشد.
 
ب: ارزیابی درصد زنده­مانی سلول­های فیبروبلاستی رده 3T3 :
    در پایان درصد زنده­مانی سلول­های فیبروبلاستی رده 3T3 در زمان­های 24، 48 و 72 ساعت پس از انتقال غشای فیبرینی با به کارگیری آزمایش MTT مورد سنجش قرار گرفت. بدین منظور، 12 ساعت پس از مجاورت با غشاها، غشاهای فیبرینی و محیط کشت به آرامی از چاهک­ها خارج شده و مقدار 20 میکرولیتر از محلول MTT با غلظت mg/mL 5 در محیط تاریک به هر یک از چاهک­ها اضافه شد. پلیت با فویل آلومینیومی پوشیده شده و به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه گردید. پس از انکوباسیون، محیط­ها تخلیه شده و به منظور حل کردن کریستال­های فورمازان، مقدار 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید (DMSO) به چاهک­ها اضافه شده و پس از 15 دقیقه، جذب نوری سلول­ها با استفاده از دستگاه الایزا ریدر در طول موج 490 نانومتر و با فیلتر مرجع در 620 نانومتر خوانده شد.
 
آنالیزهای آماری:
    آنالیز آماری داده­های به دست آمده با استفاده از نرم‌افزار 23 IBM SPSS Statistic و با به کارگیری آزمون Paired-Sample t-test انجام شد. سطح معنا­داری با ارزش 01/0 p< مشخص گردید.
 
یافته‌ها
    نتایج حاصل از ارزیابی سمیت سلولی غشاهای فیبرینی استریل شده بر سلول­های فیبروبلاستی رده 3T3 در 5 گروه تجربی و یک گروه کنترل و در زمان­های 24، 48 و 72 ساعت جمع‌آوری گردید. تمامی نتایج موجود
در جداول و نمودارهای رسم شده، حاصل میانگین چهار بار تکرار نمونه­ها به وسیله آزمایش
MTT می­باشند. درصد بقا و سمیت سلولی(میانگین ± انحراف معیار) در گروه­های آزمایش نسبت به گروه کنترل بر حسب زمان‌های پیگیری ترسیم شد(نمودار 1). درصد بقای (حیات) سلولی از تقسیم میانگین میزان جذب نوری هر یک از گروه­های آزمایش به میانگین جذب نوری گروه کنترل در همان زمان ضربدر 100 به دست آمده و با کم کردن این عدد از 100، میزان درصد سمیت سلولی به دست آمد(33). مقایسه درصد بقای سلولی در غشای استریل نشده (طبیعی) با غشاهای استریل شده تفاوت معنا­داری را نشان نداد. بررسی­های انجام شده نشان داد که غشاهای فیبرینی استریل شده و هم‌چنین غشای فیبرینی استریل نشده، بقای سلول­های فیبروبلاستی را 24 و 48 ساعت پس از مجاورت با غشا به طور معناداری افزایش داده‌اند(به ترتیب 004/0 p= و 006/0 p=).
    به عبارتی، غشای فیبرینی بستری مناسب جهت رشد و تکثیر سلول‌های فیبروبلاستی فراهم آورده است. ولی 72 ساعت پس از مجاورت با غشا، از مقدار تکثیر سلولی کاسته شده و شواهدی از مرگ سلولی دیده شده است(نمودار 1).
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

نمودار1: مقایسه درصد زنده­‌مانی سلول­های رده 3T3 در غشاهای فیبرینی استریل شده و استریل نشده با گروه کنترل بر حسب زمان­های پیگیری
 

تفاوت معنا­داری در بقای سلولی در زمان 72 ساعت در غشاهای استریل شده مشاهده نشد ولی این تفاوت در غشای فیبرینی استریل نشده(طبیعی) معنا­دار بود(006/0 p=)(نمودار 2). بر اساس نتایج حاصله، تحریک رشد و افزایش بقای سلولی در 48 ساعت اول مجاورت با غشا دیده شده و پس از آن از میزان رشد و تکثیر سلولی کاسته شده است. بیشترین میزان بقای سلولی در غشای فیبرینی(استریل شده و استریل نشده) 48 ساعت پس از مجاورت با غشا دیده شد. یافته دیگر این­ بود که برخلاف سایر گروه­ها، غشای فیبرینی استریل شده با اشعه گاما 72 ساعت پس از مجاورت با غشا، برای سلول­های رده 3T3 توکسیک بوده و میزان بقای سلولی را به 5/95% کاهش داده است (جدول 1).
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

نمودار 2: مقایسه سمیت سلولی غشاهای فیبرینی استریل شده با گروه کنترل در زمان­های 24، 48 و 72 ساعت پس از مجاورت با غشا، A: سمیت سلولی غشای فیبرینی استریل شده با اشعه فرابنفش(به مدت 30 دقیقه) در مقایسه با گروه کنترل، B: سمیت سلولی غشای فیبرینی استریل شده با اشعه فرابنفش(به مدت 60 دقیقه) در مقایسه با گروه کنترل، C: سمیت سلولی غشای فیبرینی اتوکلاو شده در مقایسه با گروه کنترل، D: سمیت سلولی غشای فیبرینی استریل شده با اشعه گاما در مقایسه با گروه کنترل، E: سمیت سلولی غشای فیبرینی استریل نشده در مقایسه با گروه کنترل. در این نمودارها ** نشان‌دهنده 01/0 p ،  *** نشان‌دهنده 001/0  p و **** نشان‌دهنده 0001/0 ≥ p است.
جدول 1: درصد بقا و سمیت سلولی در غشاهای فیبرینی استریل شده نسبت به گروه کنترل بر حسب زمان‌های پی‌گیری
 
گروه‌ها 24 ساعت 48 ساعت 72 ساعت
بقای سلولی (درصد) سمیت سلولی (درصد) بقای سلولی (درصد) سمیت سلولی (درصد) بقای سلولی (درصد) سمیت سلولی (درصد)
اشعه UV (30 دقیقه) 009/0 ± 4/162 - 010/0 ± 1/188 - 015/0 ± 7/107 -
اشعه UV (60 دقیقه) 007/0 ± 7/171 - 010/0 ± 6/182 - 012/0 ± 8/115 -
اتوکلاو 002/0 ± 5/157 - 009/0 ± 2/203 - 020/0 ± 3/113 -
اشعه گاما 006/0 ± 1/151 - 015/0 ± 7/169 - 011/0 ± 5/95 5/4
غشای دست نخورده 003/0 ± 2/167 - 018/0 ± 3/181 - 019/0 ± 5/110 -
* از آن جایی که نه تنها سمیت سلولی وجود ندارد بلکه باعث القای رشد و تمایز شده است لذا بر اساس فرمول درصد سمیت سلولی منفی محاسبه می‌شود که نشان‌دهنده تاثیر مثبت و القای رشد و تکثیر سلولی است ولی از آن‌جایی که نمی‌توان عدد منفی گزارش کرد، در محل مورد نظر خط فاصله قرار داده شده است که نشان‌دهنده عدم وجود سمیت سلولی می‌باشد.
 

بحث
    یافته‌ها حاکی از آن است که غشای فیبرینی بقای سلول­های فیبروبلاستی را به میزان چشمگیری افزایش داده و فرآیندهای مختلف استریلیزاسیون تاثیری منفی بر پتانسیل تکثیری غشای فیبرینی نداشته است. از آن جایی که یکی از مهم‌ترین جنبه‌های تاثیرگذار یک غشای زیستی در عملکرد آن، خصوصیات فیزیکی آن می‌باشد، لذا به نظر می‌رسد در کل ویژگی‌های فیزیکی ماده زیستی مورد نظر در اثر اعمال روش‌های مختلف استریلیزاسیون تحت تاثیر قرار نگرفته است، این یافته‌ها با نتایج حاصل از پژوهش رونی و همکاران که در سال 2008 بر روی پوست انجام شد، هم‌راستا بود. در این پژوهش نیز پوست قرار گرفته در معرض اشعه گاما با دوز 25 کیلوگری با پوست دست نخورده تفاوتی از نظر قابلیت‌های پیوند نداشت(28). بر اساس یافته‌ها درصد بقا و تکثیر سلول‌های فیبروبلاستی 24 و 48 ساعت پس از مجاورت با غشای فیبرینی به طور معنادار و چشمگیری افزایش می­یابد. با توجه به ساختار سه بعدی مناسب و هیدروفیل بودن غشای فیبرینی، این بیومتریال قادر است به عنوان یک ماده زمینه خارج سلولی، بستری مناسب جهت رشد سلول‌ها فراهم آورد. به علاوه، آزاد شدن بسیاری از فاکتورهای زیست فعال از فیبرین می‌تواند در رشد و تمایز
سلول­­ها نقش مهمی را ایفا نماید.
این نتایج با یافته‌های احمد و همکاران مشابهت دارد. در این مطالعه نیز نتایج نشان داد فاکتورهای رشد موجود در چسب فیبرینی سبب تحریک رشد و همانندسازی سلول‌های غضروفی در محل آسیب دیده می‌گردد. به گونه‌ای که زمان ترمیم را به طور چشمگیری کاهش می‌دهد. هم‌چنین افرادی و همکاران نیز در مطالعه‌ای که بر روی اثر ترمیمی پلاسمای غنی از پلاکت بر روی زخم‌های مزمن داشتند، دریافتند که فاکتورهای رشد موجود در این بیومتریال توانایی بالایی در القای رشد و تکثیر سلولی دارد(36-34).
    برخلاف هیدروژل­های سنتتیک، فیبرین نه تنها یک ماتریکس سلول­رسان است بلکه فعالیت زیستی فیبریـن آن را برای تمایز سلول­های بنیادی و مهندسی بافت مناسب می­سازد (37). یافته­های چن و همکاران با نتایج حاصل از این پژوهش یکسان بود. این گروه در سال 2012 نشان دادند که تلفیق پلاکت انسانی بـا چسـب فیبرینـی، پتانسیل تمایزی و تکثیری کندروسیت‌­ها را در این داربست به میزان بالایی افزایش می­بخشد(38). هم چنین کپسوله شدن سلول­ها درون داربست فیبرینی از دیگر عوامل مؤثر در حمایت از تکثیر سلولی است. از طرفی ، توالی اتصالی اینتگرینی آرژنینگلیسین- آسپارتیک اسیـد
که یک عامل تحریک‌کننده اتصال و رشد سلولی است، در فیبرین وجود دارد(39). در مطالعه­ای دیگر گزارش شده که در محیط‌های برون و درون بدنی(in vitro و in vivo)، فیبرین امکان حمایت از رشد سلول­های فیبروبلاست و کراتینوسیت را فراهم آورده و سبب افزایش تحرک سلولی در محل­های زخم می­گردد. چسب فیبرینی نیز از قابلیت­ خوبی در انتقال فاکتورهای رشد اگزوژنی برخوردار است، همین امر موجب بروز پیشرفت­هایی در زمینه درمان زخم گردیده است(13).
   از سویی، به نظر می­رسد که تکثیر بسیار بالای سلول­ها در 48 ساعت اول پس از مجاورت با غشا، غلظت فاکتورهای رشد آزاد شده از غشای فیبرینی و هم چنین محرک­های رشد موجود در محیط کشت سلول­ها را کاهش داده و همین امر مانع تکثیر پیش­رونده و بقای طولانی مدت سلول­ها در زمان 72 ساعت می­گردد. به علاوه، گمان می­رود که نقش رادیکال­های آزاد ایجاد شده در غشاهای فیبرینی که در معرض پرتوهای گاما قرار گرفتند، با کاهش عوامل محرک رشد در محیط پر رنگ­تر شده و کاهش بقای سلولی و همچنین مرگ سلولی را به دنبال دارد(29). همین امر توجیه کننده سمیت سلولی 5/4 درصدی غشاهای فیبرینی استریل شده با اشعه گاما در زمان 72 ساعت می­باشد. پیش از این نیز، نقش فیبرین در تحریک رشد، تکثیر و بقای سلولی در گروهی از مطالعه‌ها به اثبات رسیده بود. برای مثال، مطالعه آیوکی و همکارانش نشان داد که چسب فیبرینی سبب تحریک رشد و تکثیر سلولی می‌گردد(40). در مطالعه‌ بن سعید و همکاران و لین و همکاران مشخص گردید که داربست فیبرینی سبب حفظ پتاسیل تکثیر و بقای سلول‌های بنیادی مغز استخوان می‌شود(41). هم چنین گروهی از مطالعه‌ها به نقش فیبرینوژن در تکثیر سلولی اشاره داشته­اند، به گونه­ای که دیده شده با افزایش استفاده از فیبرینوژن در داربست چسب فیبرینی، تکثیر سلولی به طور چشمگیری افزایش می­یابد (42). هم چنین برتری‌های فیبرین در مقایسه با سایر بیومتریال­های طبیعی برای استفاده در داربست­های ساخته شده برای کشت سلول­های مزانشیمی، مثال زدنی است(43). یافته­های گروهی از مطالعه‌ها بیانگر این است که توانایی زنده‌ماندن سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی به طور معناداری در داربست فیبرینی نسبت به گروه کنترل بیشتر است. دلیل این امر را می­توان به قابلیت کپسوله کردن یکنواخت سلول­ها توسط فیبرین نسبت داد (44). مطالعه گیراندون و همکاران نیز نشان داد که سلول‌های بنیادی مشتق از چربی قادر به تکثیر و بقا در داربست فیبرینی هستند(45). ژل فیبرینی نیز فرصت مناسبی را برای رشد سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی ایجاد می­نماید.  در پژوهش­های صورت گرفته در سال­های اخیر، چسب فیبرینی به عنوان کاندیدی مناسب جهت داربست طبیعی برای تمایز سلول‌های چربی معرفی شد. به طوری ­که کشت سلول‌های مزانشیمی مشتق از چربی در داربست چسب فیبرینی، سبب زنده ماندن طولانی مدت و افزایش بقای سلول­ها تا 84 روز گردید(40). در مطالعه­ای دیگر جانگ و همکارانش نشان دادند که درصد زنده‌مانی سلول­های مزانشیمی موش در داربست پلی لاکتیک اسید که دارای فیبرین و هیدروکسی آپاتیت بوده است، در روز اول به شدت کاهش یافته بود. این تیم تحقیقاتی بیان داشتند که با وجود سمیت بسیار بالای این داربست تلفیقی در روز اول، به تدریج سلول­ها در داربست تثبیت شده و کاهش در میزان سمیت سلولی این داربست از روز 17 قابل مشاهده بوده است(46). در مطالعه­ای نیز نشان داده شده که هیدروژل فیبرین به دست آمده از فیبرینوژن و ترومبین خون، از چرخه غضروف­زایی حمایت نموده وسبب  بهبود بقا، تکثیر و تمایز غضروف در شرایط آزمایشگاهی می‌گردد. به علاوه، این داربست توانایی ایجاد یک محیط مناسب جهت تمایز سلول­های بنیادی مزانشیمی به رده غضروفی را دارا می­باشد(47). نتایج حاصل از تحقیق حاضر با یافته­های این دسته از مطالعه‌ها همسو بوده و حاکی از تقویت قدرت رشد و تکثیر سلولی و افزایش بقای سلول­ها در داربست فیبرینی است. لازم به ذکر است که در اکثر مطالعه‌های قبلی، از فیبرین تجاری و تهیه شده از خون حیوانات استفاده شده ولی در این پژوهش از فیبرین با منشا انسانی جداسازی شده از FFP ، استفاده گردیـد کـه طـی روشی آسان و با هزینه بسیار اندک تهیه
می­شود.
    غشای فیبرینی از مهم‌ترین بیومتریال­های زیستی است که به دلیل دارا بودن خصوصیات فیزیکی، مکانیکی و بیولوژیکی مناسب به ویژه زیست سازگاری و تخریب‌پذیری زیستی بالا، ایمونوژنیسیتی کم، عدم سمیت سلولی و میل اتصالی بالا، کاربرد گسترده­ای در مهندسی بافت دارد(48، 8). با این وجود، استفاده از غشای فیبرینی به صورت آلوژن به دلیل وجود خطر انتقال بیماری­های ویروسی و باکتریایی مختلف توسط این بیومتریال بسیار محدود می­باشد(50، 49). شاید بتوان استریل کردن غشای فیبرینی را کلیدی­ترین راه‌کار برای رفع محدودیت­های کاربردی آن در مهندسی بافت دانست. نکته حائز اهمیت، پایداری و حفظ ویژگی­های این بیومتریال پس از فرآیندهای مختلف استریلیزاسیون است. بر اساس یافته‌های به دست آمده از مطالعه تجربی حاضر، استریلیزاسیون غشای فیبرینی با اشعه فرابنفش، اتوکلاو و اشعه گاما نه تنها برای سلول­های فیبروبلاستی کشت داده شده بر این غشا سمیت نداشته، بلکه خواص بیولوژیکی این غشا را از نظر تحریک رشد و تکثیر و افزایش بقای این سلول­ها حفظ نموده است.
    در مجمـوع مـی­توان نتیجـه گرفـت که تقویت قدرت
رشد و تکثیر سلولی از اصلی­ترین ویژگی­های غشای فیبرینی است و روش­های مختلف استریلیزاسیون(اشعه فرابنفش، اتوکلاو و اشعه گاما) قادر به تغییر آن­ها نمی‌باشند. یافته­های این پژوهش استفاده از روش­های استریلیزاسیون جهت کاهش خطرات احتمالی انتقال آلودگی­ها­ توسط غشای فیبرینی را در موارد استفاده به صورت آلوژن پیشنهاد می­نماید.
 
نتیجه‌گیری
    روش PCR-RFLP دارای حساسیت تشخیصی قابل مقایسه‌ای با روش‌های Real Time PCR و تعیین توالی بود. از دیگر مزایای این روش اصلاح شده می‌توان به توانایی آن در افتراق انواع هموزیگوت و هتروزیگوت بیماران، وجود کنترل داخلی برای عملکرد آنزیم و هم چنین سهولت و صرفه اقتصادی آن اشاره کرد. این روش اصلاح شده می‌تواند به عنوان یک روش مناسب و مقرون بـه صرفه برای اجرا در آزمایشگاه‌های تشخیص مولکولی 
پیشنهاد شود.
 
تشکر و قدردانی
    با تشکر از مرکز سلول‌های بنیادی دانشگاه علوم پزشکی کرمان که ما را در انجام این تحقیق یاری کردند.
ارسال پیام به نویسنده مسئول

ارسال نظر درباره این مقاله
نام کاربری یا پست الکترونیک شما:

CAPTCHA code


XML   English Abstract   Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Akbari Saeed T, Ahmadi ZeydAbadi M, Fatemi A, Farsinejad A. Gamma irradiation, an appropriate method for sterilization of the fibrin membrane while maintaining its biocompatibility characteristics. Sci J Iran Blood Transfus Organ. 2019; 15 (1) :36-46
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1098-fa.html

اکبری سعید طاهر، احمدی زیدآبادی میثم، فاطمی احمد، فارسی نژاد علیرضا. پرتودهی با اشعه گاما، شیوه‌ای مناسب جهت استریلیزاسیون غشای فیبرینی همراه با حفظ ویژگی‌های زیست سازگاری آن . فصلنامه پژوهشی خون . 1397; 15 (1) :36-46

URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1098-fa.html



جلد 15، شماره 1 - ( بهار 1397 ) برگشت به فهرست نسخه ها
فصلنامه پژوهشی خون Scientific Journal of Iran Blood Transfus Organ
The Scientific Journal of Iranian Blood Transfusion Organization - Copyright 2006 by IBTO
Persian site map - English site map - Created in 0.07 seconds with 32 queries by YEKTAWEB 3742