نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله: هماتولوژي انتشار: 1396/10/9
متن کامل: (2363 مشاهده)
روش اصلاح شده PCR-RFLP برای تشخیص جهش JAK2 V617F در بیماران مبتلا به نئوپلاسم‌های میلوپرولیفراتیو
علیرضا مرادآبادی1، علیرضا فارسی‌نژاد2، احمد فاطمی3
چکیده سابقه و هدف نئوپلاسم‌های میلوپرولیفراتیو، از جمله بدخیمی‌های خونی هستند که علایم بالینی بسیار متغیری دارند. تقسیم‌بندی بیماران میلوپرولیفراتیو به دو گروه دارای کروموزوم فیلادلفیا(Ph+) و فاقد آن(Ph-) میباشد. در گروه Ph- ، بیماریهای پلی‌سایتمی‌ورا، ترومبوسایتمی اساسی، میلوفیبروز اولیه و دیگر بیماریهای نادر قرار میگیرد. این گروه از بیماران دارای جهش JAK2 V617F میباشند که با درصدهای مختلف دیده میشود. هدف از این مطالعه، اجرای روش اصلاح شده PCR-RFLP برای تشخیص جهشJAK2 V617F در بیماران مبتلا به نئوپلاسم‌های میلوپرولیفراتیو بود. مواد و روش‌ها در این مطالعه مقطعی، 47 بیمار با درخواست آزمایش JAK2 V617F ، مورد بررسی قرار گرفتند. برای تمامی نمونهها آزمایشتشخیصی JAK2 V617F با استفاده از روش استاندارد ARMS TaqMan Probe انجام شد. جهت تایید نهایی، برخی از نمونهها مورد توالی‌یابی ژنی قرار گرفتند. برای شناسایی ناحیه جهش با استفاده از روش PCR-RFLP ، آغازگرهای اختصاصی و آنزیم BsaXI استفاده شد. با توجه به این که در این مطالعه نمونههای منفی و مثبت به همراه یک روش استاندارد برای تعیین جهش وجود داشت، محاسبه حساسیت و ویژگی این روش 100% تعیین گردید. تحلیل نتایج توسط آزمون t انجام شد. یافته‌ها نتایج PCR-RFLP جهش JAK2 V617F برای تمامی نمونهها کاملاً مشابه و منطبق با نتایج روشهای استانداردARMS TaqMan Probe و تعیین توالی بود. نتیجه گیری روش PCR-RFLP دارای حساسیت تشخیصی قابل مقایسهای با روشهای Real Time PCR و تعیین توالی بود. مزیت این روش اصلاح شده، توانایی آن در افتراق انواع هموزیگوت و هتروزیگوت بیماران، وجود کنترل داخلی برای عملکرد آنزیم و هم چنین سهولت و صرفه اقتصادی آن است. کلمات کلیدی:اختلالات میلوپرولیفراتیو، PCR ، نئوپلاسم، کروموزوم فیلادلفیا
تاریخ دریافت: 17/9 /95 تاریخ پذیرش: 16/7/96
1- دانشجوی کارشناسی ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمان، کمیته تحقیقات دانشجویی ـ کرمان ـ ایران 2- PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمان ـ کرمان ـ ایران 3- مؤلف مسئول: PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمان ـ کرمان ـ ایران ـ کدپستی: 7619794435
مقدمه نئوپلاسم‌های میلوپرولیفراتیو (MPNs)، از جمله بدخیمی‌های خونی هستند که در علایم بالینی بسیار متغیر میباشند. از جمله علایم مشترک این بیماریها، افزایش تمام ردههای سلول‌های خونی بوده و مهمترین ارگان خونساز در این بیماران، مغز استخوان است(1). بیماران میلوپرولیفراتیو بعد از شناسایی جابه جایی کروموزومی t(9;22) و کروموزوم فیلادلفیا(Ph)، به دو گروه دارای کروموزوم فیلادلفیا(Ph+) و فاقد آن(Ph-) تقسیم میشوند (2، 1). در بیماران فاقد کروموزوم فیلادلفیا (Ph-)، مهمترین اختلال ژنتیکی شناسایی شده جهش سوماتیک در اگزون شماره 14 ژن جانوس کیناز 2 (JAK2) میباشد. این جهش با جایگزینی نوکلئوتیدT به جای نوکلئوتید G در نقطه 1849(1849G>T) بوده و باعث تغییر کدون(GTC) به کدون(TTC) و در نتیجه تغییر اسید آمینه از والین به فنیل‌آلانین(V617F) میشود(3). پروتئین JAK2 یکی از مهمترین پروتئینهای دخیل در انتقال پیام میباشد که در انتقال پیام فاکتورهای رشد خونساز از قبیل اریتروپوئتین و ترومبوپوئتین نقش دارد. جهشJAK2 V617F در دومین سودوکینازی که نقش مهار کنندگی در فسفوریلاسیون و انتقال پیام این پروتئین دارد، رخ میدهد. در نتیجه، انتقال خود به خودی پیام در عدم حضور فاکتور رشد رخ داده و باعث پرولیفراسیون سلولها میشود. این جهش در بیماران MPN با شیوع بالا دیده میشود به طوری که در بیماران مبتلا به پلی‌سایتمی‌ورا (PV) این جهش در 65% تا 98% موارد، در بیماران با ترومبوسایتمی اساسی(ET) با شیوع 23% تا 57% و در بیماران مبتلا به میلوفیبروز اولیه(PMF) در حدود 35% تا 57% مشاهده میشود(7-3). این تفاوت در درصدهای مشاهده شده در بیماران به دلیل استفاده از آزمایش‌های مولکولی با حساسیتهای متفاوت میباشد و هم چنین در بسیاری از موارد، PMF نیز حاصل تغییر وضعیت بیماران پلی‌سایتمی‌ورا(PV) و تبدیل این بیماران به PMF است. استفاده از آزمایش‌هایی با حساسیت بالا باعث کاهش موارد منفی کاذب میشود در حالی که استفاده از روش‌هایـی بـا حساسیـت پاییـن نیـز باعث عدم تشخیص برخی موارد مثبت می‌گردد(8). هدف از مطالعه حاضر، ارائه یک روش تغییر یافته PCR-RFLP جهت تشخیص جهش JAK2 V617F در بیماران مبتلا به MPN بود که کاربرد اصلی آن تشخیص راحت‌تر و دقیق‌تر با استفاده از روش PCR-RFLP میباشد. در این روش اصلاح شده، سعی در کاهش خطاهای آزمایش از قبیل عملکرد آنزیم بوده که با استفاده از کنترل‌های داخلی این موارد بررسی شدند. مواد و روش‌ها بیماران: در این مطالعه توصیفی ـ مقطعی، 47 بیمار مراجعه‌کننده به کلینیک امام رضای اراک که توسط پزشک معالج برای آن‌ها درخواست آزمایش JAK2 V617F شده بود، مورد بـررسی قرار گرفتند. ابتدا نمونه خون بیماران در ضد انعقاد EDTA جمعآوری شده و سپس روی تمامی نمونهها آزمایشتشخیصیJAK2 V617F با استفاده از روش ARMS Taqman Probe (کیاژن، آلمان) انجام شد. جهت تایید نهایی، برخی از نمونهها مورد توالی‌یابی ژنی قرار گرفتند. در بین این نمونهها تعداد 23 نمونه جهش مثبت بآوده و مابقی نمونهها منفی بودند. این روش‌ها به عنوان روش استاندارد جهت شناسایی جهش JAK2 V617F مد نظر بودند.
استخراج DNA : DNA با استفاده از کیت کمپانی کیاژن(کیارژن، آلمان، Mini Kit)، از نمونههای خون کامل استخراج شد. تعیین غلظت DNA به وسیله دستگاه نانودراپ در طول مـوج 260 نانومتر انجام شد. جهت تعیین خلوص DNA ، نسبت جذب در طول موج260 نانومتر به 280 نانومتر (280/260 A) بـرای همـه نمونه‌هـای استخـراج شـده بـررسی گردید.
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR): تکثیر ژن JAK2 با استفاده از روش PCR انجام شد. آغازگرهای مورد استفاده برای تشخیص جهش JAK2 V617F عبارت بودند از:
شکل 1: نواحی برش آنزیم BsaXI و قطعات حاصل از هضم آنزیمی محصول PCR
5´-AGG ACT TTT CTG AGG ATA CA-3´ (آغازگر جلوبرنده) و 5´-ATA GTT TAC ACT GAC ACC TA-3´ (آغازگر معکوس). آغازگرها به گونه‌ای طراحی شدند که محصول PCR دارای طول bp1147 بوده و دارای دو ناحیه برش برای آنزیم BsaX1 (بیولب ـ انگلستان) میباشد؛ یک ناحیه برش مربوط به جهش JAK2 V617F و دیگری به عنوان کنترل داخلی هضم آنزیمی(اشکال 1 و 2).
واکنش هضم آنزیمی(RFLP): برای واکنش هضم آنزیمی بعد از تکثیر ناحیه مورد نظر، محصول PCR تحت هضم آنزیمی با BsaXI قرار گرفت. با توجه به حضور نواحی شکست آنزیم در محصول PCR ، قطعات مختلفی ایجاد میشود(شکل 2). در این روش با توجه به وجود یک ناحیه برش اضافی برای آنزیم، یک باند 140 نوکلئوتیدی به عنوان کنترل داخلی عملکرد آنزیم عمل نموده و بایستی در همه نمونهها حاضر باشد. در حالتی که نمونه دارای جهش باشد، ناحیه دوم شناسایی تغییر می‌کند که با حذف باند 130 نوکلئوتیدی همراه میشود. در این روش اصلاح شده به دلیل وجود دو ناحیه برش برای آنزیم، امکان افتراق حالـت‌های هموزیگوت و هتروزیگوت جهش وجود دارد.
الکتروفورز نمونههای هضم شده: الکتروفورز قطعات حاصل از هضم آنزیمی بر روی ژل آگاروز 3% و ژل پلی‌آکریل‌آمید انجام شد(شکل 3). شناسایی باندها در ژل آگارز با استفاده از رنگ SYBRSAFE (سیناژن) و در ژل پـلی‌اکریل آمیـد بـا استفـاده از رنگ‌آمیزی نقره صورت گرفت.
تحلیل آماری: با استفاده ازآزمونt نتایج تحقیق تجزیه و تحلیل شدند. 05/0 p≤ معنادار در نظر گرفته شد.
شکل 2: الکتروفورز محصول PCR بر روی ژل آگاروز 2% در کنار راهنمایی bp100
شکل 3: قطعات حاصل از هضم آنزیمی بر روی ژل آگاروز. 1: راهنمای bp 50 ، 2: نمونه منفی، 3 و4: نمونههای هتروزیگوت
شکل 4: قطعات حاصل از هضم آنزیمی بر روی ژل پلیآکریل آمید 1: راهنمای bp 100 ، 2 و 3: نمونههای منفی، 4: نمونه هتروزیگوت
یافته‌ها نتایج جهش JAK2 V617F بر روی 48 نمونه مورد بررسی به روش اصلاح شده PCR RFLP دقیقاً مشابه با نتایج روش استاندارد PCR REAL TIME بود. در این بررسی میزان p value حاصل بیش از 05/0 بوده که نشان از عدم اختلاف معنادار بین دو آزمایش میباشد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی صورت گرفته و بخشی از نمونه قبل از انجام هضم آنزیمی مورد الکتروفورز قرارگرفت(شکل 2). الکتروفورز نمونهها به روش اصلاح شده PCR RFLP انجام شد (شکل‌های 3 و 4). به علاوه روش اصلاح شده PCR-RFLP این توانایی را دارد که بین نمونههای هموزیگوت و هتروزیگوت برای جهش نیز افتراق ایجاد کند.
بحث هدف از مطالعه حاضر بررسی روش اصلاح شده PCR-RFLP جهت تشخیص جهش JAK2 V617F در مقایسه با روش Real Time و تعیین توالی بود. هنگ کوکائو و همکارانش روشهای مختلفی را جهت شناسایی جهش JAK2 V617F مورد مقایسه قرار داده و روش PCR-RFLP را به عنوان روش قطعی و مناسب برای تشخیص این جهش معرفی کردند. در این مطالعه روش‌هایی از قبیل ARMS PCR و دیگر روشهای مولکولی برای شناسایی جهش استفاده شده و تعیین توالی به عنوان روش مرجع انتخاب شد. در مطالعه حاضر روش اصلاح شده PCR RFLP توانست حضور جهش را به اندازه روش تعیین توالی تشخیص دهد(9). در مطالعه دیگری که توسط زی کینگ و همکارانش برای شناسایی جهش JAK2 V617F ارایه شد، روش PCR RFLP به عنوان یک روش مرجع برای تایید سایر روش‌ها مطرح گردید. آن‌ها PCR RFLP را به عنوان روشی مناسب اما وابسته به اپراتور برای شناسایی این جهش معرفی کرده‌اند(8). در این مطالعه نیز روش PCR RFLP دارای حساسیت تشخیصی قابل مقایسهای با روشهای Real Time PCR و تعیین توالی بود. مزیت دیگر این روش وجود کنترل داخلی برای تایید عملکرد آنزیم و هم چنین ارزان و مقرون به صرفه بودن آن نسبت به روش تعیین توالی و سایر روش‌ها است. در مطالعه‌ای که توسط آمی‌جونز و همکارانش جهت بررسی انواع روشهای شناسایی جهش JAK2 V617F انجام شد، روش‌هایی مانند ARMS PCR را به عنوان روش‌هایی با صرفه اقتصادی و مناسب جهت بررسی دقیق وجود جهش معرفی کردند (10).
نتیجه‌گیری روش PCR-RFLP دارای حساسیت تشخیصی قابل مقایسهای با روشهای Real Time PCR و تعیین توالی بود. از دیگر مزایای این روش اصلاح شده می‌توان به توانایی آن در افتراق انواع هموزیگوت و هتروزیگوت بیماران، وجود کنترل داخلی برای عملکرد آنزیم و هم چنین سهولت و صرفه اقتصادی آن اشاره کرد. این روش اصلاح شده می‌تواند به عنوان یک روش مناسب و مقرون بـه صرفه برای اجرا در آزمایشگاه‌های تشخیص مولکولی پیشنهاد شود.
تشکر و قدردانی با تشکر از مرکز سلول‌های بنیادی دانشگاه علوم
پزشکی کرمان که ما را در انجام این تحقیق یاری کردند.
Moradabadi A, Farsinejad A, Fatemi A. Modified PCR-RFLP for detection of JAK2V617F mutation in patients with myeloproliferative neoplasm. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2017; 14 (4) :289-294 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1093-fa.html
مرادآبادی علیرضا، فارسی نژاد علیرضا، فاطمی احمد. روش اصلاح شده PCR-RFLP برای تشخیص جهش JAK2 V617F در بیماران مبتلا به نئوپلاسم‌های میلوپرولیفراتیو. فصلنامه پژوهشی خون. 1396; 14 (4) :289-294
