چکیده سابقه و هدف آلودگی باکتریایی فرآورده‌های خونی، به عنوان یکی از مهمترین موانع عدم دستیابی به خطر صفر در طب انتقال خون، مطرح می‌باشد. با وجود پیشرفت‌های صورت گرفته؛ عفونت‌های میکروبی ناشی از تزریق پلاکت در مقایسه با تزریق سایر فرآورده‌های خون بیشتر خطرساز است. در این تحقیق میزان آلودگی باکتریایی پلاکت متراکم تولید شده در پایگاه انتقال خون تهران با استفاده از روش‌های کشت میکروبی بررسی گردید. مواد و روش‌ها در مطالعه مقطعی حاضر، 1500 نمونه پلاکت متراکم به صورت تصادفی جمع‌آوری گردید. این نمونه‌ها در زمان‌های مختلف ذخیره‌سازی، بررسی شدند. بعد از گرماگذاری، نمونه به دست آمده خالص‌سازی و خصوصیات آن بررسی شد. از کیت (API) 20 EAnalytical Profile Index برای شناسایی سویه جدا شده استفاده شد. نتایج در 18 SPSS و Excel 2010 خلاصه و جمع‌آوری گردید. هم چنین الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی سویه جدا شده به روش دیسک دیفیوژن ارزیابی گردید. یافته‌ها از بین 1500 نمونه پلاکت متراکم کشت داده شده، یک مورد (07/0%) به عنوان نمونه آلوده تشخیص داده شد. این نمونه در آخرین روز ذخیره‌سازی تهیه شده بود. با توجه به نتایج به دست آمده، باکتری جدا شده سودوموناس آئروژینوزا تشخیص داده شد. بررسی نتایج معاینه پیش از اهدا، سابقه‌ای مبنی بر وجود باکتریمی در اهداکننده را رد کرد. نتیجه گیری نتایج به دست آمده می‌تواند بیان کننده آلودگی محیطی در طول فرآیند جمع‌آوری، تهیه و ذخیره‌سازی پلاکت متراکم باشد. بهینه‌سازی روش‌های ضد عفونی محیطی و رعایت استانداردهای کاری می‌تواند در کاهش شیوع آلودگی باکتریایی در فرآورده‌های خون موثر باشد. کلمات کلیدی:پلاکت‌ها، باکتری، انتقال خون
تاریخ دریافت: 30/4/96 تاریخ پذیرش: 9/2 /96
1- کارشناس ارشد بیوتکنولوژی میکروبی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- دانشجوی دکترای تخصصی باکتری‌شناسی پزشکی ـ مرکز تحقیقات میکروبیولوژی ـ انستیتو پاستور ایران ـ تهران ـ ایران 3- دکترای تخصصی باکتری شناسی پزشکی ـ استاد مرکز تحقیقات میکروبیولوژی ـ انستیتو پاستور ایران ـ تهران ـ ایران 4- مؤلف مسئول: متخصص بیماری‌های عفونی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه تزریق خون و فرآورده‌های آن یکی از روش‌های مهم برای درمان بیماران محسوب می‌شود. استفاده از روش‌های دقیق غربالگری آزمایشگاهی و هم چنین تهیه فرآورده‌های خون از اهداکنندگان داوطلب و بدون چشم داشت مالی، آموزش دیده و مستمر منجر به فراهم‌آوری سطح بالایی از سلامت برای فرآورده‌های تولید شده در انتقال خون شده است(4-1). با وجود تمام پیشرفت‌های چشمگیری که در طب انتقال خون صورت گرفته است ولی آلودگی باکتریایی فرآورده‌های خون هم چنان به عنوان یکی از مهمترین موانع عدم دستیابی به "خطر صفر" در طب انتقال خون مطرح می‌باشد(5). تفاوت اساسی میان آلودگی به وسیله ویروس‌ها و آلودگی باکتریایی این است که آلودگی باکتریایی می‌تواند به راحتی در طول مدت ذخیره‌سازی و با توجه به شرایط نگهداری افزایش یابد. به عنوان مثال؛ تحت شرایط معمول نگهداری و ذخیره‌سازی پلاکت در کیسه‌های نفوذپذیر به هوا و حرکت مداوم در دمای 20 تا 24 درجه سانتی‌گراد، حتی یک مقدار ناچیز از باکتری می‌تواند به مقدار خیلی زیادی افزایش پیدا کرده و به سطحی برسد که از نظر بالینی بسیار خطرناک باشد. نحوه ذخیره‌سازی پلاکت متراکم، این محصول را به یک محیط کشت مناسب برای رشد طیف وسیعی از میکروارگانیسم‌ها تبدیل کرده است(8-6). درسال 2004 طبق استاندارد تعیین شده از سوی انجمن انتقال خون ایالات متحده، مراکز انتقال خون موظف هستند که به صورت مداوم محصولات تولیدی خود را از لحاظ وجود آلودگی باکتریال با روش‌های تشخیصی تایید شده مورد ارزیابی قرار دهند(1). روش‌های متعددی جهت کاهش خطر عفونت میکروبی ناشی از انتقال خون در دسترس قرار دارند. از جمله این روش‌ها می‌توان به مواردی هم چون انتخاب صحیح و دقیق اهداکننده، انتخاب صحیح و دقیق محل خونگیری، استفاده از یک روش مؤثر استریل کردن محل خونگیری، جداسازی حجم مناسبی از خون اولیه به وسیله کیسه‌های جانبی و هم چنین،مشاهده و ارزیابی مـداوم سیستم سیستمفرآینـدهای مرتبـط با تهیـه و تولیـد فــرآورده‌ها و بررسی شرایط ظاهری کیسه اشاره کرد(10، 9). در حال حاضر نتایج حاصل از روش‌های مبتنی بر کشت به عنوان استاندارد طلایی جهت تشخیص آلودگی باکتریال خون و فرآورده‌های آن مورد استفاده قرار می‌گیرد(11). ولی با این حال این روش‌ها همواره با مفهوم "منفی تا تاریخ کشت" (Negative to Date) همراه بوده‌اند(14-12). این موضوع یکی از مهمترین چالش‌ها در استفاده از روش‌های مبتنی بر کشت جهت تشخیص آلودگی باکتریایی کنسانتره پلاکت می‌باشد. با توجه به اهمیت موضوع و دسترسی سریع به نتایج مورد انتظار، روش‌های دیگری نیز در طول این مدت برای بررسی آلودگی باکتریایی خون و فرآورده‌های آن مورد استفاده قرار گرفته‌اند. از جمله این روش‌ها می‌توان به روش‌های مولکولی و تکثیر توالی اسید نوکلئیک اشاره نمود(16، 15). استفاده از این روش‌ها می‌تواند نقش مهمی در تشخیص و شناسایی آلودگی باکتریایی خون و فرآورده‌های خونی در زمان تزریق داشته باشد. در ایران بیش از 95% پلاکت متراکم تولید شده از اهداکنندگان تصادفی می‌باشد که از پلاسمای غنی از پلاکت مشتق از خون کامل تهیه می‌شود و تنها درصد جزئی از پلاکت مورد نیاز به صورت آفرزیس تولید می‌گردد. در سازمان انتقال خون ایران طی 10 سال گذشته مطالعه‌های مختلفی جهت تشخیص آلودگی باکتریایی و مقایسه روش‌های مختلف صورت گرفته است(18، 17، 14). با توجه به نگاه ویژه سازمان انتقال خون ایران به مقوله ارتقا کیفیت و سلامت فرآورده‌های خون تولیدی در کنار افزایش سایر شاخص‌ها و هم چنین مدیریت خون بیمار و برنامه‌ریزی جهت دسترسی به اهداکنندگان سالم و مستمر، استفاده از روش‌های تشخیصی دقیق جهت بررسی وجود آلودگی باکتریال در خون و فرآورده‌های خونی جزو ضروریات دستیابی به این اهداف می‌باشد. هدف از این مطالعه، بررسی میزان فراوانی آلودگی باکتریایی کنسانتره پلاکت تولید شده در پایگاه‌های انتقال خون تهران با استفاده از روش‌های روتین کشت بود. مواد و روش‌ها مطالعه حاضر یک مطالعه توصیفی از نوع مقطعی و شیوه نمونه‌گیری از نوع در دسترس و آسان بود. با توجه به شناخت از جامعه و با استفاده از داده‌های مطالعه‌های قبلی، تعداد 1500 نمونه پلاکت که با روش جداسازی پلاسمای غنی از پلاکت مشتق از خون کامل از اهداکنندگان تصادفی تهیه شده بودند، جمع‌آوری گردید. نمونه‌های مورد استفاده در فاصله زمانی اردیبهشت تا مهر ماه سال 1394 از پایگاه انتقال خون تهران تهیه شدند. کلیه اهداکنندگان در این مطالعه پیش از اهدا پرسشنامه‌ای را مطابق با روش‌های اجرایی استاندارد انتخاب اهداکننده تکمیل کرده و مورد مصاحبه و معاینه پزشکی قرار گرفته بودند. اهداکنندگانی که شرایط اهدای پلاکت را داشتند، طبق استانداردهای انتقال خون ایران خونگیری شدند. برای شناسایی عوامل بیماری‌زا، کلیه نمونه‌های جمع‌آوری شده از نظر آزمایش‌های HIV ، HBV و HCV توسط آزمایشگاه الایزا (بایومریوکس و Davubcu) پایگاه انتقال خون تهران مورد بررسی قرار گرفتند و نتایج آزمایش‌های غربالگری الایزا شامل آنتی‌ژن هپاتیت B(HBs Ag) و آنتی‌بادی هپاتیت C(HCV-Ab) و آنتی‌ژن- آنتی‌بادی HIV (Ag-Ab HIV) منفی بود. نمونه‌برداری در روزهای صفر، اول، دوم و سوم انجام گرفت. کلیه مراحل در این روش طبق استانداردهای اجرایی سازمان انتقال خون ایران انجام شد. در این مرحله جهت بررسی وجود آلودگی باکتریایی در محصول پلاکت متراکم که در روزهای مختلف تولید و نگهداری بودند؛ نمونه‌گیری با استفاده از کورد متصل به کیسه پلاکت انجام شد(19، 17). فرآورده‌های پلاکت متراکم در شیکر انکوباتور بخش فرآورده پایگاه تهران نگهداری می‌شدند. پس از فرآوری محصول پلاکتی در واحد فرآورده پایگاه انتقال خون تهران با استفاده از سانتریفیوژ خون کامل با دور سبک، ابتدا پلاسمای غنی از پلاکت از گلبول‌های قرمز جدا شده و سپس در سانتریفیوژ مرحله دوم با دور سنگین، سلول‌های پلاکتی جدا گردیدند. کورد متصل به کیسه پلاکت خالی باقی گذاشته شد و در زمان جمع‌آوری نمونه، کورد به وسیله رولر با محتویات داخل کیسه پلاکت یکنواخت و سپس از کیسه پلاکت جدا گردید. مشخصات کیسه پلاکت با استفاده از شماره بارکد به همراه نمونه جهت پیگیری‌های بعدی یادداشت شد. نمونه‌های جمع‌آوری شده بلافاصله و با حفظ شرایط استریل به زیر هود میکروبی که از قبل استریل شده بود انتقال یافته و به وسیله ماده ضد عفونی کننده(Huwa-san ، بلژیک) کاملاً استریل گردیدند. پس از انجام فرآیند استریلیزاسیون با استفاده از سرنگ یک بار مصرف استریل (سرنگ 5 میلی‌لیتر دو تکه، یزد سرنگ، ایران) یک میلی‌لیتر از نمونه پلاکتی به محیط کشت مایع تلقیح شد. یک میلی‌لیتر از نمونه مورد نظر جهت انجام آزمایش‌های بعدی به کرایوتیوپ‌های استریل منتقل و در فریزر 70- درجه سانتی‌گراد(فرانسه، ژوان) نگهداری شد. فرآیند کشت در دو مرحله، کشت اولیه در محیط مایع تایوگلیکولات(آلمان، مرک) و کشت ثانویه در محیط جامد بلاد آگار(آلمان، مرک)، به صورت هوازی و بی‌هوازی صورت گرفت. برای انجام این مرحله یک میلی‌لیتر از نمونه کنسانتره پلاکت تهیه شده در شرایط کاملاً استریل(زیر هود میکروبی و در مجاورت دو شعله) به 10 میلی‌لیتر محیط کشت مایع تلقیح و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد(آلمان، ممرت) گرماگذاری گردید. لوله‌ها در طول مدت زمان گرماگذاری به صورت روزانه از لحاظ کدورت و تغییر رنگ بررسی شدند. بعد از کنترل روزانه و بررسی محیط پس از گذشت 7 روز از زمان گرماگذاری، از نمونه‌های محیط مایع مورد نظر کشت ثانویه بر روی محیط بلاد آگار به صورت هوازی و بی‌هوازی جهت دسترسی به کلنی تک و شناسایی عامل باکتریایی انجام شد. پلیت‌ها بعد از 48 ساعت از لحاظ رشد کلنی بررسی شدند. با توجه به حساسیت و نیاز به دقت کافی و به منظور حفظ شرایط استاندارد در اجرای طرح، کلیه مراحل توسط مجریان طرح و منطبق با روش اجرایی شرح داده شده، صورت گرفت. نمـونـه مثبـت جـدا شده جهت شناسایی دقیق جنس و گونه باکتری، در شرایط کاملاً استریل(زیر هود میکروبی و در مجـاورت دو شعلـه) مجـدداً بر روی محیط کشت بلاد آگـار بـه صـورت چهـار منطقه‌ای، کشت خطی داده شد و پلیت‌ها جهت رشد، در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت گرماگذاری شدند. پس از مدت زمان 24 ساعت و با ظاهر شدن و رشد کلنی‌ها در محیط کشت، تک کلنی‌ها برای به دست آوردن مقدار مناسبی از کلنی خالص مجدداً بر روی محیط بلاد آگار کشت داده شدند. سپس نمونه خالص‌سازی شده در محیط تریپتیک سوی براث (آلمان، مرک) حاوی 18% گلیسرول کشت داده شد و جهت شناسایی و انجام آزمایش‌های آتی در فریزر و دمای 70- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. کلنی خالص به دست آمده مورد آزمون‌های رنگ‌آمیزی گرم، آزمایش کاتالاز و اکسیداز و بررسی‌های مورفولوژیک در زیر میکروسکوپ قرار گرفت. پس از اطمینان از گرم منفی بودن و کاتالاز و اکسیداز مثبت سویه مورد نظر، خصوصیات مورفولوژیک سلولی در زیر میکروسکوپ بررسی شد و باسیل بودن آن تایید گردید. با توجه به نتایج به دست آمده شناسایی اولیه بر اساس آزمایش رشد در دمای 42 درجه سانتی‌گراد، بررسی حرکت در محیط SIM (Solfide, Indole, Motility medium)، بررسی رشد در TSI (Triple Sugar Iron Agar medium)، تولید رنگ دانه و بوی خاص صورت گرفت. جهت تعیین هویت سویه جدا شده با انجام آزمون‌های بیوشیمیایی افتراقی، علاوه بر آزمایش‌های لوله‌ای شامل آزمایش‌های ایندول، TSI، SIM ، سیترات، از کیت API 20 E (فرانسه، بیومریوکس) نیز استفاده گردید. برای این منظور از سویه مورد نظر در سرم فیزیولوژی 9/0% استریل سوسپانسیون میکروبی تهیه و سپس با استفاده از پیپت پاستور استریل در حفره‌های کیت که حاوی ترکیبات و قندهای لیوفلیزه می‌باشند اضافه و طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت، سایر مراحل بعدی انجام گردید. بعد از 24 ساعت گرماگذاری در 37 درجه سانتی‌گراد، کد 7 رقمی حاصل از نتایج ثبت و سپس این کد وارد نرم‌افزار اختصاصی apiweb (فرانسه، بیومریوکس) شد و نام ارگانیسم ثبت گردید. بر اساس نتایج آزمایش‌های بیوشیمیایی و افتراقی انجام گرفته و بر اساس طبقه‌بندی ارائـه شـده در کتـاب بـرگی، سویه جدا شده تا حد امکان تعیین هویت شد. الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی سویه به دست آمده به روش انتشار از دیسک کربی بائر بر روی محیط مولر هینتون آگار(آلمان، مرک) طبق دستورالعمل پیشنهادی سازمان استانداردهای بالینی و آزمایشگاهی (CLSI) مورد بررسی قرار گرفت. در این روش سوسپانسیون میکروبی با غلظت نیم مک فارلند تهیه شد. برای هر سری آزمایش، کشت تازه 24 ساعته تهیه گردید. سپس یک لوپ از سویه در سرم فیزیولوژی استریل تلقیح شد. جذب نوری سوسپانسیون میکروبی با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 620 نانومتر، 1– 8/0 تنظیم گردید. سپس این سوسپانسیون میکروبی برای تلقیح در محیط کشت مولر هینتون آگار استفاده گردید. طی این مرحله سوسپانسیون میکروبی استاندارد شده در محیط مولر هینتون آگار با استفاده از سواپ پنبه‌ای استریل به صورت چمنی کشت داده شد. 15 دقیقه پس از پخش کردن کامل سوسپانسیون میکروبی بر روی محیط کشت و خشک شدن محیط دیسک‌های آنتی‌بیوتیک(انگلستان، مست دیسک) به فاصله حداقل 5/2 سانتی‌متر از لبه پلیت و یکدیگر بر روی محیط قرار داده شد. سپس محیط کشت به مدت 24 ساعت در دمای 42 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. در ادامه با استفاده از خط کش مخصوص، هاله عدم رشد اطراف هر دیسک اندازه‌گیری و طبق دستورالعمل شرکت سازنده سویه مورد نظر به صورت مقاوم، نیمه حساس و حساس گزارش گردید. از سویه سودوموناس آئروژینوزا 27853 ATCC به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. آنتی‌بیوتیک‌های مورد استفاده شامل دیسک‌های ایمی پنم (10 میکروگرم)، سیپروفلوکساسین(5 میکروگرم)، جنتامایسین(10 میکروگرم)، سفوتاکسیم(30 میکروگرم)، سفتازیدیم(30 میکروگرم)، سیفیپیم(30 میکروگرم)، ارتاپنم (10 میکروگرم) و مروپنم(10 میکروگرم) بودند. شیوع با استفاده از روش‌های آماری توصیفی در نرم‌افزار SPSS ورژن 18 به دست آمد. گزارش تمام شماره‌های اهدا به دسـت آمـد و نتایـج حاصـل در نـرم‌افـــزار Excel 2010 خلاصه و جمع‌آوری گردید. یافته‌ها یافته‌های حاصل از آزمایش‌های انجام گرفته بر روی 1500 نمونه پلاکت متراکم جمع‌آوری شده نشان داد که تنها یک مورد(07/0%) از مجموع نمونه‌ها به عنوان نمونه آلوده تشخیص داده شد. نمونه جداسازی شده بعد از کشـت در محیط‌های افتراقی و بررسی‌های مورفولوژیک و
خصوصیات باکتری در لام رنگ‌آمیزی شده به طریقه گرم به عنوان باسیل گرم منفی سودوموناس آئروژینوزا تشخیص داده شد. با استفاده از کیت API 20 E (فرانسه، بایومریوکس) نیز جنس و گونه نمونه جدا شده را به عنوان باسیل گرم منفی سودوموناس آئروژینوزا تایید کرد(جدول 1)(شکل 1).
جدول 1: خصوصیات فنوتیپی و آزمایش‌های تشخیصی بیوشیمیایی سویه باکتری جدا شده
خصوصیات فنوتیپی و آزمایش‌های تشخیصی بیوشیمیایی
آزمایش
ویژگی
نتایج
شکل
میله‌ای(باسیل)
خصوصیات فنوتیپی
مورفولوژی کلونی
گرد، برآمده، با حاشیه های نامنظم، براق با قطر 2 تا 4 میلی متر، تولید بوی خاص
رشد بر روی بلاد آگار
+
رشد بر روی محیط مکانکی
+
رشد در دمای 42 درجه سانتی گراد
+
رنگ آمیزی گرم
-
تولید رنگدانه
+
آزمایش‌های تشخیصی بیوشیمیایی (آزمایش‌های لوله‌ای)
حرکت
+
اکسیداز
+
کاتالاز
+
ایندول
-
تست هیدروکسید پتاسیم 3 درصد
محلول آبکی موکوئیدی
سیترات
+
TSI
قلیایی/قلیایی
APl 20 E
ONPG
-
ADH
+
LDC
-
ODC
-
CIT
+
H2S
-
URE
-
TDA
-
IND
-
VP
-
GEL
+
GLU
-
MAN
-
INO
-
SOR
-
RAH
-
SAC
-
MEL
-
AMY
-
ARA
-
ONPG (اورتو- نیترو فنیل-بتا-گالاکتوزیداز)؛ ADH (آمینو اسید دکربوکسیلاسیون)؛ LDC (لایزین دکربوکسیلاز)؛ ODC (اورنیتین دکربوکسیلاز)؛ CIT (سیترات)؛ H2S (سولفید هیدروژن)؛ URE (اوره)؛ TDA (تریپتوفان دآمیناز)؛ IND (ایندول)؛ VP (ووگس پروسکوئر)؛ GEL (ژلاتیناز)؛ GLU (گلوکز)؛ MAN (مانیتول)؛ INO (اینوزیتول)؛ SOR (سوربیتول)؛ RAH (رامنوز)؛ SAC (سوکروز)؛ MEL (ملیبیوز)؛ AMY (آمیگدالین)؛ ARA (آرابینوز)
شکل 1: نتایج حاصل از نوار تشخیصی API 20E پس از تلقیح نمونه و گرماگذاری جدول 2: الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی سویه جدا شده نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مورد استفاده
ردیف
نام آنتی‌بیوتیک
الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی
علامت اختصاری
غلظت (µg/disc)
قطر هاله
حساس
نیمه حساس
مقاوم
1
ایمی پنم
IMI
10
25
√
--
--
2
آمیکاسین
AN
30
30
√
--
--
3
کلستین
CL
10
16
√
--
--
4
مروپنم
MEM
10
27
√
--
--
5
ارتاپنم
ETP
10
25
√
--
--
6
آزترئونام
ATM
30
20
√
--
--
7
سفتازیدیم
CAZ
30
25
√
--
--
8
سفپیم
CPM
30
30
√
--
--
9
سیپروفلوکساسین
CIP
5
30
√
--
--
10
پیپراسیلین
PRL
100
30
√
--
--
11
سفوتاکسیم
CTX
30
23
√
--
--
12
جنتامایسین
GM
10
25
√
--
--
با بررسی‌های انجام شده و با توجه به شماره نمونه جدا شده، مشخص گردید که نمونه مورد نظر در روز سوم (با احتساب روز تولید صفر) از پلاکت متراکم تهیه شده است. هم چنین با مرور اطلاعات رایانه‌ای اهداکننده و بررسی دقیق نتایج حاصل از معاینه پزشکی پیش از اهدای خون، مشخص گردید که اهداکننده مورد نظر هیچ نوع سابقه و علامتی مبنی بر وجود باکتریمی مخفی ندارد. اهداکننده مذکر، متاهل، دارای سطح تحصیلات دیپلم و اهداکننده مستمر بود. اهداکننده شرایط شغلی خاصی نداشته و هیچ گونه علامتی مبنی بر خستگی، ضعف، بیحالی و یا اضطراب در زمان اهدا نداشته است. با بررسی پرسشنامه و معاینه قبل از اهدا، عدم سابقه بستری در بیمارستان و یا اندوسکوپی و داشتن اعمال جراحی و دندانپزشکی و عدم مصرف داروهای خاص برای اهداکننده مشخص گردید. دمای بدن اهداکننده نیز در زمان اهدا 37 درجه سانتی‌گراد ثبت شد. بر همین اساس و سایر نتایج به دست آمده از مطالعه پرسشنامه اطلاعات پزشکی قبل از اهدا، نتیجه معاینه به صورت سالم گزارش شده است. بر اساس نتایج حاصل از آنتی‌بیوگرام برای سویه جدا شده، الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی آن نیز مشخص شد(جدول 2).
بحث در این مطالعه از بین 1500 نمونه پلاکت متراکم کشت داده شده، یک مورد به عنوان نمونه آلوده تشخیص داده شد. این نمونه در روز سوم (با احتساب روز تولید صفر) ذخیره‌سازی از پلاکت متراکم تهیه شده بود. بررسی‌های آزمایشگاهی صورت گرفته، باکتری جدا شده را سودوموناس آئروژینوزا تشخیص داد. نتایج حاصل از بررسی استریلیتی محیط‌های کاری مرتبط با تولید محصول کنسانتره پلاکت در طول مدت زمان انجام تحقیق از لحاظ وجود آلودگی باکتریال منفی نبوده است. بنابراین می‌توان گفت که نتایج حاصل از ارزیابی استریلیتی محیط‌های کاری و مرور اطلاعات رایانه‌ای اهداکننده و بررسی نتایج معاینه پیش از اهدا، مشخص گردید که هیچ نوع سابقه‌ای مبنی بر وجود باکتریمی در اهداکننده وجود نداشته استو نتایج حاصل از معاینه پزشکی اهداکننده قبل از اهدا، وضعیت اهداکننده را سالم گزارش کرده است. در آخرین مطالعه‌ای که در ایران جهت بررسی آلودگی باکتریایی کنسانتره پلاکت در سال 1384 صورت گرفت، از 7700 نمونه پلاکتی مورد بررسی، 14 مورد آلوده تشخیص داده شد. در این مطالعه سویه‌های استافیلوکوک اپیدرمیس، استافیلوکوک ساپروفیتیکوس، آسینه توباکتر و باسیلوس جداسازی شدند(17). یافته‌های این تحقیق در مقایسه با تحقیق مشابه صورت گرفته در سال 1384 نشانگر تفاوت معنادار و ارزشمندی در کاهش شیوع آلودگی باکتریایی در کنسانتره پلاکتتولید شده می‌باشد. این در صورتی است که تخمین‌های ارائه شده در مقالات مختلف میزان شیوع آلودگی در پلاکت را 1 در 2000 تا 3000 واحد پلاکتی عنوان کرده‌اند که این موضوع بیان‌کننده دستیابی سازمان انتقال خون ایران به استانداردهای کیفی و کمی در سطح بین‌المللی می‌باشد(20). استفاده از کیسه‌های خونگیری همراه با کیسه نمونه‌گیری(sampling pouch) جهت حذف حجم 15 تا 30 میلی‌لیتر ابتدایی خون جمع‌آوری شده، ارتقا فرآیندهای مختلف مرتبط با تولید محصول و هم چنین رعایت استانداردهای تولید محصول منطبق با اصول (Good manufacturing Practice) GMP و تاکید بر نظام مراقبت از خون و مراقبت از اهداکننده و هم چنین برگزاری دوره‌های آموزشی مختلف جهت اجرای هر چه بهتر استانداردها را می‌تـوان از جملـه مهم‌تریـن دلایـل این کاهش در آلودگی باکتـریال کنسـانتره پـلاکت در ایـن مطالعـه بیـان کرد (24-21، 19، 18، 14). مطالعه‌های صورت گرفته مهمترین میکروارگانیسم‌هایی که باعث ایجاد آلودگی باکتریایی در کنسانتره پلاکت می‌گردند را گونه‌های استافیلوکوک(42%)، اشرشیاکولی(9%)، باسیلوس(9%)، سالمونلا(9%)، استرپتوکوک(12%)، سراشیا(8%)، انتروباکترها(7%) و سایر میکروارگانیسم‌ها(4%) بیان کرده‌اند. همان طور که مشخص است، حدود 56% این موارد سویه‌های گرم مثبت و هوازی هستند که مهمترین منبع ایجاد آلودگی می‌تواند فلور پوست بازوی اهداکننده و عدم رعایت استانداردهای لازم برای ضد عفونی بازو باشد. بروز شوک سپتیک به وسیله باکتری‌های گرم منفی نیز گزارش شده است که می‌تواند بسیار کشنده‌تر از عفونت با باکتری‌های گرم مثبت باشد. مهمترین منابع ورود باکتری‌های گرم منفی به خون و فرآورده‌های خون می‌تواند باکتریمی نهفته اهداکننده و گاه حتی کلونیزاسیون پوست اهداکننده یا خونگیر و یا آلودگی محیطی باشد که در نهایت می‌تواند در هر یک از مراحل جمع‌آوری، تهیه و ذخیره‌سازی و نگهداری، فرآورده را آلوده نماید. به عنوان مثال در یک مطالعه صورت گرفته مشخص گردید وجود سودوموناس سپاسیا در محلول ضدعفونی کننده بازوی اهداکننده، باعث ورود عامل عفونی به محصول خونی و در نهایت ایجاد شوک سپتیک در دریافت کننده شده است(29-25). خون و فرآورده‌های خونی که برای تزریق آماده می‌شوند می‌توانند در هر یک از مراحل تولید تا مصرف، دچار آلودگی باکتریایی گردند. به کارگیری روش‌هایی از قبیل رعایت استانداردهای انتخاب اهداکننده واجد شرایط، بهینه‌سازی روش‌های ضدعفونی بازوی اهداکننده، اتخاذ روش‌های مختلف ضد عفونی محیط‌های کاری مرتبط با تولید محصول، حذف حجم ابتدایی خون اهدایی، به کارگیری روش‌های غربالگری میکروبی برای پلاکت‌ها و غیر فعال‌سازی عوامل پاتوژن از جمله روش‌هایی هستند که نقش اساسی در کاهش شیوع آلودگی باکتریایی در خون و فرآورده‌های خون دارند(31، 30). تمامی این اقدامات و سیاست‌های احتیاطی عنوان شده، در حال حاضر در تمامی مراکز انتقال خون در حال اجرا می‌باشند(32). از زمان معرفی سیستم بسته برای تهیه خون و فرآورده‌های خون(از رگ اهداکننده تا رگ گیرنده) تاکنون اقدامات مناسبی جهت حفظ سلامت و کیفیت خون و فرآورده‌های خون صورت گرفته است(27). دو عامل مهم باعث شده است که کنسانتره پلاکت به عنوان محیطی مناسب برای رشد باکتری‌های مختلف مطرح شود. اولین عامل، شرایط نگهداری و ذخیره‌سازی در کیسه‌های نفوذپذیر به گاز در دمای 20 تا 24 درجه سانتی‌گراد و دومین عامل فراهم‌آوری نیازهای غذایی و زیستی میکروارگانیسم‌های آلوده‌کننده در ترکیبات تشکیل دهنده این محصول می‌باشد(34، 33). طبق استانداردهای انتقال خون، مراکز انتقال خون موظف هستند که به صورت مداوم محصولات تولیدی خود را از لحاظ وجود آلودگی باکتریایی با روش‌های تشخیصی تایید شده مورد ارزیابی قرار دهند. در حال حاضر نتایج حاصل از روش‌های مبتنی بر کشت به عنوان استاندارد طلایی جهت بررسی آلودگی باکتریال خون و فرآورده‌های آن مورد استفاده قرار می‌گیرد(11). در ایران تنها روش کنترل کیفی، محصولات از نظر کشت میکروبی به کار گرفته می‌شود و غربالگری پلاکتی جزء استانداردهای ایران قرار ندارد. در کشورهای پیشرفته استفاده از غربالگری پلاکت‌ها بر پایه روش‌های کشت از قبیل BacT/Alert مورد تایید قرار گرفته است، ولی با این حال روش‌های بر پایه کشت همواره با مفهوم منفی تا تاریخ کشت (Negative to Date) همراه هستند(14). بدین معنی که نتایج کشت منفی تا روز نمونه‌گیری قابل اتکا می‌باشد و احتمال کشف آلودگی در روزهای باقی‌مانده تا انقضای محصول خونی وجود خواهد داشت. تعداد باکتری‌ها در روزهای ابتدایی جمع‌آوری تهیه محصولات خونی بسیار پایین می‌باشد. از همین رو احتمال دستیابی به نتایج دقیق در روش‌های کشت که بر پایه نمونه‌گیری در روزهای ابتدایی تهیه محصول می‌باشد، بسیار پایین است. زیرا احتمال رشد میکروب در روزهای بعدی هم چنان وجود دارد. راه حل دیگری که جهت غلبه بر مشکلات ناشی از نمونه‌گیری در روزهای ابتدایـی تهیـه محصـولات خونـی وجود دارد، به کارگیری روش‌های بر پایه نمونه‌گیری در روزهای آخر(قبل از تزریق و یا قبل از انقضا) فرآورده‌های خونی می‌باشد. در این روش‌ها، میکروارگانیسم‌ها فرصت کافی برای رشد در محیط فرآورده‌های خون دارند و با استفاده از روش‌های مختلف سریع می‌توان وجود آلودگی باکتریایی را در محصول تشخیص داد(13، 9، 4). روش‌های سریع این قابلیت را دارند که می‌توانند نتایج را در مدت کوتاهی در اختیار قرار بدهند در نتیجه با استفاده از این قابلیت، می‌توان از این روش‌ها جهت بررسی آلودگی باکتریال قبل از تزریق فرآوردهpoint of care) ) اقدام کرد. در حال حاضر ایجاد آگاهی در زمینه شیوع آلودگی باکتریال در واحدهای پلاکت و عواقب ناشی از آن یکی از مهمترین نکاتی است که مراکز انتقال خون در سراسر دنیا مورد توجه قرار داده‌اند. سیستم نظارتی مراقبت از خون و فرآورده‌های خون می‌تواند نقشی مؤثر در طب انتقال خون داشته باشد و سلامت خون و فرآورده‌های خون را در تمام مراحل زنجیره انتقال خون کنترل نماید. این سیستم ضرورت قابل ردیابی بودن خون و فرآورده‌های خون را از اهداکننده تا دریافت کننده در مراکز درمانی و انتقال خون فراهم می‌آورد(35، 9). می‌توان گفت که با استفاده از تکنولوژی‌های هم‌زمان غربالگری و شناسایی آلودگی باکتریایی، روزی فرا خواهد رسید که بتوان بررسی آلودگی را در زمان تزریق و در کوتاه‌ترین زمان ممکن تشخیص داد(35، 8، 2).
نتیجه‌گیری نتایج به دست آمده، رشد چشمگیری در بهبود فرآورده پلاکت متراکم، از نظر میزان آلودگی باکتریایی نشان می‌دهد. با رعایت دستورالعمل‌های داخلی مربوط به فرآیند تهیه، جمع‌آوری و تولید فرآورده کنسانتره پلاکت و هم چنین رعایت اصول و استانداردهای GMP در تولید این محصول، میزان آلودگی به طور چشمگیری کاهش یافته است. با توجه به جداسازی نمونه مورد نظر در آخرین روز و هم چنین مرور اطلاعات رایانه‌ای اهداکننده و بررسی دقیق نتایج حاصل از معاینه پزشکی پیش از اهدای خون و عدم وجود هیچ نوع سابقه و علامتی مبنی بر وجود باکتریمی مخفی در اهداکننده، نتایج به دست آمده در این تحقیق می‌تواند بیان‌کننده احتمال آلودگی محیطی در طول فرآیند جمع‌آوری، تهیه و ذخیره‌سازی و مصرف پلاکت متراکم باشد. از همین رو کنترل شرایط استریلیتی و روش‌های ضد عفونی محیطی می‌تواند نقشی مهم در کاهش شیوع آلودگی باکتریایی در فرآورده‌های خون داشته باشد.گسترش اطلاعات به دست آمده می‌تواند نتایج و اطلاعات بیشتری را برای جلوگیری و کاهش عفونت‌های باکتریایی منتقله از خون در اختیار قرار بدهد.
تشکر و قدردانی این مقاله حاصل طرح مصوب مرکز تحقیقات انتقال خون، مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون می‌باشد که با همکاری بخش میکروب‌شناسی انستیتو پاستور ایران انجام شده است. بدین‌وسیله نویسندگان مقاله از همکاران محترم بخش‌های فرآورده و کنترل کیفی پایگاه انتقال خون تهران که با همکاری خود ما را در انجام این تحقیق یاری نمودند، تشکر و قدردانی می‌نمایند.
