چکیده سابقه و هدف در سال‌های اخیر، به اتوآنتیبادیهای طبیعی به عنوان فاکتورهای کلیدی در حفظ هموستاز بدن توجه ویژه‌ای شده است و هم چنین به عنوان نشانگرهای زیستی در بیماری‌های گوناگون مطرح شده‌اند. این پژوهش، برای نخستین بار، به منظور تعیین هویت اتوآنتیبادیهای طبیعی بر علیه گلبول قرمز به دنبال برخی تغییرات هماتوپاتولوژیک در بیماران، در مقایسه با اهداکنندگان خون سالم انجام شد. مواد و روش‌ها در این پژوهش بنیادی ـ کاربردی، دو گروه از نمونه‌ها شامل 600 اهداکننده خون سالم و 324 بیمار که اختلالات هماتوپاتولوژیک نشان دادند، جمع‌آوری شدند. تمام نمونه‌ها به لحاظ اتوآنتیبادیهای طبیعی غربالگری شدند اما تعیین هویت تنها در صورت واکنش مثبت انجام شد. نتایج با استفاده از آزمون دو جمله‌ای و با استفاده از نرم‌افزار 16 SPSS بررسی شدند. یافته‌ها اتوآنتیبادیهای طبیعی در 6/8% از جمعیت سالم و 9/17% از جمعیت بیمار شناسایی شد که به عنوان واکنش مثبت در نظر گرفته شد. تنها 2 مورد از میان 30 نفر گروه سالم دارای اتوآنتیبادی، به عنوان یک مورد آنتی A1 و یک مورد آنتی P1 شناسایی شدند اما در میان گروه بیمار دارای اتوآنتیبادی، 19 مورد آنتی IH ، 1 مورد آنتی H ، 2 مورد آنتی I ، 2 مورد آنتی P1 و 6 مورد به صورت غیر قاطع شناسایی شدند. نتیجه گیری تفاوت معناداری میان فراوانی واکنش اتوآنتیبادیهای طبیعی بر علیه گلبول قرمز مشاهده شد(03/0 p=). به علاوه آنتی IH در بیماری‌های خونی افزایش می‌یابد. کلمات کلیدی:بیماری‌های خونی، آنتی‌بادی‌ها، گلبول‌های قرمز
تاریخ دریافت: 24/1 /95 تاریخ پذیرش : 27/10/95
1- کارشناس ارشد ایمونولوژی ـ دانشکده پزشکی دانشگاه تربیت مدرس ـ تهران ـ ایران 2- مؤلف مسئول: PhD ایمونولوژی ـ استاد دانشکـده پزشکـی دانشگاه تربیت مدرس ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 111-14115 3- کارشناس ارشد ایمونوهماتولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه بیش از نیم قرن است که اتوآنتیبادیهای طبیعی در جوامع علمی شناخته شده‌اند اما برای سالیان متمادی مورد توجه قرار نگرفته بودند. اما اخیراً جوانب تازه‌ای از عملکرد آن‌ها مورد توجه قرار گرفته است؛ به طور نمونه آنتی‌بادی‌های طبیعی در حیواناتی که در محیط فاقد آنتی‌ژن رشد کرده‌اند، وجود داشته و هم چنین قابل جداسازی از خون بند ناف می‌باشد. بیشتر آن‌ها خود واکنشگر بوده و طی سال‌های اخیر روشن شده است که در حفظ هموستاز بدن مشارکت دارند(2، 1). آنتی‌بادی‌های طبیعی که به لحاظ واکنش با ساختارهای خودی از آن‌ها به نام اتوآنتیبادیهای طبیعی نیز یاد می‌شود، در غلظتی فیزیولوژیک در افراد سالم حضور دارند و توان واکنش با گستره بالایی از آنتی‌ژن‌های برونزاد و از سوی دیگر آنتی‌ژن‌های خودی را دارند(3). بیش از صد سال پیش، مچینکوف برای اولین بار پیشنهاد کرد که سیستم ایمنی صرفاً تنها یک مکانیسم حفاظتی در مقابل عوامل عفونی نیست بلکه یک مکانیسم مهم حفظ هموستاز در یک ارگانیسم است(4). امروزه صحت فرضیه او کاملاً روشن شده است که این آنتی‌بادی‌ها بازیگرهای اصلی سیستم ایمنی در کنترل هموستاز مولکولی آنتی‌ژن هستند(5). به طوری که روشن شده است، لنفوسیت‌های T نیز توسط شبکه‌ای از اتوآنتی‌بادی‌ها کنترل می‌شود(6). اتوآنتیبادیهای طبیعی به عنوان مولکول‌های تنظیمی فعال بیولوژیک عمل می‌کنند(7). اما در برخی موارد تولید اتوآنتی‌بادی‌ها از آستانه فیزیولوژیک فراتر رفته و به مقادیر غیر طبیعی(خیلی زیاد یا خیلی کم) می‌رسد که می‌تواند از چند هفته تا چندین ماه ادامه یابد. در صورت طولانی شدن می‌تواند بازتاب دهنده تغییرات پاتولوژیک اختصاصی و یا حتی دلیل اصلی برای بیماری باشد(8-5). به این فرضیه ایمـونولوژی هومونوکلـوس یـا ایمونوکلوس می‌گویند (10، 9). این ایده از نورولوژیکال هومونوکلوس منشا گرفته است (11). به اعتقاد کوهن، سیستم ایمنی نیز دارای هومونوکلوس ایمونولوژیک است اما محل استقرار آن به جای مغز در خون در حال حرکت محیطی است(12). این سیستم از هزاران اتوآنتیبادی طبیعی ساخته شده است و هر اتوآنتیبادی به نوعی آنتی‌ژن تمایل دارد. سطح سرمی هر نوع اتوآنتیبادی طبیعی برای هر آنتی‌ژن مشخص و در افراد متفاوت تقریباً یکسان است. در اکثر افراد سالم سطح تولید اغلب آنتی‌ژن‌های خودی نزدیک به هم می‌باشد. در واقع سیستم ایمنی بدن، مدل آنتی‌ژنی بدن را از این طریق در اختیار دارد(12، 9). همین موضوع امروزه باعث پر رنگ شدن اهمیت اتوآنتیبادیهای طبیعی در پزشکی شده است حتی اخیراً اتوآنتیبادیهای طبیعی بر ضد فسفوریل کولین به عنوان یک نشانگر خطر جدید در حمله قلبی معرفی شده است(14، 13). در این پژوهش به بررسی اتوآنتیبادیهای طبیعی علیه گلبول قرمز متعاقب تغییرات پاتولوژیک در خون پرداخته شد.
مواد و روش‌ها مطالعه از نوع بنیادی-کاربردی بود. جامعه آماری شامل 600 فرد سالم از میان اهداکنندگان سالم خون بودند که کلیه مراحل انتخاب اهداکننده و ارزیابی سلامت را بر اساس معیارهای انتقال خون گذرانده و از نظر آزمایش‌های هپاتیت B ، C و HIV منفی بودند. جامعه بیمار شامل 324 نفر از افراد مراجعه‌کننده به آزمایشگاه هماتولوژی سازمان انتقال خون بود. در این میان 131 نفر پلی‌سایتمی‌نسبی و 101 نفر مبتلا به آنمی، 47 نفر لکوسیتوز، 14 نفر ترومبوسیتوز، 21 نفر ترومبوسیتوپنی و 12 نفر پان‌سیتوپنی بودند. لازم به ذکر است به دلیل عدم وجود مطالعه‌های قبلی با حجم بالا در این زمینه و به دلیل ویژگی روش مورد مطالعه و نیز محدودیت جمع‌آوری نمونه‌های انسانی، نمونه‌ها در دو گروه تا دستیابی به 30 نمونه مثبت دارای حداقل واکنش 1+ از لحاظ اتوآنتیبادی طبیعی به صورت اتفاقی انتخاب شدند. از افراد مورد مطالعه حداقل 5 میلی‌لیتر پلاسمای خون در لوله حاویEDTA گرفته شد. در مورد تمام نمونه‌ها مجاورت پلاسمای نمونه با سوسپانسیون سلولی خودی به منظور جستجو و مشاهده اتوآنتیبادیهای موجود در پلاسما صورت گرفت. برای جستجوی آنتی‌بادی‌های سرد از نوع IgM بر علیه گلبول قرمز از حساس‌ترین روش در این زمینه یعنی هماگلوتیناسیون(روش استاندارد لوله‌ای) استفاده شد و با تغییراتی در آزمایش غربالگری آنتی‌بادی‌ها(antibody screening test ) به جستجوی آن‌ها پرداخته شد. به این منظور ابتدا پلاسما با Auto-RBC مجاور شد و نمونه‌ها به مدت 24-18 ساعت در یخچالبانک خون در دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. سپس نمونه‌ها از یخچال خارج و بلافاصله در دمای محیط و به مدت 30 ثانیه با دور g1000 سانتریفیوژ شدند و از نظر آگلوتیناسیون و یا لیز گلبول‌های قرمز بررسی شدند. نمونه‌ها به منظور تسریع آگلوتیناسیون با محلول LISS (Low Ionic Strength Salt Solution) مجاور و به مدت 5 دقیقه در بن ماری 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. نمونه‌ها بعد از گذشت مدت زمان مشخص از بن ماری خارج و سانتریفیوژ شدند. در مرحله نهایی، آزمون آنتی‌گلوبولین غیر مسقیم(IAT = Indirect Antihumanglobulin Test) انجام و به لحاظ منفی بودن آنتی‌بادی‌های گرم بررسی شدند. نمونه‌های مثبت از لحاظ اتوآنتیبادیهای طبیعی که دارای حداقل واکنش 1+ و فاقد هر گونه آنتی‌بادی گرم بودند جهت انجام پانل تعیین هویت انتخاب شدند. برای تعیین هویت اتوآنتیبادیهای طبیعی سرد با اختصاصیت آنتی‌ژن‌های سرد I ، IH ، H که شایع‌ترین آنتی‌ژن‌های شناخته شده‌اند که در سرما واکنش می‌دهند، از پانل تعیین هویت آنتی‌بادی‌های سرد استفاده شد. البته برای تشخیص آنتی P1 از پانل تعیین هویت مختص آنتی‌بادی‌های دارای ارزش بالینی نیز، استفاده شد. به منظور بررسی نمونه‌ها با پانل تعیین هویت آنتی‌بادی‌های سرد، پس از آن که گروه خونی نمونه‌ها مشخص و از انطباق گروه خونی جمعیت‌های مورد مطالعه برای توزیع جغرافیایی گروه‌های خونی اطمینان حاصل شد، با توجه به نوع گروه خونی، از گلبول‌های قرمز هم گروه و سازگار با آن گروه خونی و نیز نمونه خون بند ناف گروه O منفی تهیه شده از بخش بند ناف سازمان انتقال خون به منظور تشخیص آنتی‌بادی ضد آنتی‌ژن I و نیز حذف واکنش ناشی از آنتی‌ژن Rh و ABO استفاده شد. برای تفسیر نیز از الگوی استاندارد آزمایشگاه مـربوطه کـه بـر اسـاس بیـان و شیوع آنتی‌ژنی متنوع برای تعیین هویت آنتی‌بادی‌ها بر اساس شدت واکنش با فنوتیپ‌های مختلف ABO است، استفاده شد(16، 15). نتایج اطلاعات به دست آمده با استفاده از نرم‌افزار 16 SPSS و اکسل 2007 با استفاده از آزمون دو جمله‌ای با اطمینان 95% مورد بررسی قرار گرفتند. ارزش p کمتر از 05/0% معنادار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها گروه سالم: در جمعیت سالم، از میان 600 نفر، 52 نفر(6/8%) با سوسپانسیون سلولی خود واکنش مثبت(1+) نشان دادند و در مجموع 548 نفر(4/91%) هیچ واکنشی با سوسپانسیون سلولی خود نشان ندادند. از این تعداد 219 نفر(5/36%) دارای گروه خونی O ، 185 نفر(8/30%) گروه خونی A ، 144 نفر(24%) گروه خونی B و 52 نفر(6/8%) گروه خونی AB داشتند. 524 نفر(3/87%)Rh(D) مثبت و76 نفر (6/12%) Rh(D) منفی بودند. از میان 52 نفر، 30 نفر(5%) که دارای واکنش مثبت 1+ بودند، برای جستجوی نوع اتوآنتیبادی در آزمایش پانل استفاده شدند.
گروه بیمار: در گروه بیمار، 324 نفر بیمار مراجعه‌کننده به بخش هماتولوژی سازمان انتقال خون که شامل پلی‌سایتمی نسبی، آنمی، لکوسیتوز، ترومبوسیتوز، ترومبوسیتوپنی و پان سیتوپنی بودند، به طور اتفاقی انتخاب شدند. از میان 324 نفر، 58 نفر(9/17%) با سوسپانسیون سلولی خود واکنش مثبت(از ضعیف تا 4+) نشان دادند و در مجموع 266 نفر(09/82%) هیچ واکنشی با سوسپانسیون سلولی خود نشان ندادند. از این تعداد، 110نفر (9/33%) دارای گروه خونی O ، 92 نفر(3/28%) گروه خونی A ، 86 نفر (5/26%) گروه خونی B و 35 نفر(8/10%) گروه خونی AB داشتند. هم چنین 299 نفر(28/92%) Rh(D) مثبت و 25 نفر(71/7%) Rh(D) منفی داشتند. لازم به ذکر است که یک نفر از بیماران در گروه خونی Rh وABO دارای عدم انطباق بود. گروه‌های خونی، منطبق بر توزیع جغرافیایی گروه خونی در ایران بود. از بین 58 نفر، 30 نفر(3/9%) که
نمودار 1: تعیین هویت انجام شده در جمعیت سالم و بیمار از نظر فراوانی
دارای واکنش حداقل مثبت (1+) با سوسپانسیون سلولی خود بودند، برای جستجوی نوع اتوآنتیبادی در آزمایش پانل انتخاب شدند. بر اساس آزمون آماری انجام شده، نسبت مورد نظر در گروه بیمار(9/17%) به طور معناداری با گروه سالم(6/8%) تفاوت داشت(03/0 p=).
تعیین هویت اتو آنتی‌بادی‌های طبیعی در دو جمعیت سالم و بیمار: همان طور که گفته شد برای انجام پانل سرد از هر گروه، 30 نفر که در مرحله اتوآنتیبادیهای طبیعی دارای واکنش حداقل 1+ بودند، انتخاب شدند. از میان 30 نفر در جمعیت سالم، تمامی نمونه‌ها به جز دو مورد که واکنش 3+ مشاهده شد، واکنش مثبت ضعیف نشان دادند. نتایج با توجه به جدول تفسیر نتایج پانل سرد تفسیر شدند که به دلیل ضعیف بودن شدت واکنش‌ها در اکثر موارد مربوط به جمعیت سالم، امکان تعیین هویت قطعی وجود نداشت. فقط در دو مورد که دارای واکنش قوی‌تری بودند، این امکان فراهم بود. یک مورد آنتی A1 و دیگری آنتی P1 تشخیص داده شد، 28 مورد باقی‌مانده به صورت غیر قاطع گزارش شدند. طی انجام پانل سرد بر روی نمونه‌های بیمار، علاوه بر سلول‌های هم گروه، از خون بند ناف نیز برای ردیابی آنتیI استفاده شد. البته شایان ذکر است که به دلیل گروه خون حل نشده مربوط به ABO در یکی از بیماران، در واقع پانل سرد بر روی نمونه 29 نفر از بیماران انجام شد که در نتیجه تمام 29 نفر در پانل سرد واکنش مثبت از ضعیف تا 3+ نشان دادند. نتایج با توجه به جدول تفسیر نتایج پانل سرد، تفسیر شد و بر خلاف جمعیت سالم که به دلیل ضعیف بودن شدت واکنش‌ها در بیشتر موارد قادر به تعیین هویت اتوآنتیبادی نبودیم، توانستیم اکثر موارد را با الگوی پانل مربوطه به صورت 19 نفر دارای آنتی IH ، 1 نفر آنتی H ، 2 نفر آنتی I ، 2 نفر آنتی P و نهایتاً 6 نفر را که دارای واکنش نسبتاً ضعیف بودند به صورت غیر قاطع تعیین هویت کنیم(نمودار 1).
بحث در این مطالعه، گروهی از اهداکنندگان خون سالم و بیماران خونی پس از تعیین گروه خونی که منطبق بر توزیع جغرافیایی گروه‌های خونی در ایران بود، تحت غربالگری اتوآنتیبادیهای طبیعی قرار گرفتند(17). نتایج حاکی از آن بود، علاوه بر این که درصد فراوانی واکنش اتوآنتی‌بادی‌ها از سلامت تا بیماری تفاوت معناداری نشان می‌دهد بلکه اتوآنتیبادی ضد آنتی‌ژن IH گلبول قرمز نیز در این شرایط افزایش می‌یابد که اختصاصیت آن بر علیه بیان هم زمان آنتی‌ژن‌های I و Hمی‌باشد. اتوآنتیبادیهای سرد اغلب به لحاظ بالینی اهمیت خاصی ندارند و به ندرت منجر به واکنش همولیتیک می‌شوند و اهمیت بالینی آن‌ها معمولاً به سندروم آگلوتینین سرد محدود می‌شود اما از سویی دیگر بر اساس پژوهش‌ها، مشاهده شده است که در سایر بیماری‌ها که همراه با اختلالات خونی نیز بوده است، مواردی از افزایش آنتی‌بادی ضد آنتی‌ژن IH گزارش شده است که دارای اهمیت بالینی همراه با بروز واکنش همولیتیک نیز بوده است(19، 18). با توجه به این که تاکنون اغلب تحقیقات انجام شده در این حوزه به گزارش‌های موردی از آنتی‌ژن IHمربوط می‌شد، به منظور بررسی جامع‌تر سعی شد که گروه بیمار تا حد امکان، محدوده وسیعی از تغییرات از پلی‌سایتمی نسبی تا پان‌سیتوپنی را در بر بگیرد(21، 20). از طرفی دیگر باید در نظر داشت که عملکردی از اتوآنتیبادیهای طبیعی که در سال‌های اخیر، بیشتر مورد توجه واقع شده است، نقش آن‌ها در هموستاز سیستم ایمنی است. این نقش اتوآنتیبادیهای طبیعی در پیشگویی اختلالات ایمونولوژیک برای افرادی که تعادل بین سطح اتوآنتیبادیهای طبیعی و آنتی‌ژن‌های خودی ندارند بسیار مفید است(22). بر طبق نظریه ایمونوکلوس، سطح سرمی هر اتوآنتیبادی طبیعی مشخص و اختصاصی برای هر آنتی‌ژن، در افراد متفاوت تقریباً یکسان است(23). بنابراین در صورتی که تولید این اتوآنتی‌بادی‌ها از محدوده
فیزیولوژیک و طبیعی خارج شود و برای مدت طولانی باقی بماند، می‌تواند نشان‌دهنده تغییرات پاتولوژیک در بدن باشد(25، 24، 10). حتی بر این اساس اخیراً دانشمندان با استفاده از میکروچیپ، مستقر نمودن آنتی‌ژن‌های بافت‌های مختلف بدن و سپس افزودن سرم افراد و با استفاده از آنتی‌بادی ضد کلاس IgG و IgM و تشخیص میزان واکنش، کیت‌های تجاری پیشگویی‌کننده بیماری‌ها را ابداع و ارایه نمودند(26).ادامه این پژوهش و بررسی امکان استفاده از این آنتی‌بادی‌ها برای پیشگویی بیماری‌ها ضروری می‌باشد.
نتیجه‌گیری در این مطالعه نشان داده شد که درصد بروز خود واکنشگری اتوآنتیبادیهای طبیعی علیه گلبول قرمز به ویژه آنتی‌ژن IH تحت تاثیر اختلالات خونی(9/17%) نسبت به گروه سالم(6/8%) به طور معناداری افزایش می‌یابد.
تشکر و قدردانی این مقاله حاصل پایان‌نامه کارشناسی ارشد دانشگاه تربیت مدرس می‌باشد. بدین‌وسیله نویسندگان مقاله از آزمایشگاه ایمونوهماتولوژی مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران و بخش هماتولوژی سازمان انتقال خون به دلیل همکاری تشکر می‌نمایند.
Pourfathollah A, Mogadam M, Goudarzi S. Increase in Natural auto antibodies against RBCs inhematologic disorders. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2017; 14 (1) :1-7 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1033-fa.html
مساعد مریم، پورفتح‌اله علی‌اکبر، مقدم مصطفی، گودرزی سمیرا. افزایش اتوآنتیبادیهای طبیعی ضد گلبول قرمز در برخی اختلالات خونی. فصلنامه پژوهشی خون. 1396; 14 (1) :1-7
.jpg)
